徐芳芳，鄭 磊，琚 銘，馬 琴，李 春，段迎輝，張仙美，苗紅梅

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 芝麻研究中心，河南 鄭州450002；2.河南省特色油料基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450002；3.漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 漯河462300）

芝麻（Sesamum indicumL.，2n=26）屬胡麻科胡麻屬，是世界上最古老的油料作物之一，也是我國(guó)重要的特色優(yōu)質(zhì)油料作物。芝麻籽粒含有豐富的脂肪（50%～60%）、蛋白質(zhì)（18%～24%）、多糖、膳食纖維以及維生素和微量元素[1]。其中粗脂肪含量為50%～60%，主要由油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸組成，占油分總量的80%以上。因此，芝麻油被認(rèn)為是最為理想的植物油脂[1-2]。此外，芝麻籽粒中還含有芝麻酚、芝麻素等抗氧化物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品、營(yíng)養(yǎng)保健、制藥及工業(yè)等各行業(yè)[1，3]。

芝麻屬于高含油量作物。但是在現(xiàn)有芝麻種質(zhì)資源中，籽粒油分含量和蛋白質(zhì)含量的變化范圍較大，分別為29.5%～62.7%和12.9%～31.0%[4-5]。研究表明，芝麻油分含量和蛋白質(zhì)含量等品質(zhì)性狀屬于數(shù)量性狀，受多基因控制，遺傳特性較為復(fù)雜[6-8]；同時(shí)，油分含量性狀易受基因型+環(huán)境共同影響，對(duì)優(yōu)質(zhì)新品種選育有一定的影響[9-10]。在高油、高蛋白等優(yōu)質(zhì)芝麻種質(zhì)鑒定及品種選育過(guò)程中，目前多采用傳統(tǒng)的化學(xué)法、核磁共振法以及近紅外光譜法進(jìn)行表型測(cè)定，工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)[5，11-12]。發(fā)掘品質(zhì)相關(guān)分子標(biāo)記和基因標(biāo)記為快速精準(zhǔn)鑒定和選育高油、高蛋白等優(yōu)質(zhì)芝麻新品種提供了可靠途徑。危文亮等[11]利用43 對(duì)SRAP（相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）引物、20 對(duì)SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記）引物以及16 對(duì)AFLP（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性）引物，對(duì)216 份芝麻種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析、群體結(jié)構(gòu)分析和油分含量性狀關(guān)聯(lián)分析，在2 個(gè)環(huán)境下重復(fù)檢測(cè)出3個(gè)SRAP 標(biāo)記和5個(gè)SSR 標(biāo)記與油分含量性狀極顯著關(guān)聯(lián)。LI 等[6]利用自主研發(fā)的112 對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記，對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)外的369 份芝麻種質(zhì)進(jìn)行了5 個(gè)環(huán)境下的油分含量和蛋白質(zhì)含量性狀的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)芝麻油分含量與蛋白質(zhì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，共有19 個(gè)SSR 標(biāo)記與油分含量緊密連鎖，24個(gè)SSR 標(biāo)記與蛋白質(zhì)含量緊密關(guān)聯(lián)，且2 組中的SSR 標(biāo)記存在重合現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)了芝麻油分含量與蛋白質(zhì)含量之間存在一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系。近幾年來(lái)，借助于高通量測(cè)序技術(shù)和芝麻參考基因組信息，人們開(kāi)展了芝麻油分含量全基因組關(guān)聯(lián)及基因定位克隆研究[13-17]。一批油分含量相關(guān)的SSR 標(biāo)記、SNP（單核苷酸多態(tài)性）標(biāo)記、數(shù)量性狀QTL及基因被發(fā)掘，為加快芝麻品質(zhì)分子育種提供了重要信息[18]。但是，截至目前，鮮有SSR等分子標(biāo)記用于高油芝麻種質(zhì)和品種精準(zhǔn)鑒定與評(píng)價(jià)的報(bào)道。鑒于此，為搭建并完善芝麻分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)體系，利用自主篩選的24 個(gè)多態(tài)性SSR 標(biāo)記，對(duì)48 個(gè)高/低油分含量芝麻種質(zhì)開(kāi)展基因型鑒定，篩選出可以用于準(zhǔn)確判定芝麻油分含量水平的SSR 標(biāo)記，確定高油分相關(guān)SSR 標(biāo)記鑒定方法和優(yōu)異等位位點(diǎn)信息，為實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)芝麻分子標(biāo)記輔助育種提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

48 份芝麻種質(zhì)由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心提供，油分含量在50%以上的樣本為高油分樣本，低于50%的為低油分樣本。2018年6月將48份芝麻種質(zhì)種植于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開(kāi)發(fā)基地，每個(gè)樣本種植2 行，行長(zhǎng)5 m，行寬40 cm，株距20 cm。采用標(biāo)準(zhǔn)種植管理方式進(jìn)行管理。采集現(xiàn)蕾期相同部位幼嫩葉片，液氮速凍后，-70 ℃保存，用于DNA 提取。成熟后收獲各樣本種子，用于品質(zhì)測(cè)定。

1.2 油分含量檢測(cè)

芝麻籽粒油分含量數(shù)據(jù)采集采用近紅外光譜法進(jìn)行[12]，利用瑞典Perten 公司生產(chǎn)的DA-7200 型近紅外光譜儀測(cè)得。測(cè)定前，各測(cè)試樣本籽粒均精選、去除雜質(zhì)；重復(fù)測(cè)定2～3次。近紅外光譜檢測(cè)用譜段為950～1 650 nm，采樣間隔2 nm。

1.3 SSR引物合成

24 對(duì)SSR 標(biāo)記的引物序列信息參考LI 等[6]獲得，引物合成由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.4 SSR引物PCR檢測(cè)

采用CTAB 法（QIAGEN，Hilden，Germany）提取各芝麻樣本葉片DNA，用于SSR 標(biāo)記PCR 擴(kuò)增和檢測(cè)。PCR 反應(yīng)體系：引物對(duì)（0.2 μmol/L）4 μL，模板DNA（50 ng/μL）1 μL，10×Buffer（含Mg2+）1 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.2 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，加入無(wú)菌雙蒸餾水至10 μL。PCR反應(yīng)程序包括：95 ℃2 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min，4 ℃保存。

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳與帶型統(tǒng)計(jì)

參照魏利斌等[13]的方法對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行9%聚丙烯酰胺凝膠電泳；銀染法染色，然后照相觀察。DNA Marker 為DL 500 bp DNA Marker（英邁捷公司，中國(guó)）。根據(jù)電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)每個(gè)SSR 引物對(duì)擴(kuò)增后形成的位點(diǎn)，以“1”和“0”分別記錄等位位點(diǎn)的有無(wú)，即：“1”表示“有帶”；“0”表示“無(wú)帶”；“-”表示“缺失”。

1.6 SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)分析

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，統(tǒng)計(jì)并建立24個(gè)SSR 標(biāo)記數(shù)據(jù)矩陣。利用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；采用DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行SSR標(biāo)記方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 48個(gè)芝麻樣本的油分含量分布

本研究選用不同油分含量的48 份芝麻樣本用于SSR 標(biāo)記鑒定。首先，采用近紅外測(cè)定法和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)各芝麻樣本的油分含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果（圖1）顯示，48 個(gè)芝麻樣本的油分含量為29.81%～57.86%，平均油分含量為46.91%。48 個(gè)芝麻樣本的油分含量分布出現(xiàn)2個(gè)峰，分別在油分含量35%～40%和50%～55%區(qū)間。結(jié)合芝麻油分含量水平，把油分含量高于50%的樣本歸為高油組（編號(hào)1—24 號(hào)），低于50%的樣本歸為低油組（編號(hào)25—48號(hào)）。在48 份芝麻樣本中，高油組樣本的油分含量為52.74%～57.86%，平均油分含量54.58%；低油組樣本的油分含量為29.81%～49.16%，平均油分含量39.24%。2組之間的油分含量差異顯著。

圖1 48個(gè)芝麻樣本的油分含量水平分布Fig.1 Distribution characters of oil content in the 48 sesame samples

2.2 SSR標(biāo)記位點(diǎn)類型分布與芝麻樣本油分含量表型相關(guān)關(guān)系分析

選用自主發(fā)掘的與芝麻油分含量和蛋白質(zhì)含量緊密連鎖的24 個(gè)SSR 標(biāo)記[6]，對(duì)上述48 份芝麻樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。電泳后統(tǒng)計(jì)帶型并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)圖2、表1、表2。PCR帶型結(jié)果顯示，24個(gè)SSR 標(biāo)記在48 個(gè)芝麻樣本中均呈現(xiàn)出多態(tài)性特征。條帶數(shù)量為2～6 個(gè)。例如，Hs393 標(biāo)記PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物存在6 個(gè)條帶，其中4 個(gè)為等位變異位點(diǎn)（圖2A），攜帶第1、2、3、4 個(gè)變異位點(diǎn)的樣本分別有7 份、34 份、1 份（油分含量為39.59%）和2 份（表1）。方差分析顯示，在4 個(gè)等位變異位點(diǎn)中，第2 個(gè)等位變異與第1、4 個(gè)等位變異之間均具有極顯著差異（P＜0.001）。結(jié)合樣本表型結(jié)果顯示，攜帶有Hs393（4/2）（即第2 個(gè)等位變異位點(diǎn)）的34 份芝麻樣本平均油分含量為50.08%，其中24 份（64.7%）樣本油分含量高于50%。攜帶有第1、4個(gè)等位位點(diǎn)的芝麻樣本平均油分含量分別為37.61%、39.57%；攜帶有第3個(gè)等位變異的樣本油分含量為39.59%，均屬于低油芝麻樣本。

表1 4個(gè)SSR標(biāo)記在48個(gè)芝麻樣本中的等位變異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析Tab.1 Statistics and significance analysis of allelic variation loci of four SSR markers in the 48 sesame samples

表2 4個(gè)SSR標(biāo)記等位變異位點(diǎn)在48份樣本中的帶型分布統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistical analysis of zonal distribution of allelic variation loci of four SSR markers in the 48 sesame samples

圖2 4個(gè)標(biāo)記在芝麻高/低油樣本中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of four SSR markers in sesame samples with high and low oil content，respectively

Hs635 標(biāo)記的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物存在2 個(gè)等位變異位點(diǎn)（圖2B）。攜帶有第1個(gè)和第2個(gè)等位位點(diǎn)的樣本分別有14份和31份（表1）。2個(gè)等位位點(diǎn)之間存在極顯著差異（P＜0.01）。在表型方面，攜帶Hs635（2/1）（即第1 個(gè)等位位點(diǎn)）的樣本平均油分含量為42.51%；攜帶Hs635（2/2）（即第2 個(gè)變異位點(diǎn)）的樣本平均油分含量為49.63%，其中22 份樣本（71.0%）油分含量大于50%?？梢?jiàn)，Hs635（2/2）標(biāo)記位點(diǎn)與高油分含量性狀存在顯著的連鎖關(guān)系。

對(duì)于Hs4082標(biāo)記，其PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物也存在2個(gè)等位位點(diǎn)變異，且差異顯著（P＜0.05）（圖2C、表1）。其中，攜帶有Hs4082（2/1）和Hs4082（2/2）變異位點(diǎn)的樣本分別有24 份和23 份。帶有Hs4082（2/1）位點(diǎn)的樣本平均油分含量為49.79%，其中18 份（75.0%）樣本的油分含量高于50%；帶有Hs4082（2/2）位點(diǎn)的樣本，平均油分含量為43.98%，其中15份（65.2%）樣本為低油分含量類型?？梢?jiàn)，Hs4082（2/1）標(biāo)記位點(diǎn)與高油分含量性狀存在顯著連鎖關(guān)系。

此外，Hs4089 標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物存在2 個(gè)等位變異類型，且2 個(gè)變異之間存在極顯著差異（P＜0.001）（圖2D、表1）。表型顯示，攜帶Hs4089（2/1）（即第1 個(gè)等位變異位點(diǎn)）的樣本有21 份，平均油分含量為42.14%；帶有Hs4089（2/2）（即第2 個(gè)等位變異位點(diǎn)）的樣本共有24份，平均油分含量為51.41%，其中19 份（79.2%）為高油分含量材料（＜50%）。表明Hs4089（2/2）標(biāo)記位點(diǎn)與高油分含量性狀存在極顯著的連鎖關(guān)系。

2.3 SSR標(biāo)記對(duì)芝麻油分含量性狀鑒定的穩(wěn)定性分析

為進(jìn)一步分析上述SSR 標(biāo)記在芝麻油分含量性狀鑒定中的穩(wěn)定性和可靠性，分析芝麻樣本油分含量表型與4個(gè)SSR 標(biāo)記等位變異位點(diǎn)之間的相關(guān)關(guān)系和頻率。在48 份芝麻樣本中，共有12 個(gè)樣本同時(shí)攜帶有4 個(gè)SSR 標(biāo)記的高油帶型；且12 個(gè)樣本（100%）的油分含量均大于50%，均屬于高油分含量芝麻樣本。12 個(gè)樣本包括漯芝系列、豐芝系列、豫芝系列等高油品種，以及漢冢萬(wàn)莊、新蔡選抗、武昌遲芝麻等地方農(nóng)家種。其中，漯芝16的油分含量最高，為57.86%。在48 個(gè)樣本中，能夠同時(shí)被檢測(cè)到攜帶有3 個(gè)及以上高油帶型的樣本有24 個(gè)，油分含量為46.82%～57.86%，平均油分含量為54.03%。其中22 個(gè)（91.6%）樣本的油分含量高于50%，屬于高油分樣本；油分含量低于50%的材料僅有2個(gè)，分別為墨西哥Yori77-1（油分含量48.19%）和淮陽(yáng)紅芝麻（油分含量46.82%），但其油分含量接近50%。

進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，有10個(gè)樣本被檢測(cè)到同時(shí)攜帶有3 個(gè)及以上的低油帶型，油分含量為32.04%～47.77%，平均油分含量為40.60%。在這10 個(gè)樣本中，有6 個(gè)低油分樣本，分別為湖南岳陽(yáng)芝麻、泥里蹲、冀9014、貴州荔波黑芝麻、鄭黑芝-3和江蘇泰州LZX04，均攜帶有4 個(gè)低油位點(diǎn)標(biāo)記。上述結(jié)果表明，采用與油分含量緊密連鎖的4 個(gè)SSR 標(biāo)記聯(lián)合進(jìn)行芝麻油分含量水平的判定，結(jié)果可靠。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)48 份不同油分含量的芝麻種質(zhì)開(kāi)展了油分含量相關(guān)分子標(biāo)記鑒定與評(píng)價(jià)研究。48 份芝麻種質(zhì)的油分含量為29.81%～57.86%。利用自主創(chuàng)制的與芝麻油分含量緊密連鎖的24個(gè)SSR 標(biāo)記，檢測(cè)了48份芝麻種質(zhì)的標(biāo)記位點(diǎn)類型。結(jié)果顯示，24個(gè)SSR標(biāo)記在48份芝麻樣本中均具有多態(tài)性；其中Hs393（4/2）、Hs635（2/2）、Hs4082（2/1）和Hs4089（2/2）4個(gè)SSR標(biāo)記的高油位點(diǎn)與其他等位位點(diǎn)均具有顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.001）差異，篩選出4個(gè)與高油分緊密關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記位點(diǎn)，表明SSR標(biāo)記可以用于芝麻種質(zhì)油分含量類型的評(píng)價(jià)和鑒定。在檢測(cè)的48 個(gè)樣本中，同時(shí)攜帶這4 個(gè)SSR 標(biāo)記等位變異位點(diǎn)的12 個(gè)樣本（油分含量52.74%～57.86%）均屬于高油分樣本，顯示出SSR 標(biāo)記在評(píng)價(jià)和鑒定特異芝麻種質(zhì)中的重要作用。因此，在今后高油芝麻新品種選育過(guò)程中，可以采用上述SSR標(biāo)記對(duì)低世代材料進(jìn)行快速篩選，以提高育種效率和準(zhǔn)確度[14，18]。此外，本研究通過(guò)上述4個(gè)SSR標(biāo)記鑒定出了漯芝系列、豐芝系列、豫芝系列等一批高油品種以及漢冢萬(wàn)莊、新蔡選抗、武昌遲芝麻等高油地方農(nóng)家種，并篩選出了一批低油分含量種質(zhì)，為今后搭建芝麻分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)體系、選育高油優(yōu)質(zhì)芝麻新品種提供了豐富的材料和方法。本研究為進(jìn)一步完善芝麻分子標(biāo)記輔助育種、加快優(yōu)異新品種品質(zhì)選育提供了技術(shù)支持。

芝麻屬于小粒型高含油量作物。近年來(lái)，芝麻品質(zhì)相關(guān)性狀主要涉及油分含量、蛋白質(zhì)含量、脂肪酸組分以及芝麻素等次生代謝物含量等性狀[1，18]。油分含量、蛋白質(zhì)含量等性狀均屬于數(shù)量性狀，由微效多基因控制[18-19]。LI 等[6]分析顯示，369 份芝麻種質(zhì)的油分含量性狀受基因型與環(huán)境共同影響，基因型的效應(yīng)更大。因此，發(fā)掘與品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL、基因及分子標(biāo)記，對(duì)提高芝麻品質(zhì)育種效率具有重要意義。

芝麻品質(zhì)相關(guān)的遺傳研究主要涉及重要分子標(biāo)記發(fā)掘、QTL 圖譜定位、全基因組關(guān)聯(lián)分析及基因克隆等方面[19-22]。在分子標(biāo)記發(fā)掘與應(yīng)用中，SSR標(biāo)記是指1～6 bp 的短序列重復(fù)序列，大量存在于植物基因組中，因其具有多樣性和重復(fù)性的特點(diǎn)，被廣泛用于農(nóng)作物種質(zhì)及品種的特異性分子鑒定、重要性狀關(guān)聯(lián)分析等工作[23-27]。DIXIT 等[28]首次開(kāi)發(fā)了芝麻SSR 標(biāo)記。在芝麻基因組中，約有110 495個(gè)SSR 存在，其中單核苷酸類（Mononucleotide）和二核苷酸類（Dinucleotide）重復(fù)分別占總量的39.1%和34.3%。根據(jù)文獻(xiàn)所知，目前已發(fā)掘出的與油分含量性狀緊密連鎖的SSR 標(biāo)記共有29 個(gè)[6，11]。其中，LI 等[6]開(kāi)展了369 份芝麻種質(zhì)5 個(gè)環(huán)境下油分含量和蛋白質(zhì)含量的關(guān)聯(lián)分析，確定了24個(gè)SSR 標(biāo)記與油分和蛋白質(zhì)含量緊密連鎖。此外，WU 等[29]依據(jù)SNP 遺傳圖譜開(kāi)展了油分含量、蛋白質(zhì)含量及芝麻素含量3 個(gè)品質(zhì)性狀的QTL 定位，發(fā)掘了5 個(gè)與油分含量緊密關(guān)聯(lián)的QTL 位點(diǎn)，對(duì)表型變異的解釋率為5.2%～18.6%。

近幾年來(lái)，芝麻基因組計(jì)劃及芝麻基因組精細(xì)圖譜的完成為芝麻品質(zhì)相關(guān)性狀遺傳研究提供了重要技術(shù)和信息支撐[19，30-34]。WEI等[17]對(duì)705份芝麻種質(zhì)進(jìn)行了全基因組重測(cè)序和關(guān)聯(lián)分析，研究了包括油分含量等56 個(gè)農(nóng)藝性狀在4 個(gè)不同環(huán)境下的關(guān)聯(lián)SNP 位點(diǎn)分布。ZHOU 等[35]通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析定位了3 個(gè)與油分含量緊密關(guān)聯(lián)的功能基因（NAC，SiTPS1和SiKAS1），為芝麻優(yōu)質(zhì)育種提供了分子元件。今后將進(jìn)一步開(kāi)展芝麻油分含量等品質(zhì)性狀的遺傳解析，以構(gòu)建完善的分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)體系，加快芝麻品質(zhì)育種研究進(jìn)程。