文柏清， 張 倪， 康亞妮

（上海交通大學生物醫(yī)學工程學院，上海 200240）

0 引 言

卡米洛·高爾基（Camillo Golgi）于1873 年發(fā)現(xiàn)，利用鉻酸銀溶液浸泡大腦切片，可以使小部分神經元全部染色，即高爾基染色（Golgi staining）［1］。高爾基方法的主要優(yōu)點之一是神經染色具有隨機性的，因為它只染色任何一個選定區(qū)域大約1% ～10%的神經元。這種隨機染色使得單個神經元幾乎所有結構可視化，包括體細胞、軸突、樹突和樹突棘。隨后，多種研究對該方法進行了改良，如由Cajal提出的快速高爾基染色法（Rapid Golgi method）、高爾基-柯普奇法（Golgi-Kopsch）和高爾基-考克斯（Golgi-Cox）。

Golgi-Cox法以氯化汞取代硝酸銀進行神經標記，并通過鉻酸鉀緩和溶液的過度酸性反應。該方法優(yōu)于快速高爾基染色法，標記的神經元更多，且重復實驗結果更加穩(wěn)定，被廣泛用于觀察神經元和神經膠質細胞的形態(tài)，但其性質不確定、一致性差、染色時間長等因素阻礙了其作為首選方法應用［2］。FD Rapid Golgi StainTMKit是基于Golgi-Cox方法研發(fā)的，其以試劑盒的形式為分析神經元形態(tài)提供了一種簡單、可靠、可重復性好的神經浸漬方法，且目前已廣泛用于神經研究［3］。

目前基于Golgi-Cox染色原理，已有多種改良創(chuàng)新方法被提出，其中，F(xiàn)D Rapid GolgiStain Kit 的開發(fā)，使神經形態(tài)的觀察研究更加簡便［4-6］。李方等［7］通過多聚甲醛固定組織、縮短浸膠時間、組織塊外包石蠟殼等實驗調整，發(fā)現(xiàn)改良Golgi-Cox神經元染色法在大鼠腦缺血研究中，染色結果較恒定，且省時。馮寶峰等［8］對固定、切片、脫水和顯色等環(huán)節(jié)進行改良后，證明相較于傳統(tǒng)的Golgi-Cox染色方法，該方法更加穩(wěn)定和敏感，為海馬區(qū)神經元樹突和樹突棘形態(tài)與結構研究提供了一種可靠的技術方法。王蕾等［9］比較了冷凍切片、石蠟切片和振動切片3 種切片方式對結果的影響，并闡述了各自的優(yōu)缺點。

本研究采用4 種不同的灌注方法后使用相同的固定、染色和顯色液，結合流程化的商用實驗步驟，進行振動切片脫水后，再使用明膠包埋的載玻片封片，最后使用光學顯微鏡成像比較不同灌注方法的腦切片制備效果。探索一種簡單有效的神經標記方法，為實驗科研、教學及神經研究提供可選方案。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

（1）動物。6-8 周齡C57／BL小鼠4 只，分別編號為1＃、2＃、3＃、4＃。

（2）試劑。實驗所使用的試劑如表1 所示。

表1 實驗所需試劑

1.2 實驗方法

（1）準備。實驗前24 h將A＼B液按1∶1混合，在混合時盡量避免搖晃與碰撞，且避光保存，使用錫紙包覆試管外壁。

（2）灌注。①1＃小鼠斷頸后，不做灌注處理；②2＃、3＃、4＃小鼠均先使用1.5 ml 10%水合氯醛麻醉，然后使用生理鹽水灌流去血；③3＃小鼠使用4%多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）灌注固定；④4＃小鼠用AB混合液灌注。

（3）取材。打開小鼠的頭骨，小心取出腦組織。

（4）固定。使用提前配制的AB混合液浸泡24 h后，置換試管中的AB混合液，繼續(xù)浸泡13 d。然后將腦組織轉移至C液中室溫避光72 h，首次浸泡24 h后更換C液1 次。具體參見FD Rapid Golgi StainTMKit protocol［6］。

（5）切片和貼片。將腦組織用3%的瓊脂糖包埋后進行振動切片，切片厚100 和200 μm。載玻片提前用鉀礬明膠包被液進行涂布，干燥后，將切好的腦片貼于明膠玻片上，用吸水紙吸干多余的C液。

（6）染色。將D液、E 液與雙蒸餾水以1∶1∶2的體積比混合，現(xiàn)配現(xiàn)用，然后于混合溶液中10 min；再用雙蒸餾水沖洗切片2 次，每次4 min。

（7）脫水脫脂。使用50%、75%和95%的乙醇梯度脫水，各4 min，再使用無水乙醇脫水4 次，每次4 min；二甲苯浸泡3 次，每次4 min。

（8）封片。使用中性樹脂封片。

（9）成像。使用光學顯微鏡進行觀察。

2 實驗結果與分析

2.1 切片性能

圖1 所示為Golgi-Cox 方法的實驗流程。通過觀察4 種不同灌注方式處理后的小鼠腦組織切片，對比分析了其在光學顯微鏡下的神經標記情況，如圖2、3所示。實驗中，發(fā)現(xiàn)進行振動切片時，盡管都經過AB混合液固定，但3＃切片更穩(wěn)定，切片更完整。4＃效果最差，無法獲得完整切片，將一張100 μm 的切片進行染色后發(fā)現(xiàn)，組織破碎嚴重，幾乎全是非特異性黑色沉積物［圖2（j）］。結果表明PFA 灌注更有利于切片的完整性。

圖1 Golgi-Cox方法實驗流程

圖2 100 μm厚小鼠腦片的神經標記結果 （1＃：斷頸，無灌注；2＃：麻醉，生理鹽水灌注；3＃：麻醉，生理鹽水、PFA 灌注；4＃：麻醉，生理鹽水、AB混合液灌）

2.2 光學顯微成像結果及分析

2.2.1 1＃制備方法

依據(jù)FD Rapid Golgi StainTMKit說明書指示，無需進行去血灌注操作，取出腦組織后直接浸泡于AB 混合液中。1＃結果表明其切片背景呈黑灰色，神經元數(shù)量隨著切片厚度增加而增多［見圖2（a）、圖3（a）］。海馬區(qū)呈帶狀排列的神經細胞染色不清晰，無法有效地區(qū)分出單個神經元的胞體及樹突［見圖2（b）、圖3（b）］。大腦皮層區(qū)域神經細胞的胞體、樹突染色標記模糊，樹突相互交錯似網狀［見圖2（c）、圖3（c）］。

圖3 200 μm厚小鼠腦片的神經標記結果 （1＃：斷頸，無灌注：2＃：麻醉，生理鹽水灌注；3＃：麻醉，生理鹽水、PFA灌注）

2.2.2 2＃制備方法

在1＃的基礎上，增加了灌流去血的步驟，結果表明，背景依然呈灰黑色［見圖2（d）、圖3（d）］。因為切片位置的差異，本文展示了不包含海馬區(qū)域的切片，其內部核團區(qū)域的顆粒細胞明顯標記［見圖2（e）、圖3（e）］。大腦皮層相較于1＃標記清晰，但依然存在與背景無法明顯區(qū)分的問題［見圖2（f）、圖3（f）］。

2.2.3 3＃制備方法

3＃通過PFA 灌注，在腦組織離體前進行固定，取出腦后再在AB 混合液中浸漬，可見背景干凈呈灰白色，于黑色標記的神經元呈明顯反差［見圖2（g）、圖3（g）］。海馬區(qū)域的神經元呈規(guī)則排列，大腦皮層的神經元胞體及樹突也被清晰標記上［見圖2（h）～圖2（i）、圖3（h）～圖3（i）］。

2.2.4 腦組織結構分析及意義

按照圖1 的實驗流程，經過普通光學顯微鏡成像后，觀察到如圖2、3 中的海馬和大腦皮層結構。海馬在學習記憶功能中扮演著重要的角色，且結構相對較簡單，適合作為腦模型的重點觀察研究部位。此外，研究發(fā)現(xiàn)海馬的結構功能完整性對癲癇、阿茲海默癥等相關精神疾病也尤為重要［10］。海馬結構是由海馬齒狀回和下托三部分構成，該區(qū)域細胞緊密排列，界限明顯，細胞排列呈帶狀［見圖2（g）］［11］。當海馬在更高倍數(shù)下成像后，可以觀察到海馬的主要神經元是錐體細胞，齒狀回則是顆粒細胞。海馬的皮質可分為CA1、CA2、CA3和CA4四部分，可分為分子層（stratum moleculare）、腔隙層（stratum lacunosum）、輻射層（stratum radiatum）、錐體層（stratum pyramidale）和始層（stratum oriens）。齒狀回皮質分為分子層、顆粒細胞層和多形細胞層3 層，呈馬蹄鐵形。

大腦皮層是人腦的高級中樞，思考、感知、處理、理解語言信息等過程都與大腦皮層密切相關，其主要的功能分區(qū)有感覺區(qū)、運動區(qū)、言語區(qū)、聯(lián)合區(qū)。大腦皮層主要有三大細胞類型：錐體細胞、顆粒細胞和梭形細胞，其中顆粒細胞最多，錐體細胞次之。如圖2（i）所示，大腦皮層由淺至深又可以分為6 層：分子層（神經元小而少）、外顆粒層（包含星形細胞和少量錐體細胞）、外錐體細胞層、內顆粒層（主要是星形細胞）、內錐體細胞層、多形細胞層（以梭形細胞為主）［12］。

2.2.5 樹突棘結構的觀察

將100 μm的腦片切換到40 倍物鏡下進行更高分辨的觀察，可見圖4 中的紅色箭頭所指示的突起狀結構-樹突棘，其密度和形態(tài)表明了參與神經可塑性的細胞過程，這與學習和記憶等認知功能相關，并且在一些神經病變中是表現(xiàn)有癥狀的，如智力遲鈍和神經退行性疾病。值得注意的是，通過本研究所建立的實驗方法，在高倍鏡下成功觀察到樹突棘，后期可結合高分辨的成像技術及有效的數(shù)據(jù)分析，在不同的動物模型或疾病模型中對樹突棘進行結構和數(shù)量的差異分析。樹突棘是由許多類型的神經元的樹突突起產生的，主要由一個稍細的與樹突小分支相連的棘柄和一個與棘柄末端相連的終球組成。根據(jù)棘柄和終球的形態(tài)特征可分為三類：纖細型、蘑菇型和短粗型［13］。樹突棘密度和大小在不同個體間也是不相同的，一個神經元上也可能出現(xiàn)幾種不同類型的棘突。Nishiyama 等［14］研究發(fā)現(xiàn)樹突棘的結構變化是突觸可塑性的關鍵，表明樹突棘的形態(tài)和可塑性在神經發(fā)育障礙中會發(fā)生改變。Weir等［15］也報告了自閉癥病例中樹突棘密度增加。

圖4 100 μm厚小鼠神經元樹突棘的標記結果 （紅色箭頭指示的結構為樹突棘）

3 結 語

本文主要開展了基于4 種小鼠腦組織樣品制備方法，探索一種簡單有效的神經標記方法的實驗研究。通過觀察4 種腦切片在光學顯微鏡下的制備效果，一方面發(fā)現(xiàn)通過在小鼠麻醉后使用PFA灌流，再取腦組織進行AB混合液浸漬所制備的切片背景干凈，神經元呈明顯反差，海馬和大腦皮層神經結構被標記清晰；同時還對切片進行了高倍成像，證明該樣品制備方法也能為樹突棘結構的研究提供參考。然而，對于海馬及大腦皮層的細胞類型和樹突棘的類型，需要進一步進行更高分辨率的成像。

綜上，本文基于該商業(yè)化的試劑盒，結合前期有效的生物樣品處理方式及后期脫水、包埋等實驗步驟，探索了一套簡便，快捷的神經標記方法，為教學、實驗科研及神經研究提供可選方案，使神經研究在基礎設施有限的實驗環(huán)境和實驗教學中也能高效進行。