付寧寧，肖長廣，陳夢莉，2，邱亞峰，李宗杰，李蓓蓓，劉珂，邵東華，馬志永，魏建超*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，最早出現(xiàn)在20世紀80年代末，幾乎同時出現(xiàn)在北美和歐洲并迅速傳播到世界上大多數(shù)豬生產(chǎn)國[1-2]，被認為是世界上最具經(jīng)濟意義的豬病原體之一。PRRSV能感染所有年齡階段的豬，但妊娠母豬和仔豬的臨床癥狀更為嚴重。懷孕母豬在妊娠晚期感染PRRSV可能導(dǎo)致死胎、胎兒部分自溶和產(chǎn)木乃伊胎兒，而感染PRRSV的仔豬可能出現(xiàn)臨床癥狀，包括發(fā)燒、嚴重呼吸困難、厭食、嗜睡、眼瞼水腫、耳根變藍或變紅[3-5]。1996年，我國郭寶清首次從流產(chǎn)死胎中分離到該病的病原[6]。自2006年暴發(fā)以豬高熱、食欲減退為主要癥狀的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征 (HP-PRRS)之后，到目前為止，該病一直在我國肆虐流行，區(qū)域性暴發(fā)時有發(fā)生[7-9]。PRRSV是有囊膜的不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，根據(jù)病原學(xué)分類，其屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬[10]，病毒基因組全長約15.5 kb，包含至少10個開放閱讀框(ORFs)，ORF1a與ORF1b編碼PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2至ORF7編碼結(jié)構(gòu)蛋白，其中N蛋白是由ORF7編碼的結(jié)構(gòu)蛋白[11-12]。

N蛋白與病毒基因組相互作用形成PRRSV的核衣殼蛋白[13]，N蛋白的編碼基因缺失會導(dǎo)致病毒的傳染性完全消失。然而，有研究表明，通過構(gòu)建穩(wěn)定表達N蛋白的互補細胞系可以拯救出單輪感染性PRRSV復(fù)制子顆粒[14]。N蛋白由PRRSV ORF7編碼，分子量約為14～15 kDa。該蛋白在病毒粒子中含量最高[15]，約占病毒粒子蛋白質(zhì)含量40%，其主要功能是包裝病毒基因組RNA[16]。N蛋白還包含一個核定位信號，引導(dǎo)N蛋白易位到感染細胞的核仁，研究表明N蛋白核定位信號(NLS)與PRRSV致病性有關(guān)[17-18]。 N蛋白在自然宿主中具有高度的免疫原性[19]，在PRRSV感染機體1周后，就能檢測到針對N蛋白的抗體，并且抗體的水平很高，能在體內(nèi)持續(xù)存在半年以上，所以其通常被用于作為病原檢測時的靶蛋白。然而，其抗體不是中和抗體，不具有保護性[20-22]。由于該蛋白在整個PRRSV中高度保守，因此N蛋白作為病毒檢測以及疾病的診斷具有很好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細胞和毒株

猴腎細胞(Marc-145)、人胚腎細胞(293T)、慢病毒載體pSin-Ires-Puro、pRSV-Rev質(zhì)粒、pSPAX2質(zhì)粒、pMD2.G質(zhì)粒及PRRSV SH1毒株均由上海獸醫(yī)研究所豬傳染病風(fēng)險預(yù)警與阻斷和防控團隊保存，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自TIANGEN公司。

1.2 主要試劑

T4 DNA Ligase 購自 NEB 公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ和蛋白Marker購自Thermo Fisher Scientific公司；TIANamp Genomic DNA Kit 購自天根生化科技有限責(zé)任公司；TurboFect Transfections Reagent購自Invitrogen公司；高糖DMEM購自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清FBS購自Biosera公司；PRRSV N蛋白多克隆抗體與單克隆抗體均由上海獸醫(yī)研究所豬傳染病風(fēng)險預(yù)警與阻斷和防控團隊保存；HRP標記的山羊抗兔多克隆抗體購自Abcam公司；Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse購自Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)慢病毒載體pSin-Ires-Puro和PRRSV SH1株的基因序列用SnapGene軟件設(shè)計一對特異性物，由上海睿勉生物科技有限公司合成，其序列如下(斜體加下劃線為限制性內(nèi)切酶位點)：

EcoRⅠ F：gGAATTCgccaccatgccaaataacaacg，

BamHⅠ R：cgGGATCCtcatgctgagggtg。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以PRRSV SH1株感染性克隆質(zhì)粒為模板，PCR擴增N蛋白基因序列，將PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后純化回收，將回收后的目的片段與慢病毒載體pSin-Ires-Puro分別用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，純化回收后使用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂板、搖菌后抽提質(zhì)粒進行PCR鑒定，將鑒定后的陽性質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序鑒定，并將測序正確的重組慢病毒質(zhì)粒命名為pSin-Ires-Puro-N。

1.5 慢病毒包裝

使用TurboFect Transfections Reagen轉(zhuǎn)染試劑，將重組慢病毒質(zhì)粒pSin-Ires-Puro-N及包裝輔助質(zhì)粒psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev共轉(zhuǎn)染293T細胞，分別于24 h、48 h、72 h收集病毒上清液，4 000 r/min離心10 min去除細胞沉淀，暫時置于4 ℃保存。

1.6 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞篩選

分階段將1.5中24 h、48 h、72 h收集的慢病毒液感染Marc-145細胞(6孔板)，同時設(shè)置未感染細胞作為陰性對照，待細胞單層長滿后，將細胞以1∶2傳至2個6孔板中，并加入嘌呤霉素篩選。每隔2 d更換1次新鮮的含有嘌呤霉素的10% DMEM篩選液，直至陰性對照細胞全部死亡后停止篩選。對初篩后的Marc-145細胞進行間接免疫熒光(IFA)和蛋白免疫印跡(Western blot)鑒定。將初步鑒定后的細胞進行計數(shù)，分別用有限稀釋法和終點稀釋法將細胞以1個/100 μL的密度轉(zhuǎn)移至96孔板中進行單克隆篩選。1周后，細胞會明顯聚縮成團生長，挑選生長狀態(tài)良好的單一細胞克隆繼續(xù)孵育培養(yǎng)，每隔3 d更換一次新鮮的15% DMEM，將單克隆細胞擴大培養(yǎng)并傳至10代后，對所篩選的細胞系進行鑒定。

1.7 嘌呤霉素初篩后Western blot鑒定

將嘌呤霉素初步篩選后的細胞進行Western blot鑒定，設(shè)置空載轉(zhuǎn)染細胞對照及陽性對照。收集細胞，提取蛋白后經(jīng)5×SDS-PAGE loading buffer處理，12%聚丙烯凝膠進行SDS-PAGE，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜，5%脫脂乳室溫搖床封閉3 h。以PRRSV N蛋白多克隆抗體作為一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌15 min，共洗3次。以HRP標記山羊抗兔IgG多抗作為二抗，室溫搖床孵育1 h，TBST洗滌15 min，共洗3次。用凝膠成像系統(tǒng)曝光并分析結(jié)果。

1.8 嘌呤霉素初篩后IFA鑒定

將嘌呤霉素初步篩選后的細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板過夜培養(yǎng)，設(shè)置正常細胞作為對照。用預(yù)冷4%多聚甲醛4 ℃固定30 min；用1×NP40室溫孵育15 min，使細胞膜通透。加入封閉液室溫封閉30 min。以PRRSV N蛋白單克隆抗體作為一抗室溫孵育1 h，以羊抗鼠Alexa Fluor488作為二抗室溫避光孵育1 h，DAPI室溫避光孵育15 min。置于熒光顯微鏡下觀察蛋白表達情況。

1.9 細胞系的PCR鑒定

為鑒定N蛋白基因是否整合到Marc-145細胞基因組中，用TIA Namp Genomic DNA Kit提取篩選得到的細胞系DNA，PCR擴增N蛋白基因序列，1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。

1.10 細胞系的IFA鑒定

按照1.8 的操作步驟，將篩選出的不同的單克隆細胞系進行IFA，觀察試驗結(jié)果。

1.11 細胞系的Western blot鑒定

按照1.7的操作步驟，將篩選出的不同的單克隆細胞系進行Western blot試驗，分析試驗結(jié)果。

1.12 N蛋白表達灰度值分析

使用ImageJ軟件對Western blot的結(jié)果條帶進行灰度值分析，通過將目的蛋白的灰度值除于內(nèi)參的灰度值，以校正誤差，得到所篩選出的不同單克隆細胞中N蛋白表達的相對含量，從而篩選出N蛋白表達量相對較高的單克隆細胞系。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒pSin-Ires-Puro-N的構(gòu)建與鑒定

以PRRSV SH1株感染性克隆質(zhì)粒模板，PCR擴增PRRSV N蛋白基因序列，長度為372 bp，純化回收后，用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切并克隆到pSin-Ires-Puro慢病毒載體上，PCR鑒定后(圖1)送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序鑒定，將測序正確的重組慢病毒質(zhì)粒命名為pSin-Ires-Puro-N。

A. N基因PCR擴增(M. DL2000；1. N基因擴增產(chǎn)物)；

2.2 慢病毒包裝與轉(zhuǎn)染細胞后的初步篩選與鑒定

將重組慢病毒質(zhì)粒pSin-Ires-Puro-N與psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev 3個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染393T細胞，收集轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h的慢病毒上清液。將收集的慢病毒上清液感染Marc-145細胞，加入嘌呤霉素篩選細胞，Western blot檢測到初步篩選的細胞在14.5 kDa處有目的條帶(圖2)，與N蛋白預(yù)期條帶大小相符。IFA鑒定結(jié)果顯示(圖3)，初篩后的Marc-145細胞中有特異性綠色熒光信號，證明已經(jīng)初步篩選出表達N蛋白的Marc-145細胞。

M.26616蛋白Marker；1. 表達N蛋白的Marc-145細胞；2. 陽性對照；3. 轉(zhuǎn)染慢病毒空載。

圖3 IFA鑒定初篩后Marc-145細胞中N蛋白表達

M.DL2000；1～5. 篩選出的5個表達N蛋白(N1、N2、N3、N4、N5)的Marc145細胞系。

2.3 細胞系的篩選及鑒定

將嘌呤霉素初步篩選后的細胞分別用有限稀釋法和終點稀釋法進行單克隆篩選，成功篩選得到5個表達N蛋白的Marc-145細胞系。將細胞傳至10代后，提取N1～N5細胞系的基因組DNA，分別用PCR 擴增N蛋白基因片段，凝膠電泳結(jié)果顯示在372 bp左右有特異性條帶(圖4)，證明N蛋白基因已成功整合到Marc-145細胞基因組中。IFA結(jié)果顯示，篩選的單細胞克隆中有特異性綠色熒光信號(圖5)。提取N1～N5細胞系總蛋白，Western blot結(jié)果顯示，篩選的細胞系均在14.5 kDa處有目的條帶(圖6)，且根據(jù)灰度值分析結(jié)果顯示，N1-Marc-145和N5-Marc-145細胞系中N蛋白表達量相對較高(圖7)。這些結(jié)果表明成功獲得穩(wěn)定表達PRRSV N蛋白的Marc-145細胞系。

圖5 IFA鑒定細胞系N蛋白的表達

N1～N5. 篩選的5個表達N蛋白的Marc-145細胞系；6. 正常Marc-145細胞對照；7. 陽性對照。

圖7 N蛋白表達灰度值分析

3 討論

慢病毒包裝是目前應(yīng)用最廣的用于構(gòu)建穩(wěn)定表達外源蛋白細胞系的方法，該病毒包裝系統(tǒng)的基本原理是將攜帶目的基因的慢病毒載體整合進宿主細胞基因組中，以實現(xiàn)目的基因在宿主細胞中長久表達。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，同時也屬于復(fù)制缺陷型病毒，具有穩(wěn)定、高效等特點，是細胞分子生物學(xué)上用于篩選穩(wěn)定細胞系的理想工具[23-24]。PRRSV的體外增殖主要在Marc-145細胞中進行，通過構(gòu)建穩(wěn)定表達PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白的Marc-145細胞系，對PRRSV的基因功能、疫苗研發(fā)等生物學(xué)研究具有重要作用。

針對PRRSV相關(guān)細胞系的研究中，Sagong等[25]分別構(gòu)建了表達歐洲型(PRRSV-Ⅰ型)和北美型(PRRSV-Ⅱ型)核衣殼(N)蛋白的BHK細胞系，該細胞系能與N蛋白特異性抗體以及針對兩種PRRSV基因型的豬高免血清反應(yīng)良好。基于這些觀察，作者認為表達N蛋白的細胞系可以作為一種有價值的研究工具，用于檢測豬的PRRSV抗體。此外，基于細胞系IFA和過氧化物酶單層(IPMA)試驗的敏感性和特異性，作者表示該細胞系也可以作為ELISA診斷抗原的潛在來源。Lee等[26]構(gòu)建了穩(wěn)定表達CD163的豬肺泡巨噬細胞(PAM)系，該細胞系能夠高水平表達CD163，不僅不會影響Ⅰ型和Ⅱ型 PRRSV毒株的復(fù)制，而且可以促進PRRSV增殖，該細胞系的獲取有利于促進病毒致病機理的研究。Wu等[27]構(gòu)建了穩(wěn)定表達豬pCD163受體蛋白的Marc-145細胞系，證實PRRSV的增殖速度及病毒滴度在表達pCD163的Marc-145細胞中均有所提高，該細胞系的構(gòu)建為促進病毒繁殖和疫苗生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。Welch等[28]分別缺失PRRSV基因組中的ORF2和ORF4基因，并構(gòu)建了穩(wěn)定表達PRRSV GP2蛋白與GP4蛋白的Marc-145細胞系，將兩種缺失突變體分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的互補細胞系后，均能成功拯救出病毒，拯救的缺陷病毒雖然在正常Marc-145細胞和PAM細胞中只能進行單輪感染，證明其有良好的生物安全性。因此，構(gòu)建穩(wěn)定表達PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白的互補細胞系可以作為PRRSV新型疫苗研發(fā)的一個有用工具。

綜上，本研究通過慢病毒表達系統(tǒng)，成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達PRRSV N蛋白的Marc-145細胞系，并驗證了該細胞系與PRRSV N蛋白特異性抗體有良好的反應(yīng)性。穩(wěn)定表達PRRSV N蛋白的細胞系是一種有價值的研究工具，可以作為PRRSV血清學(xué)診斷試劑的潛在研究工具，也能為研制PRRS新型復(fù)制缺陷型疫苗奠定基礎(chǔ)。