張 玲,陳 堯,尹 航,程 超

(1.黃石市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科,湖北 黃石435000;2.黃石市中醫(yī)醫(yī)院骨科,湖北 黃石435000)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種常見的以軟骨退化和破壞為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病,其病理過程主要以軟骨細(xì)胞死亡、關(guān)節(jié)炎癥、衰老為主[1]。OA患者往往因為關(guān)節(jié)僵硬、疼痛而致殘,最終導(dǎo)致生活質(zhì)量嚴(yán)重下降,并產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān),因此開發(fā)新藥物治療OA方法意義重大[2]。布托啡諾(Butorphanol,BT)是一種脂溶性麻醉藥,作為一種合成的阿片受體激動拮抗劑,臨床上廣泛用作鎮(zhèn)痛藥[3]。但研究[4]表明BT可以通過減少炎癥性浸潤損傷減輕神經(jīng)元損傷及腦損傷,然而在OA治療中鮮有報道。細(xì)胞焦亡是一種由促炎介質(zhì)誘導(dǎo)的炎癥性程序性細(xì)胞死亡,可誘導(dǎo)細(xì)胞破裂和細(xì)胞內(nèi)容物釋放,其特征是NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)、半胱天冬酶-1(Caspase-1)激活以及白細(xì)胞介素(Interleukin-1β,IL-1β)的釋放,參與多種疾病中的進展[5]。Li等[6]研究發(fā)現(xiàn),在脂多糖誘導(dǎo)建立小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞模型中,下調(diào)微小RNA-155(microRNA-155,miR-155)可通過抑制NLRP3/Caspase-1通路增加細(xì)胞活力,抑制小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞焦亡。但BT能否通過抑制NLRP3/Caspase-1通路對OA發(fā)展起作用尚不清楚。IL-1β作為一種促炎細(xì)胞因子,由激活的巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞產(chǎn)生,在OA進展中起重要作用[7]。本研究以IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞建立OA體外模型,探討B(tài)T通過抑制NLRP3/Caspase-1通路對OA發(fā)生與發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞 人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞HC-a由上海通派生物科技有限公司提供。將細(xì)胞放置在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2 主要試劑 BT(批號:42408-82-2)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司; IL-1β試劑(批號:SRP6169)、NLRP3激活劑ATP(批號:5.30657)購自Sigma-Aldrich公司;Hoechst 33342染色液/ 碘化丙啶(PI)染色液(批號:FS-79092)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α,批號:70-EK1822)及IL-6 ELISA試劑盒(批號:70-EK3062/2)購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司;一氧化氮(NO)ELISA試劑盒(批號:fk-fv0386)購自延慕實業(yè)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:RR037A)購自Takara公司;RIPA裂解液(批號:R0020)、MTT試劑(批號:M1020)購自北京索萊寶生物公司;兔源NLRP3(批號:ab263899)、兔源Caspase-1(批號:ab238972)、兔源IL-1β(批號:ab254360)一抗購自Abcam公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞分組與處理:取對數(shù)生長期HC-a細(xì)胞,分為對照組、IL-1β組、BT低濃度(BT-L)組、BT中濃度(BT-M)組、BT高濃度(BT-H)組、BT-H+ATP組。其中,對照組未經(jīng)IL-1β處理細(xì)胞;IL-1β組經(jīng)10 ng/ml IL-1β處理細(xì)胞[8]。BT-L、BT-M、BT-H組分別經(jīng)10 ng/ml IL-1β處理細(xì)胞30 min后,然后經(jīng)1、2、4 μmol/L BT處理細(xì)胞[9]。BT-H+ATP組經(jīng)10 ng/ml IL-1β處理細(xì)胞30 min后,給予4 μmol/L BT、3 mmol/L ATP處理細(xì)胞[10]。以上各組均處理48 h后進行檢測。

1.3.2 細(xì)胞形態(tài)觀察:按照上述分組處理HC-a細(xì)胞,48 h后于倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞外觀形態(tài)變化。

1.3.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖率:將HC-a細(xì)胞接種在96孔板中于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理對數(shù)生長期HC-a細(xì)胞后,將10 μl MTT溶液添加到96孔板中,并在37 ℃下連續(xù)孵育4 h,然后除去MTT溶液,將甲臜染料溶解在二甲亞砜中,低速振蕩10 min。于酶標(biāo)儀上檢測570 nm處的光密度值(OD),計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(試驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.3.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達:收集HC-a細(xì)胞,使用TRIzol試劑提取總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為參照,按照2-ΔΔCt分析NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達水平。引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.3.5 Hoechst 33342/PI染色檢測細(xì)胞焦亡變化:將HC-a細(xì)胞(2×105/ml)接種于6孔板中,用PBS洗滌細(xì)胞,在室溫下用PI溶液、Hoechst 33342溶液、細(xì)胞染色緩沖液按照1∶1∶200混合后,加入1 ml混合液進行反應(yīng),PBS洗滌3次,然后在熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.6 ELISA檢測NO、TNF-α及IL-6水平變化:收集HC-a細(xì)胞離心,取上清液按照ELISA試劑盒檢測NO、TNF-α及IL-6水平。

1.3.7 Western blot檢測細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達水平:用預(yù)冷的PBS洗滌上述各組細(xì)胞3次,然后用RIPA裂解緩沖液在4 ℃下提取總蛋白。收集上清液,在15% SDS-PAGE電泳上分離蛋白質(zhì)并進行轉(zhuǎn)膜,室溫封閉2 h。之后在4 ℃下與NLRP3、Caspase-1、IL-1β一抗孵育過夜,TBST洗膜3次,將膜與二抗在室溫下孵育2 h。通過ECL檢測試劑可視化蛋白,以β-actin為內(nèi)源參照物,分析各組蛋白表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)變化 見圖1。對照組HC-a細(xì)胞呈類圓形形態(tài),胞核核仁清晰,呈圓形或橢圓形。IL-1β組細(xì)胞體積縮小、有空泡出現(xiàn),核分裂現(xiàn)象減少。BT-L、BT-M、BT-H組細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù),其中BT-H趨于正?；?。BT-H+ATP組核分裂現(xiàn)象較BT-H組減少,細(xì)胞體積皺縮。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)變化(×400)

2.2 各組細(xì)胞增殖率比較 對照組、IL-1β組、BT-L組、BT-M組、BT-H組、BT-H+ATP組細(xì)胞增殖率依次為(100.00±0.00)%、(42.31±4.24)%、(58.84±5.89)%、(72.18±7.22)%、(89.61±8.97)%、(64.37±6.44)%。IL-1β組較對照組顯著降低(P<0.05)。BT-L組、BT-M組、BT-H組較IL-1β組顯著增加,且呈劑量依賴性(均P<0.05)。BT-H+ATP組較BT-H組顯著降低(P<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞PI陽性細(xì)胞率比較 見圖2。對照組、IL-1β組、BT-L組、BT-M組、BT-H組、BT-H+ATP組PI陽性細(xì)胞率依次為(7.15±0.72)%、(78.51±7.86)%、(51.29±5.25)%、(38.67±3.87)%、(16.51±1.66)%、(52.37±5.24)%。與對照組比較,IL-1β組PI陽性細(xì)胞率明顯增加(P<0.05)。與IL-1β組比較,BT-L組、BT-M組、BT-H組PI陽性細(xì)胞率明顯減少,且呈劑量依賴性(均P<0.05)。與BT-H組比較,BT-H+ATP組PI陽性細(xì)胞率明顯增加(P<0.05)。

圖2 各組細(xì)胞Hoechest33342(上)、PI(中)和Merge(下)染色結(jié)果(×200)

2.4 各組細(xì)胞NO、TNF-α及IL-6水平比較 見表2。與對照組比較,IL-1β組NO、TNF-α及IL-6水平顯著升高(均P<0.05)。與IL-1β組比較,BT-L組、BT-M組、BT-H組NO、TNF-α及IL-6水平顯著降低(均P<0.05)。與BT-H組比較,BT-H+ATP組NO、TNF-α及IL-6水平顯著升高(均P<0.05)。

表2 各組細(xì)胞NO、TNF-α及IL-6水平比較(pg/ml)

2.5 各組細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達比較 見表3。與對照組比較,IL-1β組NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達顯著升高(均P<0.05)。與IL-1β組比較,BT-L組、BT-M組、BT-H組NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達顯著下降(均P<0.05。與BT-H組比較,BT-H+ATP組NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達顯著增加(均P<0.05)。

表3 各組細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達比較

2.6 各組細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達比較 見表4。與對照組比較,IL-1β組NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達顯著升高(均P<0.05)。與IL-1β組比較,BT-L組、BT-M組、BT-H組NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達顯著下降(均P<0.05)。與BT-H組比較,BT-H+ATP組NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達顯著增加(均P<0.05)。

表4 各組細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達比較

3 討 論

OA常見的癥狀包括關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)功能紊亂,是全世界常見的慢性退行性疾病,發(fā)病率較高,但其主要發(fā)生在老年人群中[11]。雖然OA進展緩慢,但其病理變化會影響關(guān)節(jié)中的所有組織,如軟骨下硬化、軟骨退化、關(guān)節(jié)肥大、不同程度的滑膜炎癥等,造成患者運動過程中負(fù)擔(dān)嚴(yán)重,進而影響其日常生活[12]。目前OA的病因和發(fā)病機制尚不完全清楚,但在OA的進展過程中往往伴隨著軟骨基質(zhì)丟失、自噬、氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞死亡等病理變化,尚未發(fā)現(xiàn)有藥物能阻斷OA的進展[13],因此需要關(guān)注病理變化,探討發(fā)病機制以找尋更安全有效的藥物。

BT是一種美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的鎮(zhèn)痛劑,是一種有效的κ-阿片受體激動劑和μ-阿片受體拮抗劑,臨床應(yīng)用較為廣泛。近年來的研究主要集中在BT的鎮(zhèn)痛作用方面,如可用作治療偏頭痛的鼻腔噴霧劑,也可用作治療中度至重度疼痛的麻醉鎮(zhèn)痛劑或作為全身麻醉的輔助劑[14]。除此之外,研究發(fā)現(xiàn)BT還具有抗炎等作用。例如,脂多糖刺激H9C2細(xì)胞后導(dǎo)致釋放的炎癥細(xì)胞因子增加,而BT處理后抑制了炎癥因子的釋放,為膿毒癥引起的心肌功能障礙提供潛在藥物[15];彭賽等[16]研究發(fā)現(xiàn),在子宮全切手術(shù)中,BT聯(lián)合舒芬太尼可以降低患者疼痛,抑制炎癥因子水平。值得關(guān)注的是,Zhang等[17]研究證明TNF-α誘導(dǎo)人軟骨細(xì)胞-關(guān)節(jié)細(xì)胞衰老過程中,BT可以通過降低炎癥因子水平保護細(xì)胞免受TNF-α引起的細(xì)胞衰老,可用作治療與衰老相關(guān)的骨關(guān)節(jié)炎的潛在藥物。本研究發(fā)現(xiàn),IL-1β誘導(dǎo)的HC-a細(xì)胞中,炎癥因子(NO、IL-6、TNF-α)水平明顯增加,細(xì)胞焦亡(PI陽性表達)增加,但細(xì)胞增殖顯著下降,經(jīng)不同濃度的BT處理后,細(xì)胞增殖顯著增加,炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡均被抑制,表明BT可能在OA治療中發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡的作用,但具體機制需探索。

細(xì)胞死亡包括自噬、壞死性凋亡、細(xì)胞焦亡、鐵死亡等,其中細(xì)胞焦亡是炎癥小體觸發(fā)的促炎程序性細(xì)胞死亡,其特點是細(xì)胞膜溶解,細(xì)胞腫脹、破裂,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外。典型激活途徑是由NLRP3炎性小體介導(dǎo)的,通過NLRP3響應(yīng)細(xì)胞受到的刺激而被激活,募集凋亡相關(guān)斑點樣蛋白,并與pro-Caspase-1結(jié)合組裝成NLRP3炎性小體,然后炎性小體可將pro-Caspase-1切割成活化的Caspase-1,同時也可以切割I(lǐng)L-1β前體,促進其成熟和分泌,從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[18]。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn),阻斷NLRP3/Caspase-1軸可以減少神經(jīng)病理損傷,改善細(xì)胞焦亡并緩解認(rèn)知功能障礙,為治療氯胺酮相關(guān)的神經(jīng)毒性提供了新研究方向。在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導(dǎo)的帕金森小鼠模型中[20],紅景天苷通過抑制NLRP3/Caspase-1信號通路抑制細(xì)胞焦亡,保護多巴胺能神經(jīng)元。本研究發(fā)現(xiàn),IL-1β誘導(dǎo)的HC-a細(xì)胞中IL-1β、Caspase-1、NLRP3表達顯著增加,提示激活NLRP3/Caspase-1信號通路可能與IL-1β誘導(dǎo)的HC-a細(xì)胞中炎癥因子及細(xì)胞焦亡產(chǎn)生有關(guān)。經(jīng)不同濃度的BT處理后,IL-1β、Caspase-1、NLRP3表達顯著下調(diào),炎癥因子及細(xì)胞焦亡均被抑制,推測BT可以通過抑制NLRP3/Caspase-1信號通路降低炎癥因子水平,抑制細(xì)胞焦亡。為進一步驗證上述猜想,本實驗引入NLRP3激活劑ATP,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATP逆轉(zhuǎn)了BT-H對IL-1β誘導(dǎo)的HC-a細(xì)胞中炎癥因子及細(xì)胞焦亡的抑制作用,提示BT通過抑制NLRP3/Caspase-1信號通路降低IL-1β誘導(dǎo)的HC-a細(xì)胞焦亡。

綜上所述,BT可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞焦亡,可能與抑制NLRP3/Caspase-1信號通路有關(guān)。但本研究僅在體外進行了實驗,接下來計劃在動物體內(nèi)開展相關(guān)實驗,并設(shè)置抑制劑陰性對照以進一步完善該機制的研究。