張治業(yè),余醒醒,張 璐,翟志敏

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽醫(yī)院血液內(nèi)科,安徽 阜陽 236000;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,安徽 合肥 230601)

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一種由克隆性漿細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致的惡性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì),MM占所有惡性腫瘤的1%,占造血腫瘤的10%～15%,是僅次于非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma,NHL)的第二大血液性腫瘤[1-2]。截止到2020年,每年約有176404例新發(fā)患者,近117077例患者死于MM[3]。盡管新型藥物引入和干細(xì)胞移植技術(shù)進(jìn)步顯著改善了患者的預(yù)后,然而在生存率方面仍面臨巨大挑戰(zhàn)[4-5]。因此,深入了解多發(fā)性骨髓瘤的分子機(jī)制并尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。CD166也稱白細(xì)胞活化黏附分子(Activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM)是黏附分子免疫球蛋白超家族的一種糖蛋白,已被證明在細(xì)胞間相互作用、血管生成、單核細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和T細(xì)胞激活等方面發(fā)揮重要作用[6-7]。其在各種類型腫瘤中過表達(dá),且表達(dá)水平或細(xì)胞表面豐度與不良預(yù)后相關(guān)[8]。CD166已成為一種腫瘤進(jìn)展調(diào)節(jié)劑,主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、黏附、遷移和侵襲[9],也被確定為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物[10]。然而,CD166在MM中的作用機(jī)制尚不明確。本研究探究CD166對(duì)MM細(xì)胞增殖、凋亡和皮下成瘤能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI-8226購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),在添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的PRIM1640 (Gibco)培養(yǎng)基中培養(yǎng),保持潮濕、37 ℃、5% CO2環(huán)境,每2天更換1次培養(yǎng)基。BALB/c裸鼠(4周,雄性,10只)購(gòu)自中國(guó)北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并根據(jù)指南進(jìn)行。

1.2 主要試劑 PRIM1640高糖培養(yǎng)基(C11875500BT)、胎牛血清(10099-141C)、青霉素/鏈霉素(15140122)和0.25%胰蛋白酶(25200-056)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Lipofectamine 3000(L3000015)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;sh-CD166由中國(guó)上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司合成;MTT細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性試劑盒(C0009M)、結(jié)晶紫染色液(C0121)與細(xì)胞凋亡試劑盒(C1052)購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司;mCherry-GFP-LC3雙標(biāo)腺病毒試劑盒(AP22031201)購(gòu)自漢恒生物科技(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染[11]:當(dāng)RPMI-8226細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)進(jìn)行傳代或開展實(shí)驗(yàn)。靶向CD166的短發(fā)夾RNA(shRNA)和陰性對(duì)照(NC)由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司設(shè)計(jì)并合成,基因序列分別為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(NC)、5’-AAGCCCGATGGCTCCCCAGTA-3’(sh-CD166-1)和5’-CCCGTGTCATGCACAATAT-3’(sh-CD166-2)。將RPMI-8226細(xì)胞以30%～50%融合度接種于6孔板中,更換無血清培養(yǎng)基并在37 ℃、5% CO2環(huán)境中繼續(xù)孵育6 h。根據(jù)試劑盒說明書,將sh-CD166和NC與Lipofectamine 3000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中。24～48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行鑒定并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT實(shí)驗(yàn):將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以5×104/ml密度接種于96孔板上。隨后,于接種后24、48、72 h在每孔中加入MTT溶液10 μl,在37 ℃下培養(yǎng)4 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的光密度(OD)值。

1.3.3 平板克隆實(shí)驗(yàn):將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以5×102/孔密度接種于6孔板中并在標(biāo)準(zhǔn)條件下連續(xù)培養(yǎng)2周,每周更換1次培養(yǎng)基。PBS清洗2次后,70%甲醇固定30 min。0.1%結(jié)晶紫在室溫下染色30 min,拍照并在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)菌落數(shù)(>50個(gè)細(xì)胞)。

1.3.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn):上述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞繼續(xù)孵育24 h,胰酶消化后獲得單細(xì)胞懸液并用PBS多次清洗。使用Annexin-V和碘化丙啶避光孵育15 min,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況并使用FlowJo V10分析各組細(xì)胞凋亡率。凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 自噬實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染后細(xì)胞用96孔板繼續(xù)培育24 h,將細(xì)胞分為NC組和sh-CD166組,根據(jù)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)推薦量加入LC3腺病毒孵育24 h后,共聚焦顯微鏡觀察自噬小體水平并拍照。

1.3.6 皮下移植瘤模型:將BALB/c裸鼠隨機(jī)分為NC組和sh-CD166組,每組5只。以1×107個(gè)/ml細(xì)胞密度將100 μl轉(zhuǎn)染后細(xì)胞懸液(NC組和sh-CD166組)注射至小鼠背側(cè)皮下。每3天檢查腫瘤生長(zhǎng)情況并測(cè)量大小,計(jì)算公式為:移植瘤體積(mm3)=1/2×腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤短徑2。4周后,麻醉并處死小鼠。分離腫瘤組織,拍照并將其固定于多聚甲醛溶液中。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染后三組細(xì)胞增殖能力及平板克隆能力比較 見表1。為了探討CD166對(duì)MM細(xì)胞增殖的影響,我們轉(zhuǎn)染靶向CD166的shRNA并構(gòu)建CD166敲低細(xì)胞株。與NC組比較,sh-CD166-1和sh-CD166-2組細(xì)胞增殖能力和平板克隆能力下降(均P<0.05),但sh-CD166-1和sh-CD166-2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 轉(zhuǎn)染后三組細(xì)胞增殖能力及平板克隆能力比較

2.2 轉(zhuǎn)染后三組細(xì)胞凋亡情況比較 見圖1。NC組、sh-CD166-1組以及sh-CD166-2組細(xì)胞凋亡率依次為(4.25±0.37)%、(17.18±0.96)%、(12.24±1.03)%。與NC組比較,sh-CD166-1和sh-CD166-2組細(xì)胞凋亡率升高(均P<0.05),但sh-CD166-1和sh-CD166-2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

圖1 轉(zhuǎn)染后三組細(xì)胞凋亡情況流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞自噬小體表達(dá)量比較 見圖2。與NC組比較,sh-CD166組細(xì)胞中自噬小體表達(dá)量明顯減少[(4.30±0.67)個(gè)與(0.19±0.02)個(gè),P<0.05]。

圖2 兩組細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果(熒光染色,×400)

2.4 兩組裸鼠移植瘤體積比較 見圖3。為了評(píng)估CD166對(duì)裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響,我們用NC及sh-CD166組細(xì)胞行裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)。與NC組比較,sh-CD166組移植瘤體積明顯減小[(0.37±0.08)g與(0.19±0.03)g,P<0.05]。

圖3 兩組裸鼠移植瘤實(shí)物標(biāo)本

3 討 論

MM是一種不可治愈和生物異質(zhì)性的漿細(xì)胞疾病,伴有骨髓中單克隆漿細(xì)胞不受控制地生長(zhǎng),導(dǎo)致功能不完整的免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈異常產(chǎn)生。同時(shí),免疫球蛋白無限制積累以及異常單克隆漿細(xì)胞與骨髓中其他細(xì)胞不斷相互作用引發(fā)一系列臨床癥狀,包括貧血、骨骼病變、感染、高鈣血癥、腎衰竭、疲勞和疼痛等[12]。化療聯(lián)合類固醇治療是新診斷患者的主要治療方法。糖皮質(zhì)激素、蛋白酶體抑制劑、免疫抑制劑以及干細(xì)胞移植等新型治療手段已證明可以顯著改善MM患者的臨床預(yù)后[13-15],然而部分患者出現(xiàn)耐藥,患者中位生存期約5年,嚴(yán)重威脅著廣大患者的生命健康[16-17]。因此,迫切需要針對(duì)MM基因改變和分子生物學(xué)的異常表達(dá)尋找合適的分子靶點(diǎn)。

CD166位于人類3q13.1-q13.2染色體,由16個(gè)外顯子組成。同時(shí),CD166是一種細(xì)胞黏附分子,作為淋巴細(xì)胞CD6抗原的配體,廣泛表達(dá)于各種組織,如神經(jīng)元、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞等[17]。除細(xì)胞黏附之外,CD166還具有其他重要功能,如血管生成、單核細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、白細(xì)胞通過血腦屏障內(nèi)滲、T細(xì)胞激活、造血、神經(jīng)軸突延伸、成骨等[18]。隨著基礎(chǔ)研究的深入,越來越多的證據(jù)表明CD166與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。多項(xiàng)研究[15,17-18]表明,CD166通過激活金屬蛋白酶信號(hào)級(jí)聯(lián)促進(jìn)細(xì)胞-細(xì)胞和(或)細(xì)胞-基質(zhì)相互作用,進(jìn)而參與腫瘤細(xì)胞的侵襲過程。同時(shí),CD166已成為一種腫瘤進(jìn)展的介導(dǎo)者,主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、黏附、遷移和侵襲[19]。超微結(jié)構(gòu)研究表明,CD166與MUC18/MEL-CAM/CD146黑色素瘤細(xì)胞的表面的黏附分子存在27%的同源性,能夠促進(jìn)黑色素瘤進(jìn)展并形成局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。CD166的表達(dá)與前列腺癌的轉(zhuǎn)移能力、膽管癌的侵入性以及乳腺癌凋亡的逃避有關(guān)[20]。然而,CD166在MM中的作用及其具體分子機(jī)制尚不清楚。

近年研究[21]發(fā)現(xiàn),腫瘤的發(fā)生和發(fā)展可能是由于細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常激活、細(xì)胞異常增殖和腫瘤相關(guān)基因異常表達(dá)等原因?qū)е?。Kijima等[17]研究發(fā)現(xiàn),CD166在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)增高。在結(jié)直腸癌組織中,CD166+CSCs陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織[22]。Fujiwara等[23]探究CD166對(duì)胰腺癌細(xì)胞致瘤性和侵襲遷移活性的特征,通過免疫組化分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD166在胰腺癌組織中表達(dá),但在正常細(xì)胞中不表達(dá)。

腫瘤細(xì)胞異常增殖是腫瘤無法控制的主要原因。Kijima等[17]研究發(fā)現(xiàn),將CD166小干擾RNA或小發(fā)夾RNA轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中可促進(jìn)細(xì)胞侵襲而不影響細(xì)胞增殖。此外,Fujiwara等[23]研究發(fā)現(xiàn),CD166可以提高胰腺癌細(xì)胞克隆形成能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾CD166表達(dá)可以抑制MM細(xì)胞增殖和克隆形成,說明CD166具有促進(jìn)MM細(xì)胞增殖的作用。

細(xì)胞凋亡作為一種由基因控制自主的、有序的細(xì)胞死亡過程,在維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。因此,激活或抑制細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是抗腫瘤或促腫瘤的策略。近年來,已有多個(gè)研究報(bào)道CD166對(duì)人腫瘤細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用。例如,Jezierska等[9]探究CD166對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡和自噬的影響,在乳腺癌細(xì)胞中CD166基因沉默后降低B淋巴細(xì)胞瘤-2濃度,凋亡率明顯升高。Hansen等[20]研究發(fā)現(xiàn),CD166翻譯后修飾可以作為前列腺癌進(jìn)展的標(biāo)志且敲低CD166表達(dá)可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞中促凋亡蛋白半胱天冬酶3表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn),抑制CD166表達(dá)后,MM細(xì)胞凋亡率明顯上升。

小鼠皮下移植瘤模型被廣泛用于腫瘤微環(huán)境和藥物療效方面的研究。這種模型目的是為腫瘤生長(zhǎng)提供合適的生存條件,以便于它們能夠正常生長(zhǎng)并與宿主建立類似于在供體觀察到的相互作用。于是,我們利用裸鼠皮下成瘤模型對(duì)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。Yan等[24]通過腫瘤球質(zhì)膜蛋白組學(xué)鑒定CD166是否能夠成為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與鱗癌惡性生物學(xué)行為顯著相關(guān)的是CD166表達(dá)情況,而非已經(jīng)明確的鱗癌干細(xì)胞標(biāo)記物CD44,且相較于CD166(低)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞,CD166(高)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞在體外具有更強(qiáng)的成球能力,在體內(nèi)具有更強(qiáng)的成瘤能力。Fujiwara等[23]研究表明,在皮下和原位小鼠腫瘤模型中,CD166+胰腺癌細(xì)胞比CD166-胰腺癌細(xì)胞引起的腫瘤生長(zhǎng)明顯且體積更大。本研究結(jié)果表明,干擾CD166表達(dá)可以抑制MM細(xì)胞皮下成瘤。

綜上所述,CD166能促進(jìn)MM細(xì)胞 RPMI-8226增殖,抑制細(xì)胞凋亡,并促進(jìn)皮下成瘤。