李威，唐云云，彭娟，蔣訓(xùn)歸

（1.湖南省永州市中心醫(yī)院 肛腸疝外科，湖南 永州 425006；2.永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 公共基礎(chǔ)學(xué)部，湖南 永州 425100）

結(jié)直腸癌為消化道常見的惡性腫瘤之一[1]，2020年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)量超過193 萬例，占全球新確診惡性腫瘤例數(shù)的9.7%，約占全球癌癥死亡病例的9.4%[2]。研究[3-4]顯示，早期結(jié)直腸癌患者5年生存率可達(dá)90%，但晚期患者的中位生存期往往不足2年。因此結(jié)直腸癌患者的早期診斷及治療就顯得格外重要，近年來各種特異度強(qiáng)、敏感度高及侵襲性低的非編碼RNA 生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)并運(yùn)用于臨床[5]，該類生物標(biāo)志物的功能研究及運(yùn)用將對(duì)結(jié)直腸癌的臨床診治具有重要意義。

非編碼RNA 是一類重要的癌癥生物學(xué)調(diào)節(jié)因子，其中環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞內(nèi)非編碼RNA[6]。circRNA無3'-頭或5'-尾的結(jié)構(gòu)，該類環(huán)狀結(jié)構(gòu)在多種人類細(xì)胞中大量存在，其具有數(shù)十萬個(gè)堿基，且可通過多種機(jī)制調(diào)控或改變多種重要基因的功能及表達(dá)，包括與蛋白質(zhì)結(jié)合、 阻斷微小RNA（microRNA，miRNA），甚至編碼低分子量蛋白質(zhì)等[7]。隨著現(xiàn)今circRNA 測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法的發(fā)展，越來越多的circRNA 被發(fā)現(xiàn)[8]。研究[9-10]顯示circRAD18 可促進(jìn)三陰性乳腺癌的增殖、通過多條生物軸調(diào)控乳腺癌的進(jìn)展，也可促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的惡性進(jìn)展。目前circRAD18 在結(jié)直腸癌中的功能及可能的生物學(xué)作用尚無報(bào)道。筆者前期通過circinteractome 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)circRAD18 與miR-516b 存在結(jié)合位點(diǎn)，而丙酮酸脫氫酶激酶1（pyruvate dehydrogenase 1，PDK1）可能是miR-516b 的靶基因。本研究以上述研究背景為基礎(chǔ)，初步探討circRAD18 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及作用，及其對(duì)靶miR-516b 及PDK1 的調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要材料

Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑、 TRIzol 試劑、RIPA 裂解液、PMSF （Thermo，美國(guó)，L3000001、15596026、89901、36978），DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素（Gibco，美國(guó)，11965092、10100147、15140122），PDK1 和β-actin 抗體（Abcam，美國(guó)，ab202468、 ab8226），Anti-Ago2 抗體（Millipore，USA，03-110），RNA 抽提試劑盒 （Applied Biosystems，USA，AM1835）、TaqMan 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（4366597）、 qSYBR-Green-containing PCR 試劑盒（4349182），RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒（Millipore，USA，17-371），雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒（Qiagen，USA，59934），葡萄糖/葡萄糖氧化酶檢測(cè)試劑盒Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit（Invitrogen，USA，A22189）、乳酸檢測(cè)試劑盒（Sigma，美國(guó)，MAK065），血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（16×25 格），紫外可見分光光度計(jì)（Thermo，Nanodrop 2000，USA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、SW620、HT-29 及正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞NCM460 （ATCC 來源）均根據(jù)供應(yīng)商提供的說明書培養(yǎng)于含10% FBS的培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞均置于37 ℃，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。miR-516b 模擬物及其對(duì)照miR-CTR、circRAD18 敲除siRNA（si-circRAD18）及其對(duì)照（si-circCON）均由美國(guó)的Invitrogen 公司設(shè)計(jì)、構(gòu)建及合成。突變型circRAD18-wt、PDK1-wt及野生型circRAD18-mut、PDK1-mut 的熒光素酶報(bào)告基因載體均由GeneCopoeia 公司構(gòu)建。

1.2.2 circRAD18 敲除及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染收集細(xì)胞，用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液稀釋，吹打制成104/mL的細(xì)胞懸液，6 孔板中每孔鋪2 mL 細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞匯合度約60%～80%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染，用無菌EP 管配制lipofectamin 3000 和轉(zhuǎn)染試劑；兩者混勻并室溫放置20 min。將上述混合物加入到無血清培養(yǎng)液（不含抗生素）中混勻，加入到待轉(zhuǎn)染的6 孔中；置于培養(yǎng)箱中，6 h 后換成常規(guī)培養(yǎng)基。48 h 后，收集細(xì)胞并抽提蛋白或進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)。si-circRAD18 序列為：5'-AAU CAG ACU GCU CUC UCU GUA-3'；其對(duì)照序列si-circCON 為：5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'。

1.2.3 RNA 提取和qRT-PCR 檢測(cè)TRIzol 裂解液、氯仿、1∶2 的異丙醇-TRIzol、75%乙醇及4 ℃離心機(jī)用于細(xì)胞及組織的RNA 提取，提取的RNA 在紫外可見分光光度計(jì)上檢測(cè)合格后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。以提取的?xì)胞或組織總RNA 為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書及qSYBR-Green-containing PCR 試劑盒的說明書進(jìn)行操作，進(jìn)行相對(duì)定量（BioRad IQTM5 Multicolor 實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)，美國(guó)）。其中miR-516b 引物由Invitrogen 公司合成，U6 為內(nèi)參，2-ΔΔCT用于相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算，其中ΔΔCT=（CTmiRNA-CTU6）靶基因-（CTmiRNA-CTU6）對(duì)照。反應(yīng)體系為20 μL，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。circRAD18 的引物堿基序列正向：5'-CAG CTC ATT AAA AGG CAC CA-3'，反向：5'-CAC ACA GCA AGT TGG ACA CTG-3'；內(nèi)參U6 的引物序列正向：5'-TTA TGG GTC CTA GCC TGA C-3'，反向：5'-CAC TAT TGC GGG TCT GC-3'。

1.2.4 CCK-8 細(xì)胞增殖將結(jié)直腸癌細(xì)胞經(jīng)0.25%的胰酶消化后，將si-circRAD18 （細(xì)胞密度調(diào)至5×103/mL） 和si-circCON 細(xì)胞（細(xì)胞密度調(diào)至5×103/mL）置于96 孔板中。將培養(yǎng)板在37 ℃下孵育一定時(shí)間，然后加入CCK-8 溶液（10 μL），于450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值。

1.2.5 葡萄糖消耗和乳酸含量的測(cè)量將細(xì)胞接種到12 孔板中，每孔接種3×105個(gè)細(xì)胞。24 h 后收集培養(yǎng)基，并儲(chǔ)存在-20 C°備用，直到進(jìn)行測(cè)定。分別根據(jù)葡萄糖/葡萄糖氧化酶檢測(cè)試劑盒Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit 和乳酸檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29中上清液中葡萄糖的消耗量及乳酸的產(chǎn)生量。分別檢測(cè)563 nm 及460 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值，并將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為與對(duì)照細(xì)胞相比的總蛋白量。

1.2.6 熒光素酶活性檢測(cè)驗(yàn)證miR-516b 與circRAD18 結(jié)合的熒光素酶實(shí)驗(yàn)分為4 組，分別為：miR-516b 與circRAD18-wt、miR-CTR 與circRAD18-wt、miR-516b 與circRAD18-mut、miR-CTR 與circRAD18-mut；驗(yàn)證miR-516b 與PDK1 結(jié)合的熒光素酶實(shí)驗(yàn)也分為4 組，miR-516b 與PDK1-wt、miR-CTR 與PDK1-wt、miR-516b 與PDK1-mut、miR-CTR 與PDK1-mut。按上述分組分別轉(zhuǎn)染HT-29 細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞。根據(jù)試劑商提供的試劑盒說明書進(jìn)行操作。相對(duì)熒光素酶活性為熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性值，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔（Biorad 單光子檢測(cè)儀，美國(guó)），驗(yàn)證circRAD18 與miR-516b 及miR-516b 與PDK1 之間的結(jié)合關(guān)系。

1.2.7 RNA 免疫沉淀（RIP）在RIP 分析之前，先使 用 MS2bs-circRAD18、 MS2bs-circRAD18-mt 和MS2bs-Rluc（對(duì)照載體）轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞。RIP實(shí)驗(yàn)根據(jù)RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒、anti-Ago2抗體的說明書進(jìn)行操作，miR-516b 需富集純化后檢測(cè)。也被使用，PDK1 mRNA、circRAD18 和miR-516b 均采用相對(duì)定量。

1.2.8 Western blot 分析從HT-29 細(xì)胞中分離蛋白質(zhì)（RIPA 裂解液、PMSF），收集蛋白，用于SDSPAGE 凝膠分離。蛋白質(zhì)在300 mA 條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，2 h 后將膜轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱，并用PDK1 抗體處理過夜，次日于室溫下使用特異性二抗孵育1 h。其中PDK1 和β-actin 抗體的使用濃度為1∶1 000。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 20.0 軟件用于數(shù)據(jù)的記錄與分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，t檢驗(yàn)用于組間數(shù)據(jù)比較，單因素方差分析用于多組間數(shù)據(jù)比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circRAD18在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及功能

采用qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)直腸癌及正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞中circRAD18 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，相對(duì)正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞NCM460，circRAD18 在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)均明顯上調(diào)（均P＜0.05）（圖1A）。為進(jìn)一步探究circRAD18 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝的影響，使用靶向circRAD18 的siRNA 來敲低結(jié)直腸癌細(xì)胞中circRAD18 的表達(dá)。si-circRAD18 的敲低效率在HT-29 結(jié)直腸癌細(xì)胞系中得到驗(yàn)證（圖1B）。CCK-8 增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示circRAD18 的下調(diào)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力（圖1C）。另外通過檢測(cè)葡萄糖攝取量和乳酸產(chǎn)生量，發(fā)現(xiàn)circRAD18 的沉默可以明顯抑制結(jié)直腸癌中的細(xì)胞葡萄糖攝取及乳酸產(chǎn)生，且其對(duì)正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞NCM460 則沒有影響（P＞0.05）（圖1D-E）。

圖1 circRAD18在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及功能 A：circRAD18在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)；B：轉(zhuǎn)染si-circRAD18后的沉默效能分析；C：CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖；D：細(xì)胞葡萄糖攝取量檢測(cè)；E：細(xì)胞乳酸產(chǎn)生量檢測(cè)Figure 1 Expression and function of circRAD18 in colorectal cancer A:Relative expression of circRAD18 in colorectal cancer cell lines;B:Analysis of silencing efficiency after transfection with si-circRAD18;C:Cell proliferation assessment using CCK-8 assay;D:Measurement of cellular glucose uptake;E:Measurement of cellular lactate production

2.2 結(jié)直腸癌中circRAD18對(duì)miR-516b的作用

在分離結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29 的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核部分后，通過qPCR 檢測(cè)明確了circRAD18 的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示circRAD18 主要存在于結(jié)直腸癌細(xì)胞的胞質(zhì)中，也是miRNA 所處的主要位置，表明兩者之間存在相互作用（圖2A）。根據(jù)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，circRAD18 序列上可能存在2 個(gè)與miR-516b 結(jié)合的位點(diǎn)（圖2B）。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)circRAD18 能夠與miR-516b 相互作用（圖2C）。隨后為進(jìn)一步驗(yàn)證，進(jìn)行了MS2 相關(guān)的RIP 實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證circRAD18 和miR-516b 之間的直接相互作用關(guān)系，結(jié)果顯示miR-516b 在MS2bscircRAD18 組明顯富集（圖2D）。

圖2 circRAD18 與miR-516b 的關(guān)系 A：細(xì)胞不同部位中circRAD18、RAD18 mRNA、GAPDH 和18S 的相對(duì)比例；B：circRAD18序列中miR-516b的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)；C：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-516b模擬物和circRAD18之間的相互作用；D：MS2相關(guān)的RⅠP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合關(guān)系Figure 2 Relationship between circRAD18 and miR-516b A:Relative proportions of circRAD18,RAD18 mRNA,GAPDH,and 18S in different cellular compartments;B:Predicted binding sites of miR-516b in the circRAD18 sequence;C:Dualluciferase reporter gene assay to investigate the interaction between miR-516b mimic and circRAD18;D:MS2-related RⅠP experiment to validate the binding relationship

2.3 circRAD18對(duì)下游PDK1的調(diào)節(jié)作用

TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)PDK1 是miR-516b 的下游靶基因（圖3A）。PDK1 是葡萄糖攝取過程中的一種代謝蛋白，多項(xiàng)研究證實(shí)其為一種癌基因，并在多種惡性腫瘤中存在過度表達(dá)，對(duì)癌癥進(jìn)展至關(guān)重要。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-516b 能夠直接結(jié)合PDK1 mRNA 的3'-UTR （圖3B）。轉(zhuǎn)染miR-516b 模擬物后，結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29 中PDK1的相對(duì)表達(dá)量明顯降低（圖3C），對(duì)AGO2 蛋白相關(guān)的RISC 復(fù)合物進(jìn)行RIP 檢測(cè)，結(jié)果顯示circRAD18、PDK1 和miR-516b 均聚集在抗Anti-Ago2組中（圖3D）。circRAD18 沉默可導(dǎo)致PDK1 向的RISC 聚集明顯增加（圖3E）。

圖3 miR-516b與PDK1的關(guān)系及circRAD18的調(diào)節(jié)作用 A：TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)PDK1與miR-516b相互作用的mRNA 3'-UTR序列；B：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-516b模擬物和PDK1之間的相互作用；C：qRT-PCR分析miR-516b對(duì)PDK1的作用；D：circRAD18、PDK1和miR-516b在Ago2上的聚集；E：circRAD18沉默后，circRAD18與Ago2結(jié)合的豐度降低，而PDK1增加Figure 3 Relationship between miR-516b and PDK1 and the regulatory role of circRAD18 A:TargetScan database prediction of mRNA 3'-UTR sequences for the interaction between PDK1 and miR-516b;B:Dual-luciferase reporter gene assay to validate the interaction between miR-516b mimic and PDK1;C:qRT-PCR analysis of the effect of miR-516b on PDK1;D:Aggregation of circRAD18,PDK1,and miR-516b on Ago2;E:Decreased abundance of circRAD18 binding to Ago2 and increased PDK1 after circRAD18 silencing

2.4 circRAD18-miR-516b-PDK1 軸對(duì)結(jié)直腸癌代謝重編程的影響

通過檢測(cè)葡萄糖攝取量和乳酸產(chǎn)生量，發(fā)現(xiàn)用miR-516b 模擬物及si-circRAD18 轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌HT-29 細(xì)胞，可明顯降低細(xì)胞葡萄糖的攝取率及乳酸產(chǎn)生量，且這種降低均可被PDK1 的補(bǔ)充所逆轉(zhuǎn)（均P＜0.05）（圖4A-B）。另外，miR-516b 模擬物或si-circRAD18 的引入可以明顯降低PDK1 的蛋白表達(dá)，且該過程可通過補(bǔ)充PDK1 蛋白來逆轉(zhuǎn)（均P＜0.05）（圖4C）。

圖4 circRAD18-miR-516b-PDK1 軸在直腸癌細(xì)胞中的作用 A：miR-516b 模擬物及si-circRAD18 的轉(zhuǎn)染可抑制細(xì)胞葡萄糖攝取，PDK1 過表達(dá)后，葡萄糖攝取水平可恢復(fù)；B：miR-516b 模擬物及si-circRAD18 的轉(zhuǎn)染可抑制細(xì)胞乳酸產(chǎn)生，PDK1 過表達(dá)后，乳酸產(chǎn)生水平可恢復(fù)；C：miR-516b 模擬物及si-circRAD18 的引入可以降低PDK1 的蛋白表達(dá)，補(bǔ)充PDK1可逆轉(zhuǎn)Figure 4 The role of the circRAD18-miR-516b-PDK1 axis in colorectal cancer cells A:Transfection with miR-516b mimic and si-circRAD18 can inhibit cellular glucose uptake,and the overexpression of PDK1 can restore glucose uptake levels;B:Transfection with miR-516b mimic and si-circRAD18 can inhibit cellular lactate production,and the overexpression of PDK1 can restore lactate production levels;C:Ⅰntroduction of miR-516b mimic and si-circRAD18 can reduce the protein expression of PDK1,and supplementation with PDK1 can reverse this effect

3 討論

隨著高通量測(cè)序等多種生物信息學(xué)前沿技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的circRNA 被發(fā)現(xiàn)，并被深入研究[11]。研究[12-13]顯示，5.8%～23%的具有轉(zhuǎn)錄活性的人類基因可產(chǎn)生circRNA，且這些circRNA在不同的組織及細(xì)胞類型間可保持動(dòng)態(tài)平衡。circRNA 在哺乳動(dòng)物中表達(dá)是高度保守的，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其對(duì)RNase R 具有抗性，且結(jié)構(gòu)比相應(yīng)的線性RNA 要更穩(wěn)定[14]。circRNA 可作為miRNA 海綿發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，circRNA 具有miRNA 的結(jié)合位點(diǎn)，常作為miRNA 的活性調(diào)節(jié)者參與多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展；circRNA 可與RBPs 相互作用，其通過結(jié)合、儲(chǔ)存或隔離RBP 到特定的亞細(xì)胞位置從而發(fā)揮作用；circRNA 也可發(fā)揮轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接的調(diào)節(jié)的功能，其位于核內(nèi)的circRAN 及外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA （Exon-intron circular RNA，ElciRNA） 可在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮功能；另外circRNA 也可以直接發(fā)揮翻譯功能，部分circRNA 具有直接編碼蛋白的能力，可翻譯蛋白[15-18]。研究顯示，circRNA 在血液及其他體液中均具有較高的穩(wěn)定性，因此circRNA也是多種疾病診斷的潛在生物標(biāo)志物。

研究[18]顯示，circAGO2 可通過促進(jìn)RISC HUR而促進(jìn)多種癌癥的進(jìn)展。circ133 及circHIPK3 是結(jié)直腸癌中的重要調(diào)控因子[19-20]。circITCH 被證實(shí)是癌癥中的腫瘤抑制因子[21]，circFAM120A 被證實(shí)可通過抑制FAM120A 與IGF2BP2 的結(jié)合而促進(jìn)細(xì)胞的增殖[22]。但迄今為止，關(guān)于circRNA 在結(jié)直腸癌中作用和功能的研究較少，關(guān)于circRAD18 在結(jié)直腸癌中的研究目前未見報(bào)道。研究顯示，circRAD18 在乳腺癌中高表達(dá)且敲除circRAD18 可抑制乳腺癌的進(jìn)展，該過程可能是通過調(diào)節(jié)miR-613/HK2 軸來實(shí)現(xiàn)的[23]，circRAD18 也可通過海綿吸附miR-208a/3164 調(diào)節(jié)IGF1 和FGF2 的表達(dá)來促進(jìn)三陰性乳腺癌進(jìn)展[24]。本研究發(fā)現(xiàn)circRAD18 在結(jié)直腸組織及細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，且敲除circRAD18 顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力，該結(jié)果與上述乳腺癌中circRAD18 高表達(dá)及對(duì)腫瘤的促進(jìn)作用一致。研究顯示circRAD18 還可促進(jìn)急性髓系白血病細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程，并抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯，在急性髓系白血病中扮演癌基因的結(jié)果[23]，另外circRAD18 也可促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力[10]，說明circRAD18 可在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用。

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及RIP 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證證實(shí)circRAD18 可與miR-516b 結(jié)合，而PDK1 是miR-516b的下游靶基因。即circRAD18-miR-516b-PDK1 軸在結(jié)直腸癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)circRAD18 參與了結(jié)直腸癌的葡萄糖代謝重編程過程，circRAD1 的沉默顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生，表明circRAD18 可直接阻斷其下游的miR-516b，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞通過刺激葡萄糖代謝蛋白PDK1 的表達(dá)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展。上述結(jié)果與已有研究[10]上調(diào)的circRAD18 通過甲狀腺乳頭狀癌的葡萄糖代謝重編程促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展相一致。

研究顯示，miR-516b 是重要的腫瘤抑制因子，其在骨肉瘤中表達(dá)下調(diào)[25]，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，circCDC45 的表達(dá)顯著上調(diào)，其可通過阻斷miR-516b 而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[26]。另外長(zhǎng)鏈非編碼RNA Linc-01123 可通過miR-516b-5p/Gli1 軸調(diào)控Hedgehog 通路而影響骨肉瘤的進(jìn)程[27]。在天然產(chǎn)物和傳統(tǒng)中藥提取物相關(guān)的研究中，作為一個(gè)已經(jīng)被證實(shí)的miR-516b 靶標(biāo)，PDK1 被報(bào)道可調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪酸代謝以及體內(nèi)平衡[28]。而PDK1 也被證實(shí)可促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的有氧糖酵解和增殖[29]。根據(jù)本研究的研究結(jié)果，PDK1 被證實(shí)是miR-516b 在結(jié)直腸癌中的下游靶基因，且circRAD18 可以增強(qiáng)PDK1 的蛋白表達(dá)水平。

綜上，本研究探討了circRAD18 在結(jié)直腸癌生長(zhǎng)及葡萄糖代謝中的功能，并揭示了circRAD18/miR-516b/PDK1 軸在結(jié)直腸癌代謝重編程中的功能的分子機(jī)制，本研究可能對(duì)開發(fā)結(jié)直腸癌新的生物標(biāo)志物及治療策略具有重要意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李威、蔣訓(xùn)歸負(fù)責(zé)構(gòu)思與設(shè)計(jì)；彭娟負(fù)責(zé)提供研究材料或患者；李威、唐云云負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集和處理；李威、彭娟負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析和解釋；李威負(fù)責(zé)手稿寫作；所有作者均審核并批準(zhǔn)手稿。