張朝輝 陳應(yīng)莊 郭賓 陳波* 馬銘*

1（湖南師范大學(xué)， 植化單體開發(fā)與利用湖南省重點實驗室， 化學(xué)生物學(xué)及中藥分析教育部重點實驗室， 長沙 410081）2（湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 長沙 410127）

馬兜鈴酸（AAs）是廣泛存在于馬兜鈴科植物中的硝基菲類化合物，最常見的是馬兜鈴酸Ⅰ（AA-Ⅰ）和馬兜鈴酸Ⅱ（AA-Ⅱ），結(jié)構(gòu)式見圖1[1-2]。因該類物質(zhì)具有抗腫瘤活性、抗炎和利尿等作用，含AAs 的中藥在醫(yī)藥領(lǐng)域曾長期被廣泛應(yīng)用。近年來，AAs 類物質(zhì)被證實具有腎毒性、致癌和致基因突變作用[3-5]，被認(rèn)為是導(dǎo)致馬兜鈴酸腎病、巴爾干地方性腎病和慢性腎病的主要原因之一[6-9]，由于AAs 具有不可逆轉(zhuǎn)的腎臟毒性，被國際癌癥研究機構(gòu)列為Ⅰ級致癌物[10]。AA-Ⅰ是AAs 最具代表性的成分，毒性最強，并且?guī)缀醮嬖谟谒旭R兜鈴科藥材中，因此，美國、英國、德國和澳大利亞等國家已明確禁止銷售含AAs 的草藥。

圖1 馬兜鈴酸Ⅰ（AA-Ⅰ）和馬兜鈴酸Ⅱ（AA-Ⅱ）的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of aristolochic acid Ⅰ(AA-Ⅰ) and aristolochic acid Ⅱ(AA-Ⅱ)

2007 年，Grollman 等[11]指出，長期接觸馬兜鈴屬植物中的AAs 是引起腎病、腎衰竭和尿路上皮癌（包括巴爾干腎?。┑闹饕蛑?。2017 年，Ng 等[12]提出，在亞洲，肝癌的發(fā)生與AAs 導(dǎo)致的基因突變密切相關(guān)。據(jù)估計，中國有超過1 億人患有慢性腎病[6]。近年來，對巴爾干腎病的系列研究表明，AAs 是一類環(huán)境和食品污染物[13-16]。我國是馬兜鈴屬植物的主產(chǎn)地之一，這些植物在種植、加工、使用及廢料處理過程中，將AAs 釋放到環(huán)境中，污染水體、空氣和土壤，長期暴露在被AAs 污染的環(huán)境將增加罹患慢性腎病的風(fēng)險。因此，建立環(huán)境水中AAs 的快速、靈敏測定方法至關(guān)重要。

目前，檢測AAs 的方法主要包括高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）[17-18]、高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD）[19-22]、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）[23-26]和熒光傳感器快速測定法[27]等。其中，HPLCUV 法是測定AAs 最常用的方法，也是《中華人民共和國藥典》（2020 版）一部[28]收錄的方法，但該方法的靈敏度較低，主要用于單味中藥中較高濃度的AAs 的檢測。HPLC-FLD 法是先將AAs 還原成馬兜鈴內(nèi)酰胺，再采用熒光法進(jìn)行測定，該方法選擇性好、靈敏度高，無需使用昂貴的質(zhì)譜儀，但需要衍生，并且很多中草藥本身含馬兜鈴內(nèi)酰胺，樣品衍生前后需進(jìn)行兩次測定。LC-MS 具有強大的結(jié)構(gòu)鑒定功能和高靈敏度，備受分析工作者青睞。但是，由于AAs 的電離效率低，使用LC-MS 進(jìn)行AAs 分析的靈敏度不高[23]。熒光傳感器快速測定法具有靈敏度高、選擇性高、響應(yīng)快和操作簡單等優(yōu)點，但作為熒光材料的共軛聚合物在空氣中暴露于紫外-可見光下不穩(wěn)定，導(dǎo)致無法進(jìn)行準(zhǔn)確檢測[24]。

環(huán)境樣品中AAs 的濃度低，并且樣品中存在大量干擾物，因此，測定前必須對樣品進(jìn)行富集和凈化。液液萃?。↙LE）是AAs 測定最常用的預(yù)處理方法。然而，LLE 需要消耗大量有機溶劑，并且難以實現(xiàn)分析物的富集和純化。固相萃取（SPE）[29-30]、磁固相萃取（MSPE）[31]與HPLC 或LC-MS 聯(lián)用可用于測定中藥中的AAs，然而，這些方法通常需要使用固相萃取柱或合成特定的吸附材料，并且操作繁瑣費時。

分散液液微萃?。―LLME）是一種新的環(huán)境友好的樣品前處理技術(shù)[32-33]，因其操作簡單、成本低、富集效率高、有機溶劑消耗少而廣泛應(yīng)用于環(huán)境、醫(yī)學(xué)和生物等領(lǐng)域[34-35]。該技術(shù)特別適用于水樣分析，與超聲等輔助方法相結(jié)合，可加速傳質(zhì)效率，顯著提高萃取效率[36]。本研究采用超聲輔助分散液液微萃?。║S-DLLME）-高效液相色譜法，建立了快速測定環(huán)境水樣中AA-Ⅰ和AA-Ⅱ的分析方法，并對湘江和瀏陽河水樣進(jìn)行了測定，為環(huán)境中AAs 的監(jiān)測提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT 高效液相色譜儀（配SPD-M20A 二極管陣列檢測器，日本島津公司）；TG16-WS 離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；KQ-100E 超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；MD-200 氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

馬兜鈴酸Ⅰ對照品（99.6%，上海安譜實驗科技有限公司）；馬兜鈴酸Ⅱ?qū)φ掌罚ā?7%，西格瑪化學(xué)有限公司）；甲醇和乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。實驗用水為Milli-Q 純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）制備的超純水（18.2 MΩ·cm）。

準(zhǔn)確稱取4.0 mg AA-Ⅰ和AA-Ⅱ?qū)φ掌贩謩e溶解于10 mL 乙腈中，配制濃度均為400 μg/mL 的AA-Ⅰ和AA-Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)儲備液。標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。標(biāo)準(zhǔn)儲備液和標(biāo)準(zhǔn)溶液均于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 樣品及其預(yù)處理

環(huán)境水樣品為2020 年6 月4 日至8 日取自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)附近的瀏陽河和湖南師范大學(xué)附近的湘江的水樣。在萃取過程中，使用標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液作為料液相溶液。

1.3 色譜條件

InertSustain C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；溫度：30 ℃；流動相：乙腈-0.5%醋酸溶液（45∶55，V/V）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：4 μL；檢測波長：254 nm。

1.4 分散液液微萃取方法

將5.00 mL 料液相溶液置于10 mL 尖底離心管中，快速注入600 μL 混合溶劑（500 μL 乙腈和100 μL CHCl3），搖勻?；旌衔镌?0 ℃下超聲3 min，4000 r/min 離心3 min。用100 μL 微量注射器移取下層有機相至5 mL 離心管中?？紤]到有機溶劑對色譜柱的影響，得到的有機相先于55 ℃氮吹揮干，用50 μL 乙腈復(fù)溶后再進(jìn)行色譜分析。操作示意圖見圖2。

圖2 分散液液微萃?。―LLME）操作示意圖Fig.2 Diagram of the extraction process of dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME)

1.5 富集因子的計算

富集因子（Enrichment factor，EF）表示萃取過程中目標(biāo)分析物的濃度增加的倍數(shù)，按照下式計算：

式中，Cr，final為復(fù)溶后分析物的最終濃度，Cf，initial為萃取前料液相中分析物的初始濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取溶劑的選擇

US-DLLME 中萃取溶劑的選擇是影響萃取效率和富集因子的重要因素。萃取溶劑通常需滿足兩個條件：（1）密度與水相差大，以方便通過離心將料液相與萃取溶劑分離；（2）萃取溶劑難溶或不溶于水，但對待測物的溶解度大，以保證取得良好的萃取效率。鹵代烴（如氯仿、二氯甲烷等）由于密度大、溶解性好且萃取后容易分離，通常是DLLME 的首選萃取溶劑。考察了對AA-Ⅰ和AA-Ⅱ溶解性較好的氯仿、二氯甲烷、正辛醇和乙酸乙酯4 種萃取溶劑對富集因子的影響（表1）。由表1 可知，乙酸乙酯作為萃取溶劑時，離心后無法清晰分層，這可能是因為乙酸乙酯微溶于水，而分散劑乙腈進(jìn)一步增加了乙酸乙酯在水中的溶解度，從而使得分相困難，因此，乙酸乙酯不適合用作萃取溶劑。正辛醇、氯仿或二氯甲烷作為萃取溶劑時，均獲得了56 倍以上的富集因子。但是，正辛醇密度比水低，離心后鋪展在水相上層，不易進(jìn)行分離操作。氯仿和二氯甲烷對分析物溶解度高，不溶于水，萃取離心后易與樣品溶液分離，也易氮吹揮干，是理想的萃取溶劑，并且氯仿作為萃取溶劑可以獲得最高的富集因子。因此，本研究選擇氯仿作為最佳萃取溶劑。

表1 萃取溶劑對富集因子的影響Table 1 Effect of the extraction solvent on the enrichment factor (n=3)

2.1.2 分散劑的選擇

分散劑是影響萃取效率的另一個重要因素。合適的分散劑既與水相互溶，又與萃取溶劑互溶，可極大地增加萃取溶劑和分析物之間的接觸面積，從而提高萃取效率。考察了乙腈、甲醇、乙醇和丙酮4 種常用分散劑對分析物富集因子的影響。結(jié)果表明，使用乙腈、甲醇、乙醇或丙酮作為分散劑時，AA-Ⅰ的富集因子分別為63.18、56.35、54.23 和57.17，AA-Ⅱ的富集因子分別為62.13、57.85、55.99 和58.83。由此可見，以乙腈為分散劑，可得到較高的富集因子。因此，本研究選擇乙腈作為分散劑。

2.1.3 萃取溶劑用量的影響

萃取溶劑用量直接影響分散液液微萃取的萃取率和回收率，從而影響富集因子。通常，隨著萃取溶劑用量增加，分析物的萃取會更加完全。但是，萃取溶劑用量過大，會降低分析物在萃取溶劑中的濃度，從而降低富集因子，并且過量使用有機溶劑會造成環(huán)境污染，增加氮吹時間和實驗成本；而萃取溶劑用量太小，分析物萃取不完全，并且有機相不易被移取。萃取溶劑用量選擇的基本原則是在兼顧各方面因素的前提下盡可能減少萃取溶劑用量。本研究在既保證萃取率，又保證足夠用于上機分析的前提下，考察了不同萃取溶劑用量（50、75、100、150、200 和300 μL）對分析物富集因子的影響。如圖3A 所示，萃取溶劑用量從50 μL 增至100 μL 時，富集因子明顯增加；隨著萃取溶劑用量進(jìn)一步增加，富集因子增長緩慢。因此，本研究使用100 μL 萃取溶劑進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 （A）萃取溶劑體積、（B）分散劑體積（萃取溶劑體積100 μL）、（C）超聲時間和（D）樣品溶液pH 值對富集因子的影響（n=3）Fig.3 Effects of volume of extraction solvent (A), volume of disperser solvent (B), ultrasonic time (C) and pH value of aqueous sample solution (D) on enrichment factor (n=3)

2.1.4 分散劑用量的影響

分散劑用量直接影響溶液均勻分散的程度。分散劑過少，萃取溶劑和料液相之間混合不夠，萃取溶劑分散不均勻，萃取率低；分散劑過多，分析物在樣品溶液中的溶解度增大而不易被萃取，萃取率也會降低?？疾炝瞬煌昧浚?00、200、500、800 和1000 μL）分散劑對分析物富集因子的影響。由圖3B 可知，富集因子先隨分散劑用量的增加而逐漸增加。當(dāng)分散劑用量達(dá)到500 μL 時，富集因子達(dá)到最大值。繼續(xù)增加分散劑用量，富集因子反而逐漸減小。說明分散劑用量為500 μL 時，萃取溶劑和料液相之間的混合達(dá)到最佳。因此，選擇最佳分散劑用量為500 μL。

2.1.5 超聲時間的影響

超聲輔助萃取可以通過增加料液相與萃取溶劑的接觸面積進(jìn)而提高萃取效率。若超聲萃取時間過短，萃取不完全，影響萃取效率；若超聲時間過長，樣品溶液易乳化，影響水相和有機相分離。超聲時間對富集因子的影響結(jié)果如圖3C 所示，分析物的富集因子先隨超聲時間延長而增加；當(dāng)超聲時間達(dá)3 min 時，混合溶液變得渾濁；進(jìn)一步延長超聲時間，溶液開始輕微乳化，富集因子不再顯著增加，并且由于超聲會產(chǎn)生熱量，長時間超聲可能造成試劑揮發(fā)，從而影響萃取效果。因此，選擇3 min 作為最佳超聲時間。

2.1.6 料液相pH值的影響

在US-DLLME 中，料液相pH 值在萃取傳質(zhì)過程中具有重要作用。為了將分析物從水相提取到有機相中，分析物應(yīng)處于非電離狀態(tài)。根據(jù)AA-Ⅰ（pKa=3.3±0.1）和AA-Ⅱ（pKa=3.2±0.1）的pKa值[37]，萃取前，需將樣品溶液調(diào)至pH≈3，使目標(biāo)物去離子化，降低其在水相中的溶解度。料液相pH 值在1.0～5.0 范圍內(nèi)對富集因子的影響如圖3D 所示，可見隨著料液相pH 值從5.0 降至3.0，分析物非電離形式的比率增加，富集因子增大；當(dāng)pH 值從3.0 進(jìn)一步降至1.0 時，富集因子不再明顯增大。因此，在后續(xù)研究中，通過加入HCl 溶液將料液相調(diào)至pH=3.0。

2.1.7 料液相中鹽濃度的影響

在其它條件不變的情況下，通過向料液相中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl（0～6%，m/V），考察料液相中鹽濃度對富集因子的影響。結(jié)果表明，加入鹽對AA-Ⅰ和AA-Ⅱ的富集因子無明顯影響。因此，本研究選擇不加鹽。

綜上，AA-Ⅰ和AA-Ⅱ的最佳US-DLLME 條件為：100 μL 氯仿為萃取溶劑，500 μL 乙腈為分散劑，超聲時間為3 min， 料液相pH=3.0。在此條件下，AA-Ⅰ和AA-Ⅱ的富集因子分別為95.9 和93.4。

標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)US-DLLME 后的色譜圖如圖4 所示。與圖4A 相比，圖4B 中AA-Ⅰ和AA-Ⅱ的峰強度均增加約4 倍。結(jié)果表明，采用US-DLLME 后，分析物得到了有效富集。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)超聲輔助分散液液微萃?。║S-DLLME）后的色譜圖（1：AA-Ⅱ；2：AA-Ⅰ）：（A）含有5.0 μg/mL AA-Ⅰ和AA-Ⅱ的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖（進(jìn)樣體積：20 μL）；（B）含有1.0 μg/mL AA-Ⅰ和AA-Ⅱ的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)US-DLLME 后的色譜圖（進(jìn)樣體積：4 μL）Fig.4 Chromatograms of the feed solution and the reconstituted solution after ultrasonic-assisted dispersive liquid-liquid microextraction(US-DLLME)(1:AA-Ⅱ;2:AA-Ⅰ):(A)Standard solution containing 5.0 μg/mL of AA-Ⅰand AA-Ⅱ(Injection volume: 20 μL); (B) Reconstituted solution after US-DLLME for the standard solution containing 1.0 μg/mL of AA-Ⅰand AA-Ⅱ(Injection volume: 4 μL)

2.2 方法確證

在最佳萃取條件下，以分析物的峰面積對其濃度進(jìn)行線性回歸，考察了方法的線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度、檢出限（LOD，S/N= 3）和定量限（LOQ，S/N= 10）。結(jié)果表明，AA-Ⅰ和AA-Ⅱ在0.01～2.00 μg/mL 濃度范圍內(nèi)均具有良好線性，相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.9994 和0.9997，LOD 分別為2.5 和3.0 ng/mL， LOQ 分別為8.0 和9.5 ng/mL。以0.1 和1.0 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液考察方法的精密度（n=3），得到AA-Ⅰ的日內(nèi)精密度分別為5.1%和3.2%，日間精密度分別為5.4%和3.6%；AA-Ⅱ的日內(nèi)精密度分別為5.4%和3.0%，日間精密度分別為5.6%和3.4%。

以AA-Ⅰ為例，將本方法與文獻(xiàn)報道方法進(jìn)行了比較，結(jié)果見表2。與文獻(xiàn)報道方法相比，本方法具有預(yù)處理時間短、萃取溶劑消耗量少和檢出限低等優(yōu)點。

表2 本方法與文獻(xiàn)報道的檢測AA-Ⅰ方法的比較Table 2 Comparison of this method with the methods reported in literatures for detection of AA-Ⅰ

2.3 實際水樣分析

采用本方法對瀏陽河實際水樣中AA-Ⅰ和AA-Ⅱ的含量進(jìn)行測定，相關(guān)色譜圖見圖5。由圖5A 和5B 可見，無論是樣品溶液直接進(jìn)樣分析，還是經(jīng)過US-DLLME 進(jìn)樣分析，均未在水樣中檢出分析物。對比瀏陽河水加標(biāo)水樣經(jīng)US-DLLME 處理前（圖5C）和處理后（圖5D）的色譜圖可知，采用US-DLLME 作為預(yù)處理方法實現(xiàn)了對分析物的有效富集。在連續(xù)5 d 對水樣監(jiān)測的結(jié)果中未檢出AA-Ⅰ和AA-Ⅱ。將本方法用于湘江水樣的測定，獲得了與瀏陽河水樣相似的測定結(jié)果，說明瀏陽河水和湘江水未被AA-Ⅰ和AA-Ⅱ污染。

圖5 （A）20 μL 瀏陽河水樣、（B）4 μL 瀏陽河水樣經(jīng)US-DLLME 預(yù)處理后、（C）20 μL 0.05 μg/mL 加標(biāo)水樣和（D）4 μL 0.05 μg/mL 加標(biāo)水樣經(jīng)US-DLLME 預(yù)處理后的色譜圖（1：AA-Ⅱ 2：AA-Ⅰ）Fig.5 Chromatograms of (A) 20 μL of Liuyang River water sample, (B) 4 μL of Liuyang River water sample after US-DLLME, (C) 20 μL of 0.05 μg/mL spiked water sample, and (D) 4 μL of 0.05 μg/mL spiked water sample after US-DLLME.(1: AA-Ⅱ2: AA-Ⅰ)

瀏陽河水樣和湘江水樣在3 個加標(biāo)濃度水平（0.02、0.20 和1.50 μg/mL）下的回收率和RSD 見表3。瀏陽河水樣的回收率在91.7%～96.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜5.7%（n=3）；湘江水樣的回收率在91.9%～97.8%之間，RSD ＜5.1%（n=3）。上述結(jié)果表明，本方法精密度高、準(zhǔn)確性好，可用于環(huán)境水樣中AA-Ⅰ和AA-Ⅱ的分析。

表3 實際河水水樣中AA-I和AA-Ⅱ的標(biāo)準(zhǔn)添加實驗結(jié)果Table 3 Results of standard addition experiments of AA-Ⅰand AA-Ⅱin actual water samples

3 結(jié)論

采用US-DLLME 作為HPLC-UV 法測定環(huán)境水樣中AAs 的樣品預(yù)處理方法，可實現(xiàn)AA-Ⅰ和AA-Ⅱ的同時萃取，而且富集因子高、預(yù)處理時間短、提取溶劑消耗少，方法的靈敏度比簡單的HPLC-UV 法提高了近2 個數(shù)量級，與HPLC-MS 法相當(dāng)。本研究提出的US-DLLME-HPLC 法簡單、快速、靈敏度高，適合于環(huán)境水樣中AA-Ⅰ和AA-Ⅱ的快速分析，可為環(huán)境水樣中AAs 含量監(jiān)測提供參考。