劉艷紅， 李 靜， 王 娜， 張 驥， 李 坤

（四川大學(xué)a.基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心；b.化學(xué)學(xué)院，成都 610064）

0 引 言

癌癥是惡性腫瘤細(xì)胞快速增殖導(dǎo)致的一種系統(tǒng)性疾病。傳統(tǒng)的癌癥治療方法主要有手術(shù)治療、化療和放射治療。但由于手術(shù)治療難以精準(zhǔn)地切除所有癌細(xì)胞，而化療和放射治療存在毒副作用強(qiáng)、腫瘤細(xì)胞容易出現(xiàn)耐藥性等不足，導(dǎo)致癌癥的治療和術(shù)后效果不佳［1］。近年來，核酸類藥物的出現(xiàn)為癌癥的治療帶來了新的希望［2］。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是由雙鏈RNA（dsRNA）分子在細(xì)胞中高效特異性結(jié)合同源mRNA，從而引起靶基因降解現(xiàn)象。目前發(fā)現(xiàn)具有誘導(dǎo)RNA沉默功能的核酸分子有3 類，即內(nèi)源性微小miRNA（microRNA，miRNA）、小干擾RNA（Small interefering RNA，siRNA）和發(fā)夾RNA（shRNA）。其中，siRNA 是人工合成的長度為21 ～25 bp 的雙鏈RNA分子（導(dǎo)鏈和隨從鏈），經(jīng)運(yùn)載體傳輸進(jìn)入細(xì)胞后，被DICER酶處理，隨從鏈被降解，導(dǎo)鏈組裝到RNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）中，與信使RNA（mRNA）的特定基因序列進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)形成新的雙鏈。隨后，RISC 中Argonaute 2 蛋白對(duì)雙鏈進(jìn)行切割，導(dǎo)致靶基因被降解，最終達(dá)到基因表達(dá)沉默的目的［3-6］。由于siRNA對(duì)靶基因降解的特異性、高效性和安全性，使得siRNA成為惡性腫瘤、遺傳性疾病、神經(jīng)類疾病和病毒感染等領(lǐng)域研究最為活躍的核酸類藥物之一［7-8］。2018 年，全球首個(gè)siRNA 類藥物Onpattro 上市，到2022 年，siRNA類藥物已增加至5 個(gè)［9］。siRNA藥物的快速發(fā)展進(jìn)一步推動(dòng)了精準(zhǔn)化、個(gè)性化基因治療在臨床應(yīng)用。

由BIRC5 基因編碼的Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族中最小的成員，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效的凋亡抑制蛋白。Survivin蛋白通過抑制半胱天冬酶的活性，發(fā)揮抗凋亡作用。動(dòng)物組織分布研究顯示，Survivin具有高度的腫瘤組織表達(dá)和分布特異性，在幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中有表達(dá)，而在正常終末分化組織中幾乎不表達(dá)，為此，在癌癥篩查檢測研究中，Survivin常被作為惡性腫瘤早期病變的標(biāo)志物。Survivin 在癌細(xì)胞中的高表達(dá)可以降低癌細(xì)胞對(duì)化療藥物和放射治療的敏感性，抑制癌細(xì)胞的凋亡［10-11］。另外，Survivin 表達(dá)的上調(diào)與腫瘤復(fù)發(fā)和不良預(yù)后密切相關(guān)［12］。Norouzi 等［13］研究顯示，降低Survivin基因表達(dá)，有效提高了4T-1 細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物阿霉素的敏感性，抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。

現(xiàn)以BIRC5 基因?yàn)榘悬c(diǎn)，通過傳輸特異性siRNA，有效敲低了Survivin蛋白的表達(dá)，探討Survivin蛋白水平下調(diào)對(duì)Hela 細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)將siRNA 分子的遞送、基因表達(dá)水平檢測、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測等實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)性設(shè)計(jì)，完整展現(xiàn)了基因干擾實(shí)驗(yàn)研究的全過程，對(duì)于學(xué)生基礎(chǔ)科學(xué)思維的訓(xùn)練和實(shí)踐探究能力的培養(yǎng)具有重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

聚乙烯亞胺（PEI，25KD）美國Sigma-Aldrich 公司；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、OPTI-MEM 培養(yǎng)基、Hoechst 33342、胎牛血清、SYBR Green 預(yù)混液、瓊脂糖和BCA蛋白檢測試劑盒，美國賽默飛世爾科技公司；Survivin siRNA （siSur）序列（正義鏈：5′-AGTCTGGCGTAAGATGATGGATTTG-3′；反義鏈5′-CACAGCAGTGTTTGAAATGACAGG-3′）， GAPDH siRNA 序列（siGAPDH），EGFP siRNA（siEGFP），Negtive siRNA，Survivin和GAPDH qPCR 引物，廣州銳博生物科技有限公司；Gelred、肝素鈉GreenNucTM活細(xì)胞Caspase-3 活性檢測試劑盒和Caspase-3 活性檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Tris-base、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉（SDS）、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

TS-100 型倒置顯微鏡，日本尼康公司；流式細(xì)胞儀，美國BD 公司；熒光定量PCR 儀和二氧化碳培養(yǎng)箱，美國賽默飛世爾科技公司；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；多功能分子熒光成像系統(tǒng)，美國Azure Biosystems 公司；多功能酶標(biāo)儀，瑞士帝肯公司等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

PEI與siRNA按照不同的質(zhì)量比1、3、5、10 和20分別進(jìn)行復(fù)合，其中，siRNA的用量為0.142 8 μg。二者在室溫孵育20 min 后，加入上樣緩沖液混合均勻，點(diǎn)樣至2 %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并通過凝膠成像系統(tǒng)成像。

2.2 血清穩(wěn)定性檢測

PEI與siRNA按照質(zhì)量比7.5 進(jìn)行復(fù)合，復(fù)合過程見2.1。然后，在體系中加入50 %的血清（v／v），37 ℃分別孵育0、0.5、1、3、6 和24 h后，每管加入終濃度為2.5 mg／mL的肝素鈉，37 ℃放置1 h 后，加入上樣緩沖液，采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

2.3 PEI介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

Hela細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，按照1 ×105個(gè)／孔的細(xì)胞數(shù)量接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、Negtive 陰性對(duì)照組、siRNA 對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染組中，PEI／ siRNA 復(fù)合物的制備方法：①取一定體積的PEI用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至50 μL；②用Opti-MEM培養(yǎng)基將siRNA 稀釋至50 μL；③將稀釋后的siRNA滴加至稀釋好的PEI溶液中，輕輕混勻，室溫下繼續(xù)復(fù)合20 min。然后，將細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，每孔400 μL。吸取PEI／siRNA復(fù)合物滴加至孔中，前后推板混合均勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，再將板內(nèi)的培養(yǎng)基更換新鮮的完全培養(yǎng)基（500 μL／孔），繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 蛋白和基因表達(dá)水平的檢測

PEI介導(dǎo)siEGFP 轉(zhuǎn)染48 h后，通過倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（EGFP）的表達(dá)。同時(shí)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測有血清和無血清條件下，Hela／EGFP 細(xì)胞株中EGFP 蛋白的表達(dá)情況。PEI／siSur 轉(zhuǎn)染48 h后，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測Survivin 基因水平的表達(dá)情況。Survivin qPCR 的引物為正義鏈：5′-AGTCTGG CGTAAGATGATGGATTTG-3′；反義鏈：5′-CACAGCAGTGTTTGAAATGACAGG-3′。PCR 的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。GAPDH 作為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因Survivin在mRNA水平的相對(duì)表達(dá)。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

Hela細(xì)胞經(jīng)PEI／siSur 轉(zhuǎn)染48 h 后，用胰酶消化細(xì)胞，然后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL 的EP 管中，離心（1 000 r／min×5 min），棄上清。在收集到的細(xì)胞中加入預(yù)冷的70 %乙醇，每管1 mL，4 ℃固定24 h，1 000 r／min離心5 min，棄上清。用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2次后，每管加入500 μL PI染色液（含50 μg／mL PI、50 μg／mL RNase A 和0.2% Triton X-100 的PBS緩沖液）室溫染色30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.6 Caspase-3 活性檢測

2.6.1 原位染色檢測Caspase-3 活性

PEI／siSur 轉(zhuǎn)染48 h 后，吸去孔中培養(yǎng)基，加入PBS緩沖液，每孔500 μL。在不同處理組中分別加入5 μM Caspase-3 酶熒光底物，37 ℃孵育30 min 后，在倒置熒光顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取3 ～6 個(gè)視野成像。熒光底物的最大激發(fā)和發(fā)射波長為500／530 nm。

2.6.2 熒光法測定Caspase-3 活性

細(xì)胞消化后離心收集，在每200 萬個(gè)細(xì)胞中加入100 μL細(xì)胞裂解液后，置于冰上裂解15 min，4 ℃離心（20 000 g ×10 min），吸取上清并測定蛋白濃度。然后，參照Caspase-3 活性檢測試劑盒說明書，將底物pNA進(jìn)行稀釋，測定405 nm處的吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照Caspase-3 活性檢測方法分別加入檢測緩沖液、待測樣品和底物Ac-DEVD-pNA，37 ℃反應(yīng)3 h后測定405 nm處的吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品中pNA的含量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 PEI／siRNA復(fù)合物的穩(wěn)定性

由于siRNA是一種表面帶有較強(qiáng)負(fù)電荷的柔性生物大分子，很難通過擴(kuò)散的方式進(jìn)入細(xì)胞。另外，siRNA的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易被環(huán)境或血漿中的核酸酶降解。而高效、安全的運(yùn)載體可以有效維持siRNA 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并將其傳輸?shù)郊?xì)胞中［14］。PEI 是具有高效基因轉(zhuǎn)染性能的陽離子聚合物，通過靜電相互作用的方式快速結(jié)合并壓縮核酸分子，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，保護(hù)核酸分子免受核酸酶的降解［15］。實(shí)驗(yàn)通過凝膠阻滯電泳分析了PEI與siRNA 復(fù)合的質(zhì)量比，結(jié)果顯示，當(dāng)PEI／siRNA復(fù)合的質(zhì)量比為1 時(shí)，可以清晰地觀察到siRNA的條帶，當(dāng)二者的質(zhì)量比為3 時(shí)，siRNA分子在凝膠電泳上的遷移完全被阻滯［見圖1（a）］，表明siRNA分子與PEI形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。圖1（b）進(jìn)一步探討了血清對(duì)siRNA分子穩(wěn)定性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示裸siRNA分子與血清孵育0.5 h 后，條帶的亮度明顯降低，孵育3 h 后，條帶消失，表明siRNA 分子被血清中的核酸酶降解。而PEI／siRNA 復(fù)合物與血清共孵育24 h后，依然可以清晰地觀察到核酸條帶。該結(jié)果表明PEI與siRNA復(fù)合后，有效阻斷了核酸酶對(duì)siRNA的降解，延長了siRNA在血清中穩(wěn)定的時(shí)間。

3.2 EGFP表達(dá)水平檢測

PEI與siRNA的復(fù)合質(zhì)量比可以影響siRNA傳輸?shù)男?，降低靶基因沉默的效果。?shí)驗(yàn)通過敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Hela／EGFP 中報(bào)告基因EGFP 的表達(dá)，考察了PEI與siRNA不同復(fù)合質(zhì)量比對(duì)基因沉默的影響。其中Hela／EGFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照組。結(jié)果顯示，在空白對(duì)照組和siEGFP 組中可以觀察到大量的綠色熒光點(diǎn)，該綠色熒光點(diǎn)即為表達(dá)EGFP 的陽性細(xì)胞。而PEI／siEGFP按不同質(zhì)量比復(fù)合的轉(zhuǎn)染組中，綠色熒光蛋白的表達(dá)量明顯降低，其中，當(dāng)PEI 與siEGFP 的復(fù)合質(zhì)量比為5 時(shí)，綠色熒光信號(hào)顯著減弱，當(dāng)復(fù)合質(zhì)量比為7.5 時(shí)，視野中觀察到微弱的熒光信號(hào)，EGFP熒光蛋白幾乎不表達(dá)（見圖2），這是由于PEI 介導(dǎo)的siEGFP傳輸有效干擾了靶基因EGFP 的翻譯過程，敲低了EGFP蛋白的表達(dá)。該結(jié)果表明PEI復(fù)合siEGFP沉默基因表達(dá)的最佳復(fù)合質(zhì)量比為7.5。

圖2 EGFP表達(dá)的熒光成像圖

3.3 血清對(duì)siRNA基因傳輸?shù)挠绊?/h3>

實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了有血清和無血清條件下，PEI／siEGFP 對(duì)靶基因的沉默效率，進(jìn)一步考察了血清對(duì)siRNA傳輸?shù)挠绊?。結(jié)果如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，在無血清轉(zhuǎn)染條件下，EGFP 蛋白的表達(dá)量下調(diào)了55.6%，而有血清轉(zhuǎn)染條件下，EGFP蛋白的表達(dá)量僅下降了38.4%，該結(jié)果表明有血清條件下，PEI／siRNA的轉(zhuǎn)染效率明顯降低。這是由于血清中大量存在的血清蛋白與PEI／siEGFP 結(jié)合，導(dǎo)致PEI／siEGFP復(fù)合物不穩(wěn)定，降低了siRNA的傳輸效率［16］。

3.4 Survivin基因水平檢測

PEI／siSur轉(zhuǎn)染Hela 細(xì)胞后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測Survivin基因水平表達(dá)的情況。結(jié)果如圖4 所示，PEI 介導(dǎo)的SiSur 基因轉(zhuǎn)染組中，Survivin基因的表達(dá)水平僅為空白對(duì)照組的42% （P＜0.001）。表明PEI／siSur 的高效遞送有效降低了Survivin基因mRNA水平的表達(dá)。

圖4 qPCR檢測Survivin基因的表達(dá)

3.5 細(xì)胞周期檢測

Survivin在腫瘤組織中特異性分布和高表達(dá)抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡，研究顯示，在細(xì)胞有絲分裂過程中，Survivin可以與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的關(guān)鍵性激酶CDK1相互作用，穩(wěn)定有絲分裂期的細(xì)胞，抑制細(xì)胞死亡［17］。實(shí)驗(yàn)通過分析腫瘤細(xì)胞的周期變化，探討敲低Survivin蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，PEI／siSur 基因轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞周期發(fā)生了明顯的變化，其中G0／G1 期的細(xì)胞比例顯著減少，而G2／M期的細(xì)胞比例顯著增加，且出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡峰。該結(jié)果表明沉默Survivin 基因，下調(diào)Survivin蛋白表達(dá)后，Hela 細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G2／M期，細(xì)胞的凋亡率明顯增加。

圖5 Survivin基因沉默對(duì)細(xì)胞周期的影響

3.6 Caspase-3 活性檢測

Caspase-3 是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵性激酶。當(dāng)細(xì)胞凋亡通路被激活時(shí)，Procaspase-3 被剪切形成有活性的Caspase-3 激酶?；罨腃aspase-3 激酶剪切反應(yīng)底物，去除與熒光染料耦鏈的DEVD 多肽，使熒光染料與細(xì)胞DNA結(jié)合，從而檢測到綠色熒光。實(shí)驗(yàn)通過原位熒光染色探討了降低Survivin 蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的影響。結(jié)果見圖6（a），與空白對(duì)照組相比，PEI介導(dǎo)SiSur基因轉(zhuǎn)染組中檢測到明顯的綠色熒光，表明Survivin蛋白表達(dá)下調(diào)后，Caspase-3 激酶被激活。熒光檢測結(jié)果同樣顯示siSur 基因轉(zhuǎn)染組中，Caspase-3 激酶的活性顯著高于空白組和陰性對(duì)照組［見圖6（b）］，提示敲低Hela 細(xì)胞中Survivin 蛋白的表達(dá)后，Procaspase-3 剪切形成有活性的Caspase-3 激酶，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路被激活。

圖6 Caspase-3的活性檢測

4 結(jié) 語

基于患者基因修正的精準(zhǔn)治療是未來惡性腫瘤和先天性疾病治療重要策略，而核酸類藥物的持續(xù)性研究為個(gè)性化基因治療提供了更多可選擇的靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)通過基因干擾方法敲低了宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)的Survivin基因，結(jié)果表明下調(diào)Survivin 表達(dá)后，Hela 細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生了明顯變化，G0／G1 期細(xì)胞比例減少，G2／M期細(xì)胞比例顯著增加，且出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡峰，同時(shí)，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的關(guān)鍵性激酶Caspase-3活化，細(xì)胞凋亡通路被激活。該研究表明Survivin 基因的高表達(dá)在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，敲低Survivin 表達(dá)促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的凋亡。Survivin基因有望成為未來宮頸癌治療重要靶點(diǎn)。