方 宇,董重陽,高斌禮,李明宇,李 偉,郭 文,焦志超

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010107;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院影像中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

隨著老齡化加劇,近些年我國骨質(zhì)疏松(Osteporsis,OP)發(fā)病率呈遞增趨勢。OP是一種代謝性的全身性骨骼疾病,多發(fā)于老年人及絕經(jīng)后婦女等群體,主要臨床特征是骨組織中骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)受損、骨強(qiáng)度降低等,隨著疾病進(jìn)展,骨脆性增加,骨折風(fēng)險(xiǎn)也急劇增加,導(dǎo)致患者出現(xiàn)骨骼疼痛、變形等不適癥狀,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[1-4]。目前研究[5-6]認(rèn)為,OP的發(fā)生發(fā)展與雄性激素、營養(yǎng)和其他物理因素引起的骨代謝失衡密切相關(guān),在骨代謝中成骨細(xì)胞扮演著重要角色,其增殖和分化能力決定骨量多少。微小RNA(microRNA,miR)由約22個(gè)核苷酸組成,主要通過調(diào)控多個(gè)靶基因表達(dá),從而參與調(diào)控疾病進(jìn)程[7]。有研究[8]在小鼠尾懸吊誘導(dǎo)的骨丟失模型中發(fā)現(xiàn),骨組織中的miR-214表達(dá)量明顯升高。然而,miR-214是否通過調(diào)控成骨細(xì)胞參與OP進(jìn)程的相關(guān)研究較少。作為經(jīng)典的信號(hào)通路,磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)信號(hào)通路參與多種疾病發(fā)生與發(fā)展,近些年來發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT可以在第10號(hào)染色體丟失性磷酸酶及張力蛋白同源基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)介導(dǎo)下參與到骨代謝進(jìn)程。生物信息學(xué)分析顯示miR-214能夠靶向調(diào)控PTEN。因此,本研究選取成骨細(xì)胞MC3T3-E1為研究對象,觀察miR-214調(diào)控PTEN對成骨細(xì)胞的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 成骨細(xì)胞MC3T3-E1和工具細(xì)胞HEK 293T購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.2 主要試劑 α-MEM培養(yǎng)基(批號(hào):11965012)、鏈霉素/青霉素(批號(hào):15070117)、高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào):4368845)、TRIzol試劑(批號(hào):15596035)、鏈霉素親和偶聯(lián)磁珠(批號(hào):88392)、胎牛血清(批號(hào):16140324)購自美國Thermo Fisher公司;miR-124模擬物(mimic)和陰性對照(NC)、pcDNA3.1-PTEN由廣州源井生物科技有限公司提供;CCK-8試劑盒(批號(hào):C0038)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;骨鈣素放射免疫試劑盒(批號(hào):NJ0432)、堿性磷酸酶試劑盒(批號(hào):NJ18723)購自南京建成生物科技有限公司;兔抗PTEN(批號(hào):A2784)、Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ,批號(hào):A5432)、骨橋蛋白(OPN,批號(hào):A1137)、p-PI3K(批號(hào):A4233)、p-AKT(批號(hào):A4234)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:復(fù)蘇MC3T3-E1細(xì)胞,使用含10%胎牛血清與100 mg/ml鏈霉素/青霉素的α-MEM培養(yǎng)基,恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),條件設(shè)置為飽和濕度、溫度37 ℃、5% CO2。待融合達(dá)到80%后,加入胰蛋白酶消化、傳代。取對數(shù)生長期MC3T3-E1細(xì)胞,根據(jù)Lipofectamine 2000試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將細(xì)胞分為miR-124 mimic組、miR-124 NC組、pcDNA3.1-PTEN組、miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN組,48 h后收集各組細(xì)胞備用。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測細(xì)胞miR-124和PTEN mRNA表達(dá):采用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)體系:上下游引物各0.5 μg、1 μg cDNA模板和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒,配制20 μl。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,循環(huán)40次。引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-124、PTEN mRNA相對表達(dá)水平。

表1 各基因引物序列

1.3.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-124與PTEN靶向結(jié)合:miR-124與PTEN結(jié)合位點(diǎn)使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Target Scan Human預(yù)測。構(gòu)建突變型psiCheck2-PTEN-MUT-Luc和野生型psiCheck2-PTEN-WT-Luc熒光質(zhì)粒,與陰性對照和miR-124模擬物共轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞,檢測熒光信號(hào)強(qiáng)度。

1.3.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖:取各組對數(shù)生長期細(xì)胞,加入胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)。按照2×104個(gè)/孔接種于96孔板中,置于恒溫箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)48 h后,將10 μl CCK-8分別加入各組孔中,培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值(A)。細(xì)胞增殖率=(A樣品-A空白)/A空白×100%。

1.3.5 堿性磷酸酶活性檢測:取各組對數(shù)生長期細(xì)胞,加入胰蛋白酶消化計(jì)數(shù),按照2×104個(gè)/孔接種于24孔板中,置于恒溫箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后,棄去培養(yǎng)基,加入含有成骨誘導(dǎo)劑(0.15 mmo/L抗壞血酸、10-8mmol/L地塞米松以及10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)的培養(yǎng)基,放回培養(yǎng)箱,然后繼續(xù)培養(yǎng)7 d,按照試劑盒說明書檢測。

1.3.6 骨鈣素水平檢測:取各組對數(shù)生長期細(xì)胞,加入胰蛋白酶消化計(jì)數(shù),按照2×104個(gè)/孔接種于24孔板中,置于恒溫箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng),等到細(xì)胞貼壁,將培養(yǎng)基去除,然后將含有礦化誘導(dǎo)劑(50 mg/L抗壞血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)的培養(yǎng)基加入進(jìn)去,返回培養(yǎng)箱當(dāng)中,繼續(xù)培養(yǎng)21 d,按照骨鈣素放射免疫試劑盒說明書步驟檢測。

1.3.7 茜素紅染色:取各組對數(shù)生長期細(xì)胞,加入胰蛋白酶消化計(jì)數(shù),按照5×103個(gè)/孔接種于96孔板中,置于恒溫箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后,棄去培養(yǎng)基,加入含有礦化誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)21 d。取各組細(xì)胞加入70%乙醇,固定1 h后,然后加入濃度為10%的茜素紅,置于恒溫箱中,設(shè)置溫度37 ℃,繼續(xù)培養(yǎng)30 min,然后加入濃度為10%的西吡氯胺,室溫靜置10 min,取出并用PBS液沖洗2遍,鏡下觀察,在低倍鏡下任選5個(gè)視野,采用NIH Image 1.31軟件進(jìn)行分析,根據(jù)鈣化面積與總面積比值計(jì)算礦化率,即礦化率=鈣化面積/總面積×100%。

1.3.8 Western blot檢測蛋白表達(dá):加入適量預(yù)冷裂解液至各組細(xì)胞勻漿,于冰上孵育30 min。離心(4 ℃下10000 r/min)10 min后,取上清液,BCA定量后制樣。電泳、轉(zhuǎn)模、切膠片后,加入5%脫脂奶粉配置的封閉液,置于搖床中封閉1 h。加入一抗[PTEN(1∶1000稀釋)、Col Ⅰ(1∶500稀釋)、OPN(1∶500稀釋)、p-PI3K(1∶500稀釋)、p-AKT(1∶500稀釋)],搖勻置于恒溫箱(4 ℃)中過夜,洗膜,加入二抗(1∶5000稀釋),室溫孵育2 h。洗膜添加顯色液,避光5 min,采用Image J分析。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果 見圖1、2。在線生信(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測顯示miR-124和PTEN存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-124 mimic組野生型PTEN的熒光素酶活性明顯低于miR-124 NC組(均P<0.05),miR-124 mimic組與突變型PTEN的熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 miR-124與PTEN結(jié)合位點(diǎn)

圖2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果

2.2 miR-124對MC3T3-E1細(xì)胞PTEN mRNA及蛋白表達(dá)的影響 見表2。qRT-PCR及Werstern blot結(jié)果顯示,與miR-124 NC組比較,miR-124 mimic組miR-124表達(dá)升高(P<0.05);與miR-124 NC組比較,miR-124 mimic組PTEN mRNA及蛋白表達(dá)降低,pcDNA3.1-PTEN組表達(dá)升高(均P<0.05);與miR-124 mimic組比較,miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN組PTEN mRNA及蛋白表達(dá)升高(均P<0.05)。

表2 miR-124對MC3T3-E1細(xì)胞PTEN mRNA及蛋白表達(dá)的影響

2.3 miR-124對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示,miR-124 NC組、miR-124 mimic組、pcDNA3.1-PTEN組和miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN組細(xì)胞增殖率依次為(87.34±3.25)%、(109.25±4.58)%、(53.47±2.93)% 和(85.43±3.22)%。與miR-124 NC組比較,miR-124 mimic組細(xì)胞增殖率升高,pcDNA3.1-PTEN組降低(t=6.757、13.407,均P<0.05);與miR-124 mimic組比較,miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN組細(xì)胞增殖率降低(t=7.369,P<0.05)。

2.4 miR-124對MC3T3-E1細(xì)胞分化的影響 見表3。miR-124 mimic組細(xì)胞堿性磷酸酶活性、Col Ⅰ、OPN表達(dá)明顯低于miR-124 NC組,pcDNA3.1-PTEN組細(xì)胞堿性磷酸酶活性、Col Ⅰ、OPN表達(dá)明顯高于miR-124 NC組(均P<0.05)。miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN組細(xì)胞堿性磷酸酶活性、Col Ⅰ、OPN明顯高于miR-124 mimic組(均P<0.05)。

表3 調(diào)控miR-124表達(dá)對MC3T3-E1細(xì)胞分化的影響

2.5 miR-124對MC3T3-E1細(xì)胞礦化的影響 見表4。與miR-124 NC組比較,miR-124 mimic組細(xì)胞礦化率和骨鈣素水平降低,pcDNA3.1-PTEN組升高(均P<0.05)。與miR-124 mimic組比較,miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN組細(xì)胞礦化率和骨鈣素水平升高(均P<0.05)。

表4 miR-124對MC3T3-E1細(xì)胞分化的影響

2.6 miR-124對MC3T3-E1細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的影響 見表5。Werstern blot檢測結(jié)果顯示,與miR-124 NC組比較,miR-124 mimic組細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)升高,pcDNA3.1-PTEN組表達(dá)降低(均P<0.05);與miR-124 mimic組比較,miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN組細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)降低(均P<0.05)。

表5 miR-124對MC3T3-E1細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

正常情況下,成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),其在維持機(jī)體骨量中扮演著重要角色,然而一旦平衡打破,可能誘發(fā)機(jī)體出現(xiàn)骨質(zhì)疏松[9]。多數(shù)研究證實(shí),在成骨細(xì)胞增殖、分化以及礦化過程中,microRNAs出現(xiàn)異常表達(dá)。Cui等[10]研究發(fā)現(xiàn),在成骨細(xì)胞hFOB1.19中,當(dāng)上調(diào)miR-296時(shí),Cbfal蛋白表達(dá)也隨之上調(diào),同時(shí)加劇了細(xì)胞成骨細(xì)胞分化。Yu等[11]研究發(fā)現(xiàn),miR-455-3p能夠調(diào)控同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)表達(dá),介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(STAT3)信號(hào)通路參與高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡和增殖。miR-214位于人染色體的1q24.3區(qū)域。有研究[12]顯示,乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者破骨細(xì)胞中miR-214表達(dá)明顯上調(diào),且能夠下調(diào)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3表達(dá),促進(jìn)破骨細(xì)胞分化,給予拮抗劑可減弱骨溶解轉(zhuǎn)移進(jìn)展。本研究生信在線分析結(jié)果顯示miR-214和PTEN存在靶向結(jié)合序列。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn),在糖尿病腎病大鼠中miR-214可以靶向調(diào)控PTEN。趙娜等[14]研究發(fā)現(xiàn),在骨肉瘤中miR-214可以靶向PTEN抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究選取成骨細(xì)胞MC3T3-E1為研究對象,采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-214表達(dá),結(jié)果顯示PTEN mRNA和蛋白均表達(dá)下調(diào),雙熒光素酶報(bào)告基因檢測也證實(shí)兩者存在靶向調(diào)控關(guān)系。

PTEN位于人染色體的10q23.3,主要通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路參與多種疾病進(jìn)程[15-16]。研究[17]發(fā)現(xiàn),PTEN在骨質(zhì)疏松患者血清中的表達(dá)顯著高于健康人群,而miR-140-3p低于健康人群,且兩者存在靶向調(diào)控作用。本研究將miR-214 mimic和pcDNA3.1-PTEN單獨(dú)或兩者共轉(zhuǎn)染至成骨細(xì)胞MC3T3-E1中,結(jié)果顯示miR-214表達(dá)上調(diào)能夠明顯抑制細(xì)胞增殖、成骨分化和礦化,降低成骨分化堿性磷酸酶、Col Ⅰ、OPN和骨鈣素水平,而過表達(dá)PTEN則會(huì)逆轉(zhuǎn)上述作用,提示miR-214調(diào)控成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、分化以及礦化是通過靶向調(diào)控PTEN完成。

骨代謝平衡受到多種信號(hào)通路調(diào)控,PI3K/AKT信號(hào)通路是一條內(nèi)源性的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與了多種疾病進(jìn)程,PI3K/AKT發(fā)生磷酸化后能直接調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡與衰老等生理過程[18-19]。Khan等[20]采用Rapamycin阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路,在鈣質(zhì)沉積的茜素紅染色減弱,成骨細(xì)胞分化受到明顯抑制。本研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-124可以顯著上調(diào)p-PI3K、p-AKT蛋白水平,提示上調(diào)miR-214表達(dá)后,PTEN蛋白表達(dá)下降,進(jìn)而激活PI3K/AKT信號(hào)通路,從而調(diào)控成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、分化和礦化。micro-RNAs在骨重建過程中發(fā)揮重要作用,尤其在調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化功能以及骨質(zhì)疏松等疾病方面[21-22]。未來有可能通過抑制或者過表達(dá)某些特定的microRNAs來減緩患者的骨丟失,促進(jìn)骨重塑,從而達(dá)到治療骨病的目的。

綜上所述,miR-214通過靶向下調(diào)PTEN蛋白表達(dá)激活PI3K/AKT信號(hào)通路,從而調(diào)控成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、分化和礦化。miR-214未來可能成為骨病潛在的治療靶點(diǎn)。本研究也存在不足之處,只是在細(xì)胞中初步揭示了miR-214調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的分子機(jī)制,而miR-214能否作為骨病診斷標(biāo)志物以及其效能大小需進(jìn)一步研究。