王進(jìn)軍 韋慧仙 鮑飛 于昊

摘要：篩選能高效降解農(nóng)業(yè)廢棄物中的主要成分——木質(zhì)素的菌劑，探究其產(chǎn)酶特性并優(yōu)化產(chǎn)酶條件。采用涂布平板法分離純化得到68株菌種，采用PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基顯色試驗、PDA-苯胺藍(lán)脫色試驗、PDA-氯化錳顯色試驗進(jìn)行初篩，測定Lac、Lip、Mnp活性復(fù)篩。通過內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）測序法鑒定目標(biāo)菌株?；趩我蛩卦囼灪晚憫?yīng)面法對菌株產(chǎn)酶能力（培養(yǎng)時間、溫度、溶解氧及培養(yǎng)基條件等）進(jìn)行研究和優(yōu)化。結(jié)果表明，分離的68株菌種經(jīng)篩選MJ1菌株為目標(biāo)菌株，分子生態(tài)學(xué)鑒定其為藍(lán)狀菌屬真菌Talaromyces siamensis。單因素試驗得出菌株的最佳產(chǎn)Lac、Mnp時間為6 d，產(chǎn)Lip時間為10 d，最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min，接菌量為2%，pH值為5。響應(yīng)面優(yōu)化后確定最佳產(chǎn)酶條件為培養(yǎng)溫度30.11 ℃，接菌量1.66%，pH值5.22，此最優(yōu)條件下Lac、Lip、Mnp 3種酶的活性分別為110.41、118.33、218.4 U。提示菌株MJ1在優(yōu)化后的產(chǎn)酶條件下制得的菌劑能夠促進(jìn)農(nóng)業(yè)廢棄物的高效降解，為生物法大規(guī)模降解木質(zhì)素提供參考，也為后續(xù)其他相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：木質(zhì)素；產(chǎn)酶條件；酶活；響應(yīng)面優(yōu)化；單因素試驗

中圖分類號：S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）16-0210-12

收稿日期：2022-10-27

基金項目：國家自然基金面上項目（編號：81873877）；教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金（編號：20151098）；揚(yáng)州大學(xué)高層次人才科研啟動基金；揚(yáng)州大學(xué)“青藍(lán)工程”項目。

作者簡介：王進(jìn)軍（1979—），男，江蘇海安人，博士，副教授，研究方向為環(huán)境微生物學(xué)。E-mail：wangjinjun@yzu.edu.cn。

木質(zhì)素是自然界最豐富的生物資源，同時其也是農(nóng)業(yè)廢棄物如秸稈等的主要成分^［1-3］。在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，秸稈數(shù)量年產(chǎn)量大，2015年秸稈年產(chǎn)量超10.4 億t，綜合利用潛力達(dá)8.76 億t^［4-5］。木質(zhì)素作為其主要成分未能得到充分利用，且大大阻礙了農(nóng)業(yè)廢棄物的有效降解^［2，6］。處理農(nóng)業(yè)廢棄物的方式多種多樣，據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)顯示，與常見的物理化學(xué)降解法相比，在處理農(nóng)業(yè)廢棄物時采用微生物法具有綠色、清潔和安全的特點(diǎn)，保護(hù)環(huán)境的同時又提高了廢棄物的利用效率^{［3，7］}。在實際生產(chǎn)中也優(yōu)先選用微生物和木質(zhì)素降解酶共同作用于飼草，其中青貯是較為理想的加工方式^［5，8］。木質(zhì)素具有復(fù)雜而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，多與半纖維素以共價鍵的形式緊密結(jié)合，可牢固地黏附在植物的細(xì)胞壁上，起到支撐和保護(hù)作用，因此其難以被降解利用^［9-10］。微生物降解木質(zhì)素是一種通過多種酶共同參與協(xié)同作用的非特異性氧化過程，在參與氧化過程中木質(zhì)素降解酶先進(jìn)行自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，生成高活性的中介物質(zhì)，使木質(zhì)素被氧化為較高的活性自由基，最終形成醌基、醇基等衍生物，又或者產(chǎn)生CO₂，從而實現(xiàn)木質(zhì)素的生物降解^［11-12］。參與降解木質(zhì)素最主要的降解酶為漆酶（Lac）、木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）和錳過氧化物酶（Mnp），其功能各不相同^［13-16］。

本研究選擇從秸稈還田的土壤中取樣，經(jīng)過初篩與復(fù)篩共選出9株菌株，多于目前大多數(shù)學(xué)者的4～7株菌株，篩選出的目的菌株更多，儲備大量能夠高效降解木質(zhì)素的菌種資源。最終鑒別出藍(lán)狀菌屬真菌Talaromyces siamensis MJ1菌株，并對該株菌的產(chǎn)酶能力進(jìn)行探究，后續(xù)基于響應(yīng)面法優(yōu)化高效木質(zhì)素降解菌產(chǎn)酶能力，為高效木質(zhì)素降解菌的產(chǎn)酶發(fā)酵提供思路，為生物法大規(guī)模降解木質(zhì)素提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

土壤樣品采集自揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院水稻秸稈還田和小麥秸稈還田混合土壤的表層土（0～5 cm）。

1.1.2 試驗時間與地點(diǎn)

時間：2021年11月至2022年7月；地點(diǎn)：江蘇省揚(yáng)州市揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院學(xué)行樓微生物實驗室。

1.1.3 培養(yǎng)基

木質(zhì)素分離篩選培養(yǎng)基：木質(zhì)素4.000 g，硝酸銨0.266 g，硫酸鎂0.100 g，磷酸二氫鉀2.000 g，磷酸氫二鈉0.040 g，瓊脂4.000 g，蒸餾水 200 mL，pH值為7.5～8.0。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，氯霉素0.1g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.5～8.0。

PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉10.0 g，葡萄糖40.0 g，氯霉素0.2 g，愈創(chuàng)木酚0.8 mL，磷酸二氫鉀6.0 g，硫酸鎂3.0 g，瓊脂40.0 g，蒸餾水 2 000 mL，pH值為7.5～8.0。

PDA-苯胺藍(lán)培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉10.0 g，葡萄糖40.0 g，氯霉素0.2 g，苯胺藍(lán)0.8 g，磷酸二氫鉀6.0 g，硫酸鎂3.0 g，瓊脂40.0 g，蒸餾水2 000 mL，pH值為7.5～8.0。

PDA-氯化錳培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉10.0 g，葡萄糖40.0 g，氯霉素0.2 g，MnCl₂·4H₂O₂0.3 g，磷酸二氫鉀6.0 g，硫酸鎂3.0 g，瓊脂40.0 g，蒸餾水 2 000 mL，pH值為7.5～8.0。

液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.00 g，硫酸鎂0.50 g，硫酸銅0.05 g，硫酸錳0.05 g，pH值為 7.5～8.0。

上述培養(yǎng)基均經(jīng)過高溫高壓滅菌（121 ℃、0.1 MPa）20 min后使用。

1.1.4 主要試劑和儀器

葡萄糖、瓊脂粉、硝酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、四水合氯化錳、硫酸銅、硫酸銨、硫酸錳、酒石酸、酒石酸鈉、琥珀酸、琥珀酸鈉、冰醋酸等試劑均為國產(chǎn)分析純；木質(zhì)素、苯胺藍(lán)、愈創(chuàng)木酚 、藜蘆醇、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），均購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 木質(zhì)素降解菌株的分離和篩選

1.2.1 菌株的分離和初篩

稱取10 g土樣放入含100 mL無菌水的錐形瓶中，置于搖床，30 ℃、150 r/min 恒溫振蕩30 min，靜置15～20 min，吸取上清液依次從10^-1稀釋至10^-7，分別取各濃度稀釋液500 μL涂布至木質(zhì)素分離篩選培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)7～9 d，挑選出生長較好且菌絲形態(tài)各異的菌株至PDA培養(yǎng)基上，不斷劃線分離直至得到單菌落。采用點(diǎn)種法將單菌落分別接種至PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基、PDA-苯胺藍(lán)培養(yǎng)基、PDA-氯化錳培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)7～9 d，觀察是否產(chǎn)生紅棕色氧化圈、脫色圈、褐棕色顯色圈，并記錄它們的直徑大小，依次驗證是否具有產(chǎn)Lac、Lip、Mnp的能力，篩選出直徑大的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株的復(fù)篩

將上述篩選出來的菌株接種至液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min恒溫振蕩發(fā)酵11 d，測定發(fā)酵液的酶活性。

1.3 粗酶液的制備

取發(fā)酵液2 mL，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

1.4 酶活性測定

Lac活性測定采用ABTS法，Lac活性單位定義：每1 min氧化1 μmol ABTS所需的酶量為1個酶活性單位（U）；Lip活性測定采用藜蘆醇法，Lip活性定義：每1 min氧化1 μmol藜蘆醇所需的酶量為1個酶活性單位（U）；Mnp活性測定：采用MnSO₄法，Mnp活性定義：每1 min將1 μmol Mn²⁺轉(zhuǎn)化為Mn³⁺所需的酶量為1個酶活性單位（U）。

計算公式：

式中：U表示酶活性；ΔD表示吸光度；ξ表示摩爾消光系數(shù)，M·cm；b表示比色皿厚度，cm；Δt表示反應(yīng)時間，min；V_總表示反應(yīng)體系體積，mL；V_酶表示加入酶的體積，mL。

已知420 nm處ABTS摩爾消光系數(shù)ξ₄₂₀=3.6×10⁴L/（mol·cm），340 nm處藜蘆醇摩爾消光系數(shù)ξ₃₄₀=6.5×10³L/（mol·cm）；240 nm處Mn³⁺摩爾消光系數(shù)ξ₂₄₀=6.5×10³L/（mol·cm）。

1.5 菌株鑒定

提取菌株MJ1的DNA，然后對菌株內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，于NCBI數(shù)據(jù)庫將測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對，選取同源性較高的基因序列通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行對比分析。

1.6 菌株MJ1產(chǎn)酶條件的單因素試驗

1.6.1 最佳培養(yǎng)時間

將種子液以1%接菌量接入到產(chǎn)酶培養(yǎng)基，設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，溫度為28 ℃，產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值為7.0。對于Lac活性，設(shè)置培養(yǎng)時間5、6、7、8、9 d；對于Lip活性，設(shè)置培養(yǎng)時間9、10、11、12、13 d；對于Mnp活性，設(shè)置培養(yǎng)時間5、6、7、8、9、10 d。3次平行重復(fù)，確定最佳培養(yǎng)時間。

1.6.2 最佳培養(yǎng)溫度

將種子液以1%接菌量接入到產(chǎn)酶培養(yǎng)基，設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，分別培養(yǎng)測定Lac、Lip、Mnp活性，產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值為7.0。設(shè)置培養(yǎng)溫度為20、25、30、35、40 ℃。3次平行重復(fù)，確定最佳培養(yǎng)溫度。

1.6.3 最佳搖床轉(zhuǎn)速

將種子液以1%接菌量接入到產(chǎn)酶培養(yǎng)基，溫度28 ℃，分別培養(yǎng)、測定Lac、Lip、Mnp活性，產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值為7.0。設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為90、120、150、180、210 r/min。3次平行重復(fù)，確定最佳搖床轉(zhuǎn)速。

1.6.4 最佳接菌量

設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，溫度為28 ℃，分別培養(yǎng)、測定Lac、Lip、Mnp活性，產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值為7.0。設(shè)置種子液接菌量為1.0%、2.0%、4.0%、8.0%、12.0%。3次平行重復(fù)，確定最佳接菌量。

1.6.5 最佳初始pH值

將種子液以1%接菌量接入至產(chǎn)酶培養(yǎng)基，溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為 150 r/min，分別培養(yǎng)測定Lac、Lip、Mnp活性。設(shè)置產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始pH值為4、5、6、7、8。3次平行重復(fù)，確定最佳初始pH值。

1.7 菌株MJ1產(chǎn)酶條件的響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取對Lac、Lip、Mnp活性影響顯著的3個因素，通過Box-Behnken設(shè)計3因素3水平試驗對菌株MJ1的產(chǎn)酶能力進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，確定最佳產(chǎn)酶條件并驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)素降解菌株的分離和篩選

2.1.1 菌株的分離和初篩

分離出68株木質(zhì)素降解菌株的生長情況詳見表1：共29株菌株生長良好，并且長出菌絲，選取備用留做初篩。

PDA-愈創(chuàng)木酚平板顯色反應(yīng)見圖1，顯色結(jié)果見表2，共14株菌株出現(xiàn)氧化圈時間早且出現(xiàn)的氧化圈直徑大，表明它們產(chǎn)Lac的能力較強(qiáng)，選取備用留作進(jìn)一步初篩。

PDA-苯胺藍(lán)平板脫色反應(yīng)見圖2，脫色結(jié)果見表3，共11株菌株出現(xiàn)脫色圈時間早且出現(xiàn)的脫色圈直徑大，表明它們產(chǎn)Lip、Mnp的能力較強(qiáng)，選取備用留作進(jìn)一步初篩。

PDA-氯化錳平板顯色反應(yīng)見圖3，顯色結(jié)果見表4，共9株菌株出現(xiàn)顯色圈時間早且出現(xiàn)的氧化圈直徑大，表明它們產(chǎn)Mnp的能力較強(qiáng)，選取備用留作后續(xù)試驗菌株。

2.1.2 菌株的復(fù)篩

于培養(yǎng)3、7、11 d后測定菌株的Lac、Lip、Mnp酶活結(jié)果，由圖4～圖6可知，菌株MJ1的Lac最大活性顯著高于其他菌株，最大值為62.49 U；菌株MJ1的Lip最大活性顯著高于其他菌株，最大值為79.22 U；由圖6可知，菌株MJ1的MnP最大活性顯著高于其他菌株，最大值為 153.63 U。因此，選取菌株MJ1作為后續(xù)研究的目的菌株。

2.2 菌株鑒定

將測序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，選取與目的菌株相似性高的菌株，通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖7可知，菌株MJ1和藍(lán)狀菌屬（Talaromyces）真菌在系統(tǒng)發(fā)育樹中處于同一支，經(jīng)比對，菌株MJ1與Talaromyces siamensis A3S2-40（KJ767055）菌株的同源性達(dá)99%，因此，菌株MJ1與藍(lán)狀菌屬的親緣關(guān)系最近，初步鑒定MJ1為藍(lán)狀菌屬真菌Talaromyces siamensis MJ1。

2.3 菌株MJ1產(chǎn)酶條件的單因素試驗結(jié)果

由圖8可知，不同培養(yǎng)時間對菌株的Lac、Lip、Mnp活性有極大影響，且影響趨勢均先上升后下降。 Lac活性培養(yǎng)至6 d時達(dá)最大值，為74.86 U；Lip活性培養(yǎng)至10 d時達(dá)最大值，為86.53 U；Mnp活性培養(yǎng)至6 d時達(dá)最大值，為164.29 U。因此，后續(xù)分別在6、10、6 d測定Lac、Lip、Mnp的活性。

由圖9可知，不同培養(yǎng)溫度對菌株的Lac、Lip、Mnp活性影響很大，溫度范圍在25～35 ℃之間時，3種酶的活性均較大，在30 ℃時，3種酶的活性均達(dá)最佳，分別為83.00、94.49、185.13 U。因此，選取25～35 ℃進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面試驗。

由圖10可知，不同搖床轉(zhuǎn)速對菌株的Lac、Lip、Mnp活性影響很大，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min時，3種酶的活性達(dá)最佳，分別為83.17、97.94、180.22 U。因此，后續(xù)試驗的搖床轉(zhuǎn)速統(tǒng)一設(shè)定為120 r/min。

由圖11可知，不同接菌量對菌株的Lac、Lip、Mnp活性影響很大，接菌量范圍在1%～4%之間時，3種酶的活性均較大，接菌量為2%時，3種酶的活性均達(dá)頂峰，分別為95.15、104.85、194.40 U。因此，選取1%～4%接菌量作為后續(xù)的響應(yīng)面試驗范圍。

由圖12可知，產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始pH值不同，Lac、Lip、Mnp的活性也不同，pH值范圍在4～6之間時，3種酶的活性均較大，pH值為5時，3種酶的活性均達(dá)最佳，分別為93.71、110.53、193.34 U。因此，產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值選取4～6進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面試驗。

2.4 菌株MJ1產(chǎn)酶條件的響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.4.1 模型的建立及顯著性檢驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，由表5、表6可知，選取對MJ1的Lac、Lip、Mnp活性影響較大的3個因素：溫度（25、30、35 ℃）、接菌量（1.0%、2.5%、4.0%）、產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始pH值（4、5、6）進(jìn)行Box-Behnken試驗，分別以Lac、Lip、Mnp活性大小為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，Box-Behnken試驗因素及水平設(shè)置見表5，試驗結(jié)果見表6。

利用Design Expert（Version 8.0.6）進(jìn)行多元擬合，得到回歸方程。其中，Lac活性回歸方程為Y=104.73+0.66A-2.00B+8.46C+0.57AB+3.16AC-0.89BC-26.42A²-1.84B²-17.96C²；Lip活性回歸方程為Y=118.79+0.47A-1.94B+5.08C+0.82AB+3.02AC-1.07BC-20.68A²-2.84B²-15.87C²；Mnp活性回歸方程為Y=118.79+0.47A-1.94B+5.08C+0.82AB+3.02AC-1.07BC-20.68A²-2.84B²-15.87C²。

對上述方程進(jìn)行方差和顯著性分析，由表7～表9可知，Lac、Lip、Mnp活性對應(yīng)模型的P值<0.000 1，表明影響極顯著；失擬項P>0.05，不顯著，表明模型可靠性較高；模型決定系數(shù)R²>0.9，模型矯正系數(shù)R²_adj>0.9，R²_adj與模型判定系數(shù)R²_pred兩者的差<0.2，表明模型與試驗情況擬合度高；信噪比（S/N）>4，從另一個角度表明模型可靠，利用該模型方程預(yù)測菌株MJ1的最佳產(chǎn)酶條件。方差分析結(jié)果表明，各因素對Lac活性的影響表現(xiàn)為因素C>因素B>因素A，即pH值>接菌量>培養(yǎng)溫度。一次項A、B、C對結(jié)果影響極顯著（P<0.01）， 交互項AC對結(jié)果影響極顯著（P<0.01），BC對結(jié)果影響顯著（P<0.05），二次項A²、B²、C²對結(jié)果影響極顯著（P<0.01）；各因素對Lip活性的影響表現(xiàn)為因素C>因素B>因素A，即pH值>接菌量>培養(yǎng)溫度。一次項B、C對結(jié)果影響極顯著（P<0.01），交互項AC對結(jié)果影響極顯著（P<0.01），BC對結(jié)果影響顯著（P<0.05），二次項A²、B²、C²對結(jié)果影響極顯著（P<0.01）；各因素對Mnp活性的影響表現(xiàn)為因素C>因素B>因素A，即pH值>接菌量>培養(yǎng)溫度。一次項B、C對結(jié)果影響極顯著（P<0.01），交互項AC、BC對結(jié)果影響極顯著（P<0.01），二次項A²、C²對結(jié)果影響極顯著（P<0.01）。

2.4.2 響應(yīng)面分析

由培養(yǎng)溫度、接菌量、pH值3個因素間的交互作用對Lac、Lip、Mnp活性大小影響的響應(yīng)面曲線及等高線（圖13～圖21）可知，接菌量和培養(yǎng)溫度交互作用對Lac、Lip、Mnp活性影響等高線呈閉合的橢圓形，表明交互作用對Lac、Lip、Mnp活性影響顯著，固定pH值，Lac、Lip、Mnp活性隨著接菌量和培養(yǎng)溫度的升高呈先上升再下降的趨勢，溫度范圍為 29～31 ℃，接菌量范圍為 2.2%～2.8%時，3種酶活性達(dá)最大值；培養(yǎng)溫度和pH值交互作用對Lac、Lip、Mnp活性影響等高線趨近于圓形，表明交互作用對Lac、Lip、Mnp活性影響不顯著，固定接菌量，Lac、Lip、Mnp活性隨著溫度和pH值的升高呈先上升再下降的趨勢，溫度范圍為29～31 ℃，pH值范圍為4.5～5.5時，3種酶活性達(dá)最大值；接菌量和pH值交互作用對Lac、Lip、Mnp活性影響等高線呈閉合的橢圓形，表明交互作用對Lac、Lip、Mnp活性影響顯著，固定溫度，Lac、Lip、Mnp活性隨著接菌量和pH值的升高同樣呈先上升再下降的趨勢，接菌量范圍為2.2%～2.8%，pH值范圍為4.5～5.5時，3種酶活性達(dá)最大值。

利用軟件DesignExpert（Version 8.0.6）求解響應(yīng)值Y₁、Y₂、Y₃所對應(yīng)的3種模型，得出產(chǎn)Lac、Lip、Mnp 3種酶同時達(dá)最優(yōu)的條件為：溫度30.11 ℃、接菌量1.66%、pH值為5.22，此時，Lac、Lip、Mnp 3種酶活性分別為109.39、119.47、227.75 U。為驗證響應(yīng)面優(yōu)化的可靠性，采用上述條件進(jìn)行試驗，因考慮試驗中現(xiàn)實操作情況，將優(yōu)化條件修正為：溫度30.1 ℃、接菌量1.66%、pH值為5.2，得到Lac、Lip、Mnp 3 種酶活性分別為110.41、118.33、218.40 U，和模型預(yù)測的結(jié)果相差較小，因此，采用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法對菌株MJ1的產(chǎn)酶能力進(jìn)行優(yōu)化具有可行性，具有一定的實際應(yīng)用價值。

3 討論與結(jié)論

在秸稈還田的表層土壤中，能降解木質(zhì)素的微生物分布廣泛，因此研究從秸稈還田的試驗田中采集樣品。篩選能夠降解木質(zhì)素的微生物方法多種多樣，本研究的篩選方法基于其他學(xué)者的研究，并結(jié)合自身試驗環(huán)境特點(diǎn)而制定。試驗中制備以木質(zhì)素為唯一碳源的培養(yǎng)基，分離、初篩出具有木質(zhì)素降解能力的菌株共68株，通過顯色試驗及褪色試驗復(fù)篩出具有較強(qiáng)木質(zhì)素降解能力的菌株共9株。王福玲等通過配置富集培養(yǎng)基、顯色試驗進(jìn)行分離和初篩，測定酶活性大小進(jìn)行復(fù)篩^［17-18］；韓月穎等則是直接通過顯色培養(yǎng)基進(jìn)行分離和初篩，測定酶活性大小進(jìn)行復(fù)篩^［19-20］。本研究相較于以上研究的優(yōu)勢在于篩選出的目的菌株更多，可供后續(xù)研究選擇的菌株更多，研究內(nèi)容涵蓋面廣泛。微生物降解木質(zhì)素能力的強(qiáng)弱一般通過分泌木質(zhì)素水解酶的能力來決定，木質(zhì)素水解酶系主要由Lac、Lip、Mnp組成。根據(jù)分泌3種水解酶能力的大小進(jìn)一步從9株菌株中篩選出木質(zhì)素降解能力最強(qiáng)的菌株，并通過生物學(xué)鑒定為藍(lán)狀菌屬真菌，命名為Talaromyces siamensis MJ1。李雅琳等從園林綠化廢棄物中篩得的菌株經(jīng)鑒定為栓菌屬真菌^［21］；劉劍等從腐爛的竹材中篩得的菌株經(jīng)鑒定為雜色云芝^［22］；尹靜等從腐質(zhì)土中篩得的菌株經(jīng)鑒定為粉紅黏帚霉^［23］，這些均表明自然界可降解木質(zhì)素的真菌種類繁多，從不同樣品中篩得的菌株種類各異，不同種類的菌株分泌3種水解酶的能力也大相徑庭^［24］。

不同環(huán)境下菌株分泌木質(zhì)素水解酶的能力有所差異，本研究通過單因素試驗得到：菌株的最佳產(chǎn)Lac、Mnp時間為6 d，最佳產(chǎn)Lip時間為10 d，MJ1菌株最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為 120 r/min，最適接菌量為2%，最適pH值為5時，菌株的3種水解酶活性達(dá)最大值，各種條件下培養(yǎng)的菌株3種水解酶中Mnp活性均顯著高于另外2種酶的活性。姜明國等篩選出來的菌株通過試驗得出最佳產(chǎn)Lac時間為15 d，最佳產(chǎn)Lip的時間為 9 d，而Mnp活性一直很低，每天幾乎無變化，3種水解酶中Lac活性顯著高于另外2種酶的活性^［25］；從李新鑫等對其篩選的菌株通過產(chǎn)酶性質(zhì)研究得出Lac活性在15 d達(dá)峰值，Mnp活性在23 d達(dá)峰值，而整個產(chǎn)酶周期中，Lip活性一直很低，每天幾乎無變化，Lac活性在3種水解酶中要顯著高于另外2種水解酶的活性^［18］；王茂成等的目的菌株Lac、Lip、Mnp最大活性均出現(xiàn)在9 d，整體上Lac活性均顯著高于Lip、Mnp的活性，目的菌株的最適培養(yǎng)溫度為20 ℃和30 ℃^［26］。結(jié)合多人試驗研究推測不同的產(chǎn)酶培養(yǎng)基、生長環(huán)境、目的菌株的篩選條件等均會對木質(zhì)素降解菌最佳產(chǎn)水解酶時間產(chǎn)生很大影響，不同目的菌株分泌各個木質(zhì)素水解酶的能力不同，產(chǎn)Lac能力強(qiáng)的菌株，降解木質(zhì)素時木質(zhì)素降解酶系中Lac相應(yīng)地會參與更多，產(chǎn)Mnp能力更強(qiáng)的菌株，降解時Mnp相應(yīng)地就會參與更多。此外，不同的木質(zhì)素降解菌株在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)酶能力會有很大的不同，因此需要為這些菌株創(chuàng)造對應(yīng)的良好培養(yǎng)條件。

通過響應(yīng)面優(yōu)化后MJ1菌株的最適培養(yǎng)溫度為30.11 ℃，最適接菌量為1.66%，最適pH值為5.22，通過回歸方程預(yù)測最優(yōu)條件下的最佳酶活性大小與實際試驗得出的結(jié)果相差較小，表明優(yōu)化結(jié)果可靠，且3種水解酶活性具有顯著提升。李靈靈等通過響應(yīng)面優(yōu)化法，使菌株對木質(zhì)素的降解率從24.1%提高到了32.8%^［27］；韓月穎等也通過響應(yīng)面優(yōu)化法使菌株的產(chǎn)Lac、Lip、Mnp能力得到顯著提高^［19］；泊翠翠通過響應(yīng)面優(yōu)化法使Lac活性提高0.54倍，Mnp活性提高0.3倍^［28］。這些研究表明通過響應(yīng)面優(yōu)化法可極大地使菌株的產(chǎn)酶能力得到提高，從而能夠更快地降解木質(zhì)素。優(yōu)化過程及結(jié)果對菌株降解木質(zhì)素的實際應(yīng)用具有指導(dǎo)意義，也對功能菌的具體應(yīng)用提供參考。

綜上所述，本研究篩選出的MJ1菌株產(chǎn)酶效果顯著，能高效降解木質(zhì)素，為農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈等的資源化利用提供了試驗依據(jù)。

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