王宇琳，陳錦婷，韓煒田，丘秀珍

韶關(guān)學院化學與土木工程學院，廣東 韶關(guān) 512005

近年來，由于金屬納米團簇(MNCs)具有誘人的特性(如優(yōu)越的光穩(wěn)定性、低生物毒性和簡單的合成程序)而受到廣泛關(guān)注[1-3]。鎳和金銀相比，價格便宜，資源豐富，是合成金屬簇的良好材料。另一方面，鑭系元素的銪離子(Eu3+)具有未被完全充滿的4f電子層結(jié)構(gòu)，易與氧、氮原子配位形成具有獨特熒光性能(明亮的可見光發(fā)射)的配位化合物，作為一種新興比率型熒光傳感器被廣泛應用[4,5]。如銪離子(Eu3+)與四環(huán)素類藥物(tetracyclines，TCs)配位結(jié)合后，在620 nm處發(fā)出明亮的紅光[6,7]。

因此，本實驗設(shè)計開發(fā)了一種基于鎳納米團簇-銪混合的紙基比率熒光傳感器用于四環(huán)素檢測。該熒光傳感器在430 nm和620 nm處熒光強度比值與分析物的濃度成線性關(guān)系，且制備的紙基比率熒光傳感器[8]可通過顏色變化可視化識別環(huán)境水體中的TCs。通過該實驗項目，學生不僅能夠掌握紫外-可見分光光度計和分子熒光光譜儀的使用方法和原理，而且還可學到分析和處理復雜數(shù)據(jù)的能力。同時，學生通過試紙顏色變化識別TCs含量，能夠讓學生體驗到一個“看得見”的綜合化學實驗[9,10]。

1 實驗目的

(1) 掌握該比率熒光傳感器的設(shè)計思路、合成方法、分析檢測原理。

(2) 了解紫外-可見分光光度計和分子熒光光譜儀的結(jié)構(gòu)和原理，掌握儀器的基本操作。

(3) 學會運用各種軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析與處理。

2 實驗原理

本實驗設(shè)計原理如圖1所示。首先合成的NiNCs在430 nm處發(fā)藍色熒光，加入Eu3+溶液后，由于誘導聚集效應，NiNCs發(fā)光強度減弱。然后，將TCs加入到NiNCs-Eu3+混合溶液后，由于內(nèi)部過濾效應(IFE)，430 nm處的藍色熒光淬滅，TCs通過“天線效應”將所吸收的能量有效地傳遞給Eu3+，形成發(fā)紅色熒光的Eu-TCs配合物，在620 nm處出現(xiàn)明顯熒光特征峰。隨著TCs溶液濃度增加，430 nm處的熒光強度逐漸降低，620 nm處的熒光強度逐漸增大，且I620nm/I430nm值與待測目標物TCs濃度呈線性關(guān)系，可用于水體中TCs的含量檢測。

另外，將浸泡有NiNCs-Eu3+的濾紙構(gòu)建成便攜式紙基熒光傳感器，對于不同濃度的四環(huán)素(TC)和土霉素(OTC)，紙基傳感器的獨特熒光顏色從亮藍色到紅色，可用于水體中TCs的可視化識別。

圖1 紙基熒光傳感器的設(shè)計和應用原理

3 試劑與儀器

聚乙烯吡咯烷酮(高級純，PVP)、L-抗壞血酸(99%，L-AA)、醋酸銪(99.9%，Eu(OOCCH3)3)、土霉素(99.99%，OTC)、鹽酸四環(huán)素(99.99%，TC)、金霉素(99.99%，CTC)、谷胱甘肽(98%，GSH)、L-谷氨酸(99%，L-Glu)、L-組氨酸(99%，L-His)和D-色氨酸(99%，D-Try)購置于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。NiCl2·6H2O、NaOH、HCl、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、NaCl、ZnCl2、AlCl3、MgCl2和CuCl2均為分析純，購置于國藥集團化學試劑有限公司。濾紙購置于Whatman公司。

分子熒光光譜儀(F-380，天津港東科技股份有限公司)，紫外-可見分光光度計(UV-650，上海美譜達儀器有限公司)，便攜式紫外箱，渦旋振蕩器(Vortex2，德國IKA)，磁力攪拌器。

4 實驗步驟

4.1 NiNCs的合成

首先，將1 g PVP超聲溶解在15 mL超純水后，滴加NaOH溶液(1.0 mol·L-1)將溶液的pH調(diào)節(jié)為～10.0。接著，向上述混合溶液中加入L-AA (2 mL，100 mmol·L-1)和NiCl2·6H2O (0.2 mL，100 mmol·L-1)并在25 °C攪拌6天。當溶液的顏色由無色變成淺黃色后，表明NiNCs的形成。將獲得的NiNCs儲存在4 °C以供進一步使用。

4.2 比率熒光傳感器檢測TC和OTC

向NiNCs (50 μL)和Eu3+(100 μL，100 mmol·L-1)混合溶液中加入500 μL不同濃度的TC和OTC溶液(0.00、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00和50.00 μmol·L-1)。待振蕩反應10 min后，在激發(fā)波長為365 nm下記錄熒光發(fā)射光譜。研究熒光強度比(I620nm/I430nm)與不同濃度的TC和OTC之間的關(guān)系。

4.3 紙基熒光傳感器的制備

用濾紙剪成直徑為1 cm的試紙，將試紙充分浸入NiNCs (50 μL)和Eu3+(100 μL，100 mmol·L-1)的混合溶液10 min，然后在空氣中干燥。移取500 μL不同濃度的TC和OTC溶液(0.00、0.50、5.00、10.00、30.00、50.00 μmol·L-1)滴加到浸泡有NiNCs-Eu3+的試紙上，在365 nm紫外光下觀察試紙顏色變化構(gòu)建紙基熒光標準比色卡。

4.4 紙基熒光傳感器識別環(huán)境水樣品中TCs

取環(huán)境水樣(校園湖水和自來水)，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，分別加入不同濃度的TC和OTC (5.00、30.00、50.00 μmol·L-1)。將500 μL加標樣品溶液滴到浸泡有NiNCs-Eu3+的試紙上，在365 nm紫外光下觀察試紙顏色變化，通過紙基標準比色卡識別水樣中TCs的含量。

5 結(jié)果與討論

5.1 NiNCs-Eu3+對TCs的熒光響應機理

在NiNCs (50 μL)和Eu3+(100 μL，100 mmol·L-1)混合溶液中加入500 μL不同濃度的TC和OTC溶液，用紫外-可見分光光度計和分子熒光光譜儀研究NiNCs-Eu3+對TCs的熒光響應機理。如圖2A、B可知，NiNCs在365 nm的激發(fā)下顯示出430 nm處的強藍色熒光。當加入Eu3+溶液后，由于誘導聚集效應，NiNCs在430 nm處的熒光被淬滅。接著向NiNCs-Eu3+混合溶液中加入TC，由于內(nèi)部過濾效應，它們在430 nm處的熒光減弱。但在620 nm處出現(xiàn)了明顯的Eu3+特征紅色發(fā)射峰[11]，這是因為TC吸收的能量可以通過“天線效應”有效地轉(zhuǎn)移到Eu3+，從而導致與NiNCs-Eu3+系統(tǒng)相比，Eu3+發(fā)射光強度增強[12]。從圖2A發(fā)現(xiàn)NiNCs-Eu3+-TC在620 nm處的熒光強度是Eu3+-TC的近7倍。說明NiNCs可以通過金屬增強熒光效應(MEF)進一步增強Eu3+-TC的熒光強度。

5.2 比率熒光傳感器對不同濃度TCs的識別性能

為研究NiNCs-Eu3+對TCs的識別性能，分別將一系列不同濃度的TC和OTC溶液添加到NiNCs-Eu3+的混合溶液中。如圖3A、C所示，在365 nm的激發(fā)下，隨著TC和OTC濃度的增加，430 nm處的熒光強度逐漸減少，而620 nm處的熒光強度逐漸增大。如圖3B、D所示，I620nm/I430nm的值隨著TC和OTC濃度(0.10-50.00 μmol·L-1)的增加呈線性遞增，相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.9937和0.9984，滿足分析方法學要求。根據(jù)檢出限計算公式LOD = 3σ/S，算得該方法對TC和OTC的LOD分別為27 nmol·L-1和19 nmol·L-1。說明該比率熒光傳感器可用于TC和OTC的定量分析。

圖3 NiNCs-Eu3+對不同濃度(0.00、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00和50.00 μmol·L-1)的TC(A)和OTC (C)溶液的熒光響應以及I620 nm/I430 nm與TC (B)和OTC (D)濃度(0.00-50.00 μmol·L-1)之間的線性關(guān)系

5.3 熒光傳感器的選擇性

為了進一步探究所構(gòu)建的熒光傳感器對TC和OTC的選擇性，選擇了離子(如Cu2+、Al3+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Na+、Cl-、)和天然氨基酸(如GSH、L-Glu、L-His、D-Try)作為干擾物進行選擇性考察。如圖4A所示，NiNCs-Eu3+對TC和OTC的響應值(I620nm/I430nm分別為7.4和10.7)遠大于其他干擾物；且從圖4B看，在干擾物存在下，NiNCs-Eu3+對TC和OTC的響應值基本無影響。結(jié)果表明構(gòu)建的比率熒光傳感器對TCs具有良好的選擇性。

圖4 (A) NiNCs-Eu3+與各種干擾物的I620 nm/I430 nm值；(B) 在干擾物存在下，NiNCs-Eu3+與TC的I620 nm/I430 nm值

5.4 樣品加標回收率

分別在自來水和湖水中加入三個不同濃度的TC和OTC (5.00、10.00、20.00 μmol·L-1)，采用比率熒光傳感器進行樣品加標回收實驗。結(jié)果如表1所示，該方法在自來水和湖水的樣品加標回收率分別90.20%-95.55%和89.10%-97.60%。

表1 自來水和湖水中TC和OTC的測定(n = 3)

為進一步驗證所制備比率熒光傳感器的性能，選用浸有NiNCs-Eu3+的試紙制作紙基傳感器檢測自來水和湖水中TC和OTC。向浸泡了NiNCs-Eu3+的試紙上分別加入0.00-50.00 μmol·L-1的TC和OTC，制作紙基熒光傳感器標準比色卡。如圖5A所示，隨著TC和OTC濃度增加，紙基比色卡的顏色逐漸從亮藍色變?yōu)榧t色，顏色遞變?nèi)庋劭杀孀R。為了進一步驗證紙基熒光傳感器在實際樣品TCs檢測中的應用，實驗將浸泡有NiNCs-Eu3+的試紙用于檢測自來水和湖水中的TC和OTC，并通過加標回收實驗驗證方法的準確性。從圖5B可以看出，加標水樣的試紙顏色與標準比色卡相接近，表明可通過紙基熒光傳感器可視化識別環(huán)境樣品中TCs。

圖5 (A) 紙基熒光傳感器可視化識別TC：標準比色卡(a)和識別自來水和湖水中的TC (b)；(B) 紙基熒光傳感器識別OTC：標準比色卡(a)和識別自來水和湖水中的OTC (b)

6 思考題

(1) 使用NiNCs作為熒光傳感器有哪些優(yōu)勢？

(2) 比率熒光傳感器的優(yōu)點？

(3) 什么是“天線效應”和“內(nèi)部過濾效應”？

(4) 紙基熒光傳感器用于熒光分析檢測有哪些優(yōu)點？

7 教學組織形式和實施成效

(1) 實驗學時安排和教學組織形式。

實驗建議安排8學時，分為兩個階段進行：第一階段為基于NiNCs-Eu3+的比率熒光傳感器檢測四環(huán)素和土霉素方法的建立和熒光機理的探索，以及選擇性和加標回收實驗；第二階段為基于NiNCs-Eu3+的紙基熒光傳感器的制備和應用。兩個階段共需約24 h (20 h + 4 h)。每組實驗參與實驗的學生人數(shù)為10-15人，每4個人1小組協(xié)作開展實驗。

(2) 實驗教學可采用“線上線下”混合教學模式。

課前，學生通過綜合化學實驗教學平臺線上預習，自主觀看實驗原理講授視頻、PPT、相關(guān)文獻等學習資料，了解實驗的原理、步驟和注意事項，同時熟悉紫外-可見分光光度計和分子熒光光譜儀的原理、結(jié)構(gòu)和操作，完成預習報告。

線下課堂，教師可針對學生的預習情況進行總結(jié)，強調(diào)實驗注意事項，引導學生探究實驗條件對實驗結(jié)果的影響，如：

① NiNCs的含量對NiNCs-Eu3+的熒光性能的影響；

② 反應時間、溫度、酸度等因素對NiNCs-Eu3+熒光傳感器響應性能的影響。

學生分組完成實驗后，引導學生學會數(shù)據(jù)處理、圖表繪制，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)撰寫科技論文。有條件的可要求學生根據(jù)實驗結(jié)果進行小組匯報。通過該項目可鍛煉學生化學專業(yè)綜合技能，培養(yǎng)學生查閱文獻、實驗技能、圖表繪制和科技論文撰寫的能力。

(3) 項目實施成效。

我?；瘜W專業(yè)綜合化學實驗基于科研創(chuàng)新平臺開展實驗教學，每年基于教師科研成果選取10個實驗項目作為備選項目，學生根據(jù)自己的興趣選做其中4個實驗項目。該項目納入我?；瘜W專業(yè)綜合化學實驗教學內(nèi)容，并組織實施兩年。從近兩年選課的學生人數(shù)看，較多學生選擇該實驗，并取得良好的教學效果。大部分學生認為該實驗過程操作簡便，能夠綜合鍛煉化學實驗技能，培養(yǎng)理論聯(lián)系實際的能力，同時實驗數(shù)據(jù)處理能力、圖表繪制能力也得到大大提升；另外，從這個可視化識別的實驗中深刻理解了化學發(fā)光的原理和熒光傳感器的知識，激發(fā)了自己對化學實驗及科學研究的興趣。2022年，學生用該實驗項目組隊參加廣東省大學生生物化學實驗技能大賽獲得了一等獎。

8 結(jié)語

本實驗項目提出基于鎳納米團簇-銪混合構(gòu)建紙基比率熒光傳感器可視化識別環(huán)境水體中四環(huán)素和土霉素的新方法。該實驗項目操作簡單、實驗現(xiàn)象明顯，能綜合訓練化學專業(yè)本科學生的專業(yè)技能，適合作為綜合化學實驗教學內(nèi)容。該實驗不僅讓學生理解熒光發(fā)光機理，還引入了天線效應和內(nèi)部過濾效應，讓學生通過查閱文獻拓展學習課外知識。同時，本項目提出比率熒光傳感器的方法可讓學生理解比率熒光傳感器相比于單信號熒光強度檢測的優(yōu)點，讓學生懂得如何減少實驗誤差，提高解決實際問題的能力。該實驗項目僅需使用紫外-可見分光光度計和分子熒光光譜儀等基礎(chǔ)性儀器分析設(shè)備，實驗條件容易實現(xiàn)?？傊搶嶒烅椖烤哂徐`活性、創(chuàng)新性和可視化等優(yōu)勢，不僅可以激發(fā)學生的研究興趣，也有利于學生綜合能力的培養(yǎng)。