韋澤豐, 王自強, 鄭金花, 張瑞城

作者單位：570102 ?？?海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科

膿毒癥是由病毒、真菌或細菌感染引起的全身炎癥反應(yīng),可引起炎癥細胞因子的過度釋放,造成組織損傷和多器官功能障礙,最終導(dǎo)致患者死亡[1]。因此,需要及時采取相關(guān)措施預(yù)防和治療膿毒癥。急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是膿毒癥的主要并發(fā)癥,其特征是腎功能急劇下降,增加患者的死亡風(fēng)險[2-3]。然而,關(guān)于膿毒癥引起AKI的機制有待進一步研究。肽基精氨酸脫亞胺酶(peptidylarginine deiminase,PAD)可以將組蛋白及其他蛋白的精氨酸殘基以脫亞胺的方式水解為瓜氨酸[4]。PAD4是PAD的一種亞型,位于細胞核和細胞質(zhì)中,在中性粒細胞中高表達[5]。PAD4可催化瓜氨酸化組蛋白H3(citrullinated histone H3,H3cit)形成,后者可導(dǎo)致染色質(zhì)去濃縮,進一步形成中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)的主要調(diào)節(jié)因子[6]。有研究表明,過度的NETs釋放會加重內(nèi)毒素休克與膿毒血癥[7]。此外,PAD4介導(dǎo)的肽基瓜氨酸化蛋白在多種自身免疫性疾病和缺血性疾病中呈高表達,如多發(fā)性硬化癥等[8]。使用PAD4的抑制劑BB-Cl-amidine抑制PAD4酶活性可減輕炎癥細胞因子浸潤、纖維蛋白沉積和血栓的形成[9]。PAD4介導(dǎo)的H3cit通過加劇腎臟缺血和再灌注后的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致急性組織損傷[10],但其對膿毒癥相關(guān)AKI的影響及機制尚缺乏相關(guān)研究。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是存在于革蘭陰性菌表面的內(nèi)毒素,已被廣泛用于制備實驗性膿毒癥相關(guān)AKI的模型[11]。本研究通過腹腔注射LPS構(gòu)建膿毒癥相關(guān)AKI小鼠模型,通過口服灌胃BB-Cl-amidine抑制PAD4酶活性,檢測H3cit水平、腎臟病理情況、腎損傷及腎臟氧化應(yīng)激水平,評估PAD4介導(dǎo)的H3cit在膿毒癥相關(guān)AKI進程中的作用,為膿毒癥相關(guān)AKI的預(yù)防及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級雄性C57BL/6J小鼠30只(6～8周齡,20～25 g),購自海南藥物研究所有限責(zé)任公司,使用許可證號為SCXK(瓊)2020-0007。所有小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度25 ℃,自然光暗周期,實驗期間自由飲食。

1.2細胞和主要試劑 腎上皮細胞HEK293T購自北京安必奇生物科技有限公司。BB-Cl-amidine購自MedChemExpress公司。LPS購自北京百奧萊博科技有限公司。RIPA裂解液、BCA蛋白檢測試劑盒、蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國ThermoFisher。CCK-8試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司。PAD4、H3cit和GAPDH抗體購自美國Abcam。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、血清肌酐(serum creatinine,SCr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、尿微量白蛋白(urinary microalbumin,UALb)、肌酐(creatinine,Cr)比色法測試盒購自南京建成生物工程研究所。H3cit的酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自江蘇雨桐生物科技有限公司。蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色液購自云科生物技術(shù)有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1 動物造模與干預(yù)方法 將30只C57BL/6J小鼠隨機分為對照組、模型組和給藥組,每組10只。給藥組連續(xù)7 d灌胃BB-Cl-amidine(按體重1 μg/g給藥[12]),其余兩組灌胃同體積生理鹽水。7 d后對模型組和給藥組小鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg),對照組注射同體積生理鹽水,24 h后收集眼球外周血,并脫頸椎處死小鼠。

1.3.2 細胞培養(yǎng)與干預(yù)方法 使用添加了10% FBS以及100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293T細胞,培養(yǎng)箱環(huán)境條件設(shè)置為95%空氣、5% CO2、37 ℃。及時更換培養(yǎng)基以滿足細胞生長需要,待細胞生長密度到達80%時進行消化傳代。將細胞分為空白組、LPS組、LPS+BB-Cl-amidine組。LPS+BB-Cl-amidine組需提前加入10 μM濃度BB-Cl-amidine預(yù)處理24 h,LPS組和LPS+BB-Cl-amidine組加入50 μg/ml LPS刺激24 h,收集細胞進行下一步檢測。

1.3.3 Western blot法檢測PAD4和H3cit蛋白表達水平 收集小鼠腎皮質(zhì)組織和處理后的HEK293T細胞,然后分別加入RIPA裂解液,并在冰上孵育60 min。在4 ℃下以12 000 r/min離心5 min。按照BCA檢測試劑盒說明書進行蛋白含量檢測。經(jīng)加溫處理后將蛋白樣本與蛋白上樣緩沖液進行混合,使用12%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳實驗。通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,使用含5%脫脂奶粉的TBST溶液在室溫下封閉處理1 h,PAD4、H3cit和GAPDH一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。以TBST溶液洗膜3次,10 min/次,二抗使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h。加入TBST溶液洗膜3次,10 min/次。加入顯色液,應(yīng)用Tanon5200化學(xué)發(fā)光成像儀拍攝,通過Image J軟件進行灰度值分析,以GAPDH為內(nèi)參計算目標(biāo)蛋白的相對表達量。實驗設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3.4 ELISA法檢測血清H3cit水平 將外周血以4 000 g、4 ℃條件離心5 min后收集血清。按照H3cit的ELISA檢測試劑盒說明書操作方法測定血清H3cit水平。實驗設(shè)置10個復(fù)孔。

1.3.5 腎功能指標(biāo)測定 將外周血以4 000 g、4 ℃條件離心5 min后收集血清。按照ELISA檢測試劑盒說明書操作方法測定血清SCr、BUN水平。使用小鼠代謝籠留取小鼠處死前24 h的尿液,測定尿液UALb、Cr水平,結(jié)果以UALb/Cr比值呈現(xiàn),實驗操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。實驗設(shè)置10個復(fù)孔。

1.3.6 HE染色方法 收集小鼠腎臟組織,4%多聚甲醛固定過夜,然后予10% EDTA脫鈣,石蠟包埋后切片,切片厚度約為5 μm。使用梯度濃度乙醇對切片進行脫蠟和再水化,然后將切片浸入蘇木精染色液中,染色5～10 min。使用蒸餾水沖洗切片,直到洗出液呈藍色。隨后,將切片浸入伊紅染色液中,染色1～2 min。使用蒸餾水簡短沖洗。切片經(jīng)乙醇脫水,再經(jīng)二甲苯透化10 min。將已透明的切片滴上樹膠,蓋上蓋玻片封固,顯微鏡下觀察腎臟病理結(jié)構(gòu)。

1.3.7 腎臟皮質(zhì)組織MDA、SOD水平測定 收集小鼠腎皮質(zhì)組織,并迅速置于冰凍離心管中,在冰上使用RIPA裂解液裂解60 min。在4 ℃下以12 000 r/min離心5 min,收集上清液,即腎組織均漿。按照SOD和MDA比色法測試盒說明書進行實驗操作和測定。實驗設(shè)置10個復(fù)孔。

1.3.8 CCK-8法檢測細胞增殖水平 將10 μM濃度BB-Cl-amidine預(yù)處理24 h的HEK293T細胞按1×104cells/孔接種于96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)過夜,然后加入50 μg/ml LPS分別刺激0 h、24 h、48 h。設(shè)置空白孔(不含細胞),每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃培養(yǎng)4 h。通過酶標(biāo)儀測量450 nm處的光密度值(OD值)。相對增殖水平(%)=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(0 h實驗組OD值-空白孔OD值)×100%。實驗設(shè)置6個復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1三組小鼠腎組織PAD4和H3cit表達水平比較 Western blot實驗結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠腎組織PAD4、H3cit蛋白表達顯著升高(P<0.05);與模型組比較,給藥組小鼠腎組織H3cit蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),兩組PAD4蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

?Western blot實驗結(jié)果圖。?三組PAD4蛋白表達水平比較(F=126.343,P<0.001)。?三組H3cit蛋白表達水平比較(F=135.653,P<0.001)。與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

2.2三組小鼠血清H3cit、SCr、BUN和尿UALb/Cr比值水平比較 與對照組比較,模型組小鼠血清H3cit、SCr、BUN和尿UALb/Cr比值水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,給藥組小鼠血清H3cit、SCr、BUN水平和尿UALb/Cr比值水平顯著降低(P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,血清H3cit水平與SCr、BUN、UALb/Cr比值水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見圖2,3。

?三組血清H3cit水平比較(F=102.734,P<0.001)。?三組血清SCr水平比較(F=115.574,P<0.001)。?三組血清BUN水平比較(F=138.365,P<0.001)。?三組尿UALb/Cr比值水平比較(F=157.654,P<0.001)。與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

圖3 三組小鼠血清H3cit水平與SCr、BUN和UALb/Cr比值水平的相關(guān)性分析結(jié)果圖

2.3三組小鼠腎組織HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示,對照組小鼠腎小球完整、無損傷,無炎性細胞浸潤。模型組小鼠出現(xiàn)明顯的腎小管和間質(zhì)急性損傷,以及大量的炎性細胞浸潤。給藥組小鼠的腎小管和間質(zhì)損傷程度較模型組降低,炎性細胞浸潤減少,總體腎損傷程度降低。見圖4。

黑色箭頭所指為炎性細胞浸潤

2.4三組小鼠腎組織MDA、SOD水平比較 與對照組比較,模型組小鼠腎組織MDA水平顯著升高、SOD水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,給藥組小鼠腎組織MDA水平顯著降低,SOD水平顯著升高(P<0.05)。見圖5。

?三組MDA水平比較(F=153.653,P<0.001)。?三組SOD水平比較(F=168.311,P<0.001)。與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

2.5三組細胞增殖水平及PAD4、H3cit蛋白表達水平比較 CCK-8實驗結(jié)果顯示,與空白組比較,LPS組細胞增殖水平降低,在48 h時有顯著性差異(P<0.05);與LPS組比較,LPS+BB-Cl-amidine組細胞增殖水平升高,在48 h時有顯著性差異(P<0.05)。見圖6。Western blot實驗結(jié)果顯示,與空白組比較,LPS組細胞PAD4和H3cit蛋白表達顯著升高(P<0.05);與LPS組比較,LPS+BB-Cl-amidine組細胞H3cit蛋白表達顯著降低(P<0.05),但組間PAD4蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖7。

48 h時間點三組相對增殖率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=84.323,P=0.003);與空白組比較,*P<0.05;與LPS組比較,#P<0.05

?Western blot實驗結(jié)果圖。?三組PAD4蛋白表達水平比較(F=142.663,P<0.001)。?三組H3cit蛋白表達水平比較(F=184.753,P<0.001)。與空白組比較,*P<0.05;與LPS組比較,#P<0.05

3 討論

3.1膿毒癥是一種危及患者生命的器官功能障礙綜合征,其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈持續(xù)升高的趨勢,住院死亡率為17%～26%[13]。膿毒癥常伴有腎臟、肝臟、肺臟、心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等功能障礙[14]。在膿毒癥患者中AKI的發(fā)生率為22%～51%,且與其他器官衰竭及整體不良預(yù)后密切相關(guān)。AKI患者罹患慢性腎病和終末期腎病的風(fēng)險更高[15]。膿毒癥引起AKI的病理生理機制復(fù)雜,預(yù)防和治療AKI的新療法尚有待進一步開發(fā)。

3.2蛋白質(zhì)的瓜氨酸化是指肽基精氨酸殘基通過催化酶轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的過程[16]。由于該過程伴隨著氨基的去除,因此也稱為肽基精氨酸脫氨基反應(yīng)。這種化學(xué)反應(yīng)伴隨著靜電荷的變化,會影響蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)和功能[17]。PAD是催化蛋白質(zhì)的精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的脒基轉(zhuǎn)移酶超家族。人類PAD家族包含5個成員:PAD1、PAD2、PAD3、PAD4和PAD6。瓜氨酸化后的蛋白質(zhì)正電荷減弱,可以通過改變底物結(jié)合親和力而改變蛋白之間相互作用,從而影響蛋白質(zhì)的功能[18]。PAD4是PAD家族中唯一攜帶核定位信號序列的成員,能夠轉(zhuǎn)移到細胞核并催化形成H3cit。有研究表明,H3cit是一種常見的炎癥疾病標(biāo)志物,細胞外H3cit表現(xiàn)出高毒性,可引起組織損傷,導(dǎo)致多器官衰竭并增加患者死亡風(fēng)險[19]。Zhang等[20]在三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中發(fā)現(xiàn)了H3cit和PAD4的表達上調(diào),通過BB-Cl-amidine治療有效減輕了模型小鼠的臨床結(jié)腸炎指數(shù)和組織炎癥水平。Tian等[21]的研究發(fā)現(xiàn),H3cit在感染性休克患者中水平升高,并與疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后具有關(guān)聯(lián)。BB-Cl-amidine通過共價修飾PAD4的半胱氨酸活性位點,不可逆地抑制PAD4的酶活性。有研究顯示,BB-Cl-amidine治療可以顯著緩解盲腸結(jié)扎和穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)膿毒癥小鼠模型血清中的瓜氨酸化水平,降低促炎細胞因子釋放,顯著提高了CLP后的存活率[22]。

3.3AKI主要表現(xiàn)為腎功能的突發(fā)性破壞和持續(xù)性下降,伴隨血清BUN、SCr水平顯著升高[23]。有研究證實,UALb/Cr比值水平可準(zhǔn)確反映腎小球損傷情況,且在臨床已廣泛應(yīng)用[24]。在本研究中,通過腹腔注射LPS可以增加血清中SCr、BUN水平與尿UALb/Cr比值水平,表明該劑量的LPS可以成功誘導(dǎo)膿毒癥小鼠AKI。據(jù)報道,腎小管中PAD4可以加重腎缺血和再灌注損傷后的腎臟炎癥反應(yīng),這可能與瓜氨酸化蛋白的過度釋放進而激活促炎性核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)LPS干預(yù)后,小鼠腎臟及腎上皮細胞HEK293T中PAD4、H3cit水平顯著增高,當(dāng)給予BB-Cl-amidine干預(yù)抑制PAD4蛋白活性后,H3cit蛋白水平均顯著降低,小鼠腎臟病理情況得到改善,血清中SCr、BUN水平及尿UALb/Cr比值水平降低。表明PAD4介導(dǎo)的H3cit形成可能參與了膿毒癥小鼠AKI的進展,抑制PAD4蛋白活性,有助于該疾病治療。

3.4MDA和SOD可以反映機體的抗氧化能力[26]。據(jù)報道,在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中,PAD4通過促進促炎細胞因子釋放和增加機體氧化應(yīng)激水平的方式,加重了肺水腫及肺損傷[27]。在本研究中,經(jīng)腹腔注射LPS后,小鼠腎組織中MDA水平升高、SOD水平降低,表明腎臟氧化應(yīng)激水平增加,抗氧化能力受損,給予BB-Cl-amidine處理抑制PAD4蛋白活性后,SOD水平得到恢復(fù)并抑制MDA產(chǎn)生,表明抑制PAD4有助于恢復(fù)機體的抗氧化能力。另外,本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)BB-Cl-amidine干預(yù)后,細胞增殖水平升高,提示抑制PAD4蛋白活性有助于組織修復(fù)。

綜上所述,膿毒癥相關(guān)AKI小鼠腎臟的PAD4、H3cit蛋白水平顯著增加,PAD4蛋白可能通過介導(dǎo)H3cit蛋白形成而促進了AKI病程的進展,經(jīng)PAD4抑制劑BB-Cl-amidine干預(yù)后,H3cit水平降低,同時也降低了氧化應(yīng)激水平,有助于緩解腎臟損傷。