文│蘇權(quán)* 顧舒舒 呂宗德 陳婷（江蘇省南京市畜牧獸醫(yī)站）

抗生素在防控動(dòng)物疫病、促進(jìn)生產(chǎn)方面具有巨大作用，但我國(guó)在2020年逐步禁止在蛋雞生產(chǎn)中使用抗生素。因此，尋找高效的替抗產(chǎn)品對(duì)促進(jìn)蛋雞養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)具有至關(guān)重要的作用。枯草芽孢桿菌具有提高營(yíng)養(yǎng)消化率，改善腸道健康，增強(qiáng)腸道屏障完整性，調(diào)節(jié)免疫功能等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有潛力的替抗產(chǎn)品。此外，基于孢子表面展示技術(shù)，使枯草芽孢桿菌在構(gòu)建新型蛋雞疫苗方面具有廣闊的應(yīng)用前景。筆者主要介紹現(xiàn)階段枯草芽孢桿菌在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用及基于表面展示技術(shù)的前景應(yīng)用。

一、枯草芽孢桿菌概述

1.枯草芽孢桿菌簡(jiǎn)介?？莶菅挎邨U菌是一種需氧、無(wú)莢膜、周生鞭毛的革蘭氏陽(yáng)性菌。該菌廣泛分布于植物周圍，在土壤、腐敗的有機(jī)物中大量存在，在極端逆境中會(huì)生成內(nèi)生芽孢，芽孢大小為0.6～0.9微米×1～1.5微米，形成的芽孢大體位于細(xì)菌的中心部位，芽孢形成后菌體大小沒(méi)有明顯變化。該菌菌落表面呈不透明的粗糙狀，顏色渾濁發(fā)白或偏黃色；接種在液體培養(yǎng)基里菌落呈皺襞樣?？莶菅挎邨U菌生長(zhǎng)速度快，對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求不高，且能高效利用蛋白質(zhì)和糖類；其分泌的枯草菌素、短桿菌肽、制霉菌素等沒(méi)有任何毒性，且在抑制病原菌方面具有重要作用，被認(rèn)為是最安全的有效替抗物之一。

在2007年，歐洲食品安全局通過(guò)評(píng)估認(rèn)定枯草芽孢桿菌對(duì)畜禽養(yǎng)殖安全有效，作為飼料添加劑使用可以提高營(yíng)養(yǎng)消化率、改善腸道健康、促進(jìn)動(dòng)物免疫細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及提升機(jī)體免疫水平。當(dāng)下，我國(guó)已禁止大部分促生長(zhǎng)抗生素的使用，作為有益菌，枯草芽孢桿菌在綠色替抗方面具有不可多得的潛力。

2.芽孢簡(jiǎn)介。芽孢是一種圓形或類圓形的休眠體，由4層結(jié)構(gòu)組成，從內(nèi)到外依次是核芯、皮層、芽孢殼和孢子外壁；芽孢殼由70多種蛋白組成，是芽孢強(qiáng)大抗逆性的關(guān)鍵。芽孢具有特殊結(jié)構(gòu)，使其芽孢外殼蛋白無(wú)需經(jīng)歷穿膜過(guò)程就能正確組裝到位，因其這一特性使得枯草芽孢桿菌在表面展示系統(tǒng)應(yīng)用上具有巨大的優(yōu)勢(shì)。

二、枯草芽孢桿菌在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑使用可以促進(jìn)蛋雞免疫球蛋白的分泌，并活化體內(nèi)免疫細(xì)胞，以此增強(qiáng)蛋雞免疫力；進(jìn)入腸道后能定植于腸道黏膜，使腸道形成低氧環(huán)境，促使厭氧菌的形成，提高胃腸消化能力；此外，該菌還能產(chǎn)生諸如脂肪酶、淀粉酶、有機(jī)酸等有益物質(zhì)促進(jìn)鈣和維生素的吸收，從而促進(jìn)蛋雞生長(zhǎng)。

在提高蛋品質(zhì)方面，2015年牛淑玲團(tuán)隊(duì)通過(guò)在海蘭褐商品蛋雞的基礎(chǔ)日糧中添加500毫克/千克的枯草芽孢桿菌制劑發(fā)現(xiàn)，飼喂添加劑的蛋雞生產(chǎn)性能得到顯著提升，與對(duì)照組相比，雞蛋重量提高2.62%，破蛋率降低11.69%，料蛋比也有顯著降低。同樣在2022年，賀軍團(tuán)隊(duì)在給海蘭褐飼喂不同量的枯草芽孢桿菌添加劑后發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組較對(duì)照組在蛋殼顏色、蛋黃相對(duì)重、蛋殼強(qiáng)度等指標(biāo)上有顯著提升，飼喂量為400毫克/千克時(shí)效果最好。

在調(diào)節(jié)腸道平衡方面，陳欣團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌組蛋雞回腸中過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性顯著升高，盲腸中的乙酸、正戊酸、異戊酸的含量，以及盲腸的總抗氧能力得到顯著提升。此外還發(fā)現(xiàn)，在蛋雞基礎(chǔ)日糧中添加1000毫克/千克的枯草芽孢桿菌后，該菌可以調(diào)節(jié)腸道平衡，防止蛋雞腹瀉；且長(zhǎng)期飼喂（超過(guò)28天）可以顯著降低了雞白痢的發(fā)生率。

在增強(qiáng)抗病能力方面，飼喂枯草芽孢桿菌的蛋雞腸道腸絨毛更高，隱窩深度更淺，空腸的絨毛高度與隱窩深度的比值也更高；在血清學(xué)指標(biāo)上，免疫球蛋白IgA和IgM濃度更高?？莶菅挎邨U菌還能促進(jìn)機(jī)體炎性因子I11β、I16、I18，增強(qiáng)蛋雞的先天免疫。此外，有研究表明，枯草芽孢桿菌作為佐劑同禽流感疫苗H9N2同時(shí)接種可以顯著增強(qiáng)蛋雞對(duì)該病毒的特異性抗體和T細(xì)胞免疫應(yīng)答。

三、枯草芽孢桿菌表面展示技術(shù)

1.表面展示技術(shù)。表面展示技術(shù)指通過(guò)基因編輯技術(shù)將外源目的蛋白整合進(jìn)噬菌體或細(xì)胞自身的結(jié)構(gòu)蛋白中，使目的蛋白能展示在噬菌體或細(xì)胞表面，并保持相對(duì)獨(dú)立的空間和具有生物活性的技術(shù)。最早的表面展示系統(tǒng)是通過(guò)噬菌體構(gòu)建的，史密斯團(tuán)隊(duì)在1958年將外源基因整合到絲狀噬菌體外殼蛋白M13基因上，并使得外源基因成功表達(dá)免疫原性，給構(gòu)建克隆抗原提供了一種新的思路。

此后，研究人員嘗試將目的基因重組到不同的細(xì)菌或細(xì)胞上，建立了酵母表面展示系統(tǒng)、細(xì)菌表面展示系統(tǒng)和孢子表面展示系統(tǒng)。其中孢子表面展示系統(tǒng)雖然發(fā)展最晚，但因枯草芽孢桿菌出色的穩(wěn)定性和環(huán)境友好性，使其表面展示系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、環(huán)境凈化、藥物生產(chǎn)及疫苗制造領(lǐng)域。

2.枯草芽孢桿菌表面展示系統(tǒng)。2001年，研究人員通過(guò)基因編輯手段將破傷風(fēng)毒素的459個(gè)氨基酸片段嵌入枯草芽孢桿菌的外殼蛋白CotB基因的C端，并順利在其孢子的表面表達(dá)出具有抗原性的目的片段，標(biāo)志著第一個(gè)枯草芽孢桿菌表面展示系統(tǒng)（BSSD）的建立，為構(gòu)建高效的抗原免疫模式提供了新的思路。

通常，我們將需要被插入目的基因的孢子外殼蛋白稱為錨定蛋白，而決定BSSD技術(shù)的成功關(guān)鍵就在于錨定蛋白，所以在選擇錨定蛋白上需要進(jìn)行以下評(píng)估：一是要確保表達(dá)的目的蛋白能在孢子表面形成獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域；二是需要結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，確保目的蛋白能穩(wěn)定表達(dá)在孢子表面；三是需要錨定蛋白具備相對(duì)獨(dú)立性，防止目的蛋白插入后影響孢子的生理功能；四是錨定蛋白還需要具備一定的抵抗周圍環(huán)境蛋白酶的能力。近年來(lái)，雖然報(bào)道了很多錨定蛋白成功展現(xiàn)目的蛋白的例子，但考慮到在孢子表面的分布情況，現(xiàn)階段應(yīng)用最多的還是CotB、CotC、CotG這3種錨定蛋白，其中CotB和CotC主要用于抗原的表達(dá)，而CotG主要應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)化中對(duì)相關(guān)酶的定位。

在確定錨定蛋白后，還需通過(guò)合理的重組策略將目的蛋白插入錨定蛋白中，使其在孢子表面正確表達(dá)。根據(jù)最新的研究表明，CotB、CotC和CotG蛋白通常將目的蛋白插入其N末端或C末端；而CotZ和CgeA蛋白只能將目的蛋白插入C末端；而CotG、CotZ、CotX和OxdD蛋白可以將目的蛋白插入其C末端。

3.枯草芽孢桿菌表面展示技術(shù)在疫苗生產(chǎn)方面的前景。在第一個(gè)以枯草芽孢桿菌CotB蛋白構(gòu)建的破傷風(fēng)毒素重組孢子出現(xiàn)后，其他研究人員也順利在孢子上展示了破傷風(fēng)毒素用作疫苗生產(chǎn)的外源蛋白，為枯草芽孢桿菌作為疫苗蛋白載體奠定了基礎(chǔ)；此外，因枯草芽孢桿菌形成的孢子對(duì)惡劣環(huán)境極具抗性，使其能順利地通過(guò)胃腸通道，到達(dá)指定位置，也為后續(xù)研究口服藥物或疫苗生產(chǎn)打開了新的思路。

在水產(chǎn)疫病防控方面，研究人員利用白斑綜合征病毒（WSSV）的VP28包膜蛋白構(gòu)建了枯草芽孢桿菌重組孢子，再將這些孢子飼喂給南美白對(duì)蝦后發(fā)現(xiàn)其超氧化物歧化酶和酚氧化酶的活性顯著增加；用WSSV對(duì)其進(jìn)行感染后發(fā)現(xiàn)，飼喂重組孢子的蝦死亡率大大降低。

在動(dòng)物疫病防控方面，研究人員在枯草芽孢桿菌的孢子上表達(dá)甘油醛-3-磷酸脫氫酶（HcGAPDH）后給綿羊口服后用于治療捻轉(zhuǎn)血矛線蟲，治療后糞便中每克蟲卵減少84.1%；血液和腸液監(jiān)測(cè)顯示，單核細(xì)胞顯著升高，血清中的特異性抗體IgG和腸黏液中特異性抗體slgA均顯著升高。此外，近期黃耀偉團(tuán)隊(duì)將貓冠狀病毒（FCoV）刺突蛋白上的七肽重復(fù)序區(qū)2（HR2）表達(dá)在枯草芽孢桿菌的孢子外殼蛋白上后，讓小鼠服用后能產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液免疫，并且能有效防止FCoV的感染。

在寄生蟲防控方面，將華支睪吸蟲的被膜蛋白重組進(jìn)孢子桿菌的CotC蛋白上以構(gòu)建重組孢子，在小鼠口服重組孢子兩周后，糞便中特異性的IgA顯著上升；給感染了華支睪吸蟲囊尾蚴的大鼠服用重組孢子后，可產(chǎn)生顯著的保護(hù)作用。類似的，研究人員還利用日本血吸蟲的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）構(gòu)建了重組孢子，在小鼠口服重組孢子后產(chǎn)生全身免疫反應(yīng)；給藥33天后，糞便中特異性IgA和血清中的IgG均顯著上升。

綜上所述，枯草芽孢桿菌表面展示系統(tǒng)在新型疫苗蛋白載體及疫苗制造領(lǐng)域具有巨大潛力。

四、展望

枯草芽孢桿菌因其具有抗逆性強(qiáng)、無(wú)污染、融合蛋白無(wú)需穿膜等特點(diǎn)，在疫苗研發(fā)領(lǐng)域取得了巨大的進(jìn)展，并應(yīng)用于尿毒素、尿素酶A、尿素酶B、白細(xì)胞介素2等疫苗的研發(fā)。但當(dāng)前還鮮見枯草芽孢桿菌表面展示技術(shù)在蛋雞上的應(yīng)用，原因主要有展示效率過(guò)低和針對(duì)蛋雞的研究不足。

當(dāng)前，諸如外殼蛋白CotB存在需要野生型CotB蛋白的輔助才能將重組的目的蛋白正確表達(dá)到孢子外殼上，其中涉及的蛋白互作機(jī)制尚未明確，導(dǎo)致展示系統(tǒng)效率低下。今后還需繼續(xù)探索適合充當(dāng)錨定蛋白的外殼蛋白，并針對(duì)特定錨定蛋白優(yōu)化重組策略、折疊方式和策略等，進(jìn)而提高展示效率。

而我國(guó)雞蛋消費(fèi)潛力巨大，蛋雞養(yǎng)殖量也逐年升高，但傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、傳染性法氏囊等疫病頻繁發(fā)生，表明該系統(tǒng)在蛋雞領(lǐng)域擁有巨大潛力。而黃耀偉團(tuán)隊(duì)利用冠狀病毒特有的HR2構(gòu)建的重組孢子能顯著提升對(duì)FCoV的抗性；雞傳染性支氣管炎（IBV）同樣為冠狀病毒，且能通過(guò)腸道感染，其HR2構(gòu)建的重組孢子是否能提升蛋雞對(duì)IBV的抵抗力還需進(jìn)行深入研究。

攻克這些問(wèn)題對(duì)開發(fā)新型靶向藥物、特異性的疫苗或作為替抗產(chǎn)品都有重要意義。