李炎林，蔣文奪，馮躍，賈逸敏，趙茹茜*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生理生化重點實驗室，江蘇 南京 210095)

在蛋雞的集約化養(yǎng)殖中，脂肪肝出血綜合征(fatty liver hemorrhagic syndrome，F(xiàn)LHS)是常見的營養(yǎng)代謝性疾病[1]，主要表現(xiàn)為肝臟腫大油膩，質(zhì)地明顯變脆且顏色呈棕色到土黃色。該病主要發(fā)生于產(chǎn)蛋率高峰期或者產(chǎn)蛋后期的雞群，發(fā)病率為5%～30%[2-3]，發(fā)病雞群產(chǎn)蛋率下降5%～60%[2，4]，死亡率高達(dá)20%[5]，嚴(yán)重影響蛋雞健康及其生產(chǎn)性能，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。FLHS肝臟脂肪異常蓄積的主要原因是脂質(zhì)代謝紊亂。肝脂穩(wěn)態(tài)決定于肝細(xì)胞中脂質(zhì)從頭合成和脂質(zhì)攝取及脂肪酸β-氧化和極低密度脂蛋白(VLDL)攜甘油三酯外排之間的平衡，脂質(zhì)獲取大于脂質(zhì)清除是導(dǎo)致脂質(zhì)沉積的關(guān)鍵因素[6]。FLHS一旦發(fā)生，需較長的時間治療和調(diào)整才見效，極大影響蛋雞養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益[5]。

澤瀉(Alisma)是一種水生植物，其塊狀根莖可入藥，含三萜、倍半萜等活性成分[7-8]。澤瀉具有多種生物學(xué)功能，包括利尿[9-10]、抗炎[11-12]和抗動脈粥樣硬化[13-14]等。大量研究表明，澤瀉能有效緩解非酒精性脂肪肝(NAFLD)[15-17]。澤瀉提純后的單體2，3乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A能夠顯著調(diào)控乙酰CoA羧化酶1(ACC1)的磷酸化緩解小鼠高脂飲食和HepG2細(xì)胞模型中游離脂肪酸誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積[18-19]。在HepG2細(xì)胞上，澤瀉醇通過降低ACC1及脂肪酸合酶(FASN)的表達(dá)緩解棕櫚酸/油酸誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積[20]。Ahn等[15]發(fā)現(xiàn)，由澤瀉組成的方劑能夠通過降低ACC1表達(dá)緩解高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠脂質(zhì)變性。這些結(jié)果表明，澤瀉可能通過調(diào)控脂質(zhì)從頭合成緩解哺乳動物NAFLD。然而，澤瀉能否緩解高能低蛋白誘導(dǎo)的蛋雞肝臟脂質(zhì)沉積尚不清楚。由于澤瀉提純成本較高，不適合作為蛋雞飼料添加劑使用，而澤瀉本身成本較低，若直接使用澤瀉粉，在生產(chǎn)上更有應(yīng)用前景。因此，本試驗通過飼喂高能低蛋白日糧人工誘發(fā)蛋雞肝脂沉積，研究澤瀉粉對肝脂沉積的影響，旨在為防控FLHS提供解決方案。

A.產(chǎn)蛋率；B.蛋重；*表示與CON組比較，P<0.05。

A. 脂質(zhì)攝入相關(guān)基因mRNA表達(dá)(n=6)；B. 脂質(zhì)清除相關(guān)基因mRNA表達(dá)(n=6)。

A. GR蛋白WB結(jié)果(n=8)；B. GR mRNA相對表達(dá)(n=6)；C. GR蛋白相對表達(dá)量(n=8)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗動物中心內(nèi)進(jìn)行。澤瀉購自南京中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院。澤瀉打磨成粉，篩分粒度為140目，飼料中按澤瀉醇含量72 mg/kg添加[21]。澤瀉醇含量測定參考王巧娥等[22]的方法，所使用的標(biāo)準(zhǔn)品2，3乙酰澤瀉醇購自上海源葉生物科技有限公司(B21641-20 mg)，純度≥98%。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

海蘭褐蛋雞72只,體重(1.69±0.09)kg,260日齡，飼養(yǎng)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心，室溫約24 ℃，光照16L：8D。每籠3只蛋雞，雞籠規(guī)格60 cm×46 cm×44 cm，安裝乳頭自動飲水器以提供飲水。蛋雞隨機(jī)分成3組，對照組(CON)飼喂對照日糧(10.9 MJ/kg代謝能，16.9%粗蛋白)，高能低蛋白日糧組(HF)飼喂高能低蛋白日糧(13.0 MJ/kg代謝能，12.1%粗蛋白)，澤瀉添加組(HFA)在飼喂高能低蛋白日糧的基礎(chǔ)上添加澤瀉粉，試驗持續(xù)12周。飼料配方和營養(yǎng)成分組成如表1所示，在整個試驗的過程中，母雞每日限飼喂養(yǎng)，110 g/只，自由飲水。12周之后，每組籠中隨機(jī)選擇1只母雞，快速斷頭處死，肝臟樣品在液氮中快速冷凍，并保存在-80 ℃。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)成分

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 產(chǎn)蛋性能

每天記錄產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重并計算產(chǎn)蛋率及平均蛋重，計算方法參考冉茜等[23]方法。

1.3.2 蛋品質(zhì)測定

每組隨機(jī)選擇8枚蛋，進(jìn)行蛋品質(zhì)測定。

蛋殼強(qiáng)度(kg/cm2)：蛋受到外力碰撞后的承受能力，是反映蛋殼品質(zhì)的主要指標(biāo)。使用蛋殼強(qiáng)度測定儀(WW-2A，Nanjing Soil Instrument Factory Co.，Ltd.，南京)檢測蛋殼重(g)、蛋黃重(g)；使用分析天平檢測蛋殼厚度(mm)，利用螺旋測微器對雞蛋的大頭小頭及中間部分(除去蛋黃膜)進(jìn)行測量，求3個點平均值，即為蛋殼厚度；蛋白高度(mm)、蛋黃顏色指數(shù)、哈氏單位使用多功能蛋品質(zhì)分析儀(EMT-5200，Robotmation Co.，Ltd.，東京，日本)進(jìn)行檢測。

1.3.3 血液生化指標(biāo)檢測

使用全自動生化分析儀(Hitachi7020，Tokyo，Japan)測定血漿中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性(貨號H001)和甘油三酯(貨號H201)、總膽固醇(貨號H202)含量。上述試劑均購自美康生物科技有限公司。

1.3.4 肝臟中甘油三酯檢測

肝臟中甘油三酯檢測試劑盒(貨號E1013)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，具體根據(jù)試劑盒附帶的說明書進(jìn)行檢測。

1.3.5 肝臟油紅染色

雞的肝臟冰凍切片(10 μm)室溫靜置30 min，蒸餾水洗滌3遍(去掉包埋劑)，每次5 min；隨后用60% 異丙醇浸洗2 min；將切片置于油紅工作液染色，蒸餾水洗滌3遍，蘇木精復(fù)染，然后用甘油明膠封片，顯微鏡觀察。

1.3.6 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測

稱取30 mg肝臟樣品(肝臟組織提前用液氮研磨)，使用TRIzol法提取組織中總RNA，按照試劑盒內(nèi)附帶的說明書進(jìn)行操作。用NanoDrop檢測RNA的濃度和純度(OD260/OD280比值在1.8 ～ 2.0之間)[24]。按照試劑盒說明書(AE341，全式金)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR引物根據(jù)NCBI上相關(guān)序列，使用Primer 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計，序列見表2。

表2 RT-qPCR引物序列

1.3.7 蛋白含量的Western blot(WB)分析

RIPA裂解液配制：1% Triton-100，0.5% 脫氧膽酸鈉，150 mmol/L NaCl，0.1% SDS，50 mmol/L Tris以及1%蛋白酶抑制劑(B14001，Bimake)。稱取30 mg肝臟樣品，加入預(yù)冷的RIPA蛋白裂解液。使用自動勻漿器勻漿，5 000 r/min，20 s 1次，重復(fù)8次。勻漿結(jié)束后將樣品置于冰上靜置10 min，8 000 r/min 離心10 min，取上清液，即為全蛋白提取物，使用蛋白印跡方法檢測肝臟組織GR含量，蛋白質(zhì)的上樣量為40 μg，使用Image J 軟件計算相關(guān)蛋白灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

本試驗?zāi)Ｐ筒捎脙刹絫檢驗(CONvs. HF和HFvs. HFA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，使用GraphPad Prism進(jìn)行繪圖，結(jié)果以“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，P<0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋雞產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)指標(biāo)及血液生化指標(biāo)

以周為單位計算蛋雞的產(chǎn)蛋率，得到折線圖，結(jié)果表明在整個試驗的過程中，蛋雞的產(chǎn)蛋率沒有顯著性變化(圖1A)。以周為單位計算雞蛋重量，得到折線圖(圖1B)，與CON組相比，第1～4周HF組蛋重沒有顯著變化，而5～8周、9～12周蛋重顯著降低(P<0.05)。

蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度、蛋殼重、蛋黃重、蛋白高度、蛋黃顏色指數(shù)及哈氏單位進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)蛋品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)無顯著性變化。剖檢之后對血漿中的肝損傷、脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測，谷丙轉(zhuǎn)氨酶在該模型中無顯著性變化，說明該模型可能并未造成肝損傷。同時血漿中膽固醇和甘油三酯也無顯著性變化(表3)。

表3 蛋雞的蛋品質(zhì)及血液生化指標(biāo)

2.2 蛋雞肝臟中甘油三酯含量

蛋雞肝臟組織病理學(xué)評估結(jié)果表明，HF組和HFA組的切片上均可以觀察到脂滴(圖2A)，但是澤瀉粉的添加顯著降低了肝臟中的脂質(zhì)沉積(圖2B)。肝臟中甘油三酯含量的檢測結(jié)果支持以上觀點(圖2C)，與對照組比較，HF組甘油三酯含量顯著升高(P<0.05)；與HF組相比，HFA組甘油三酯含量顯著降低(P<0.05)。

2.3 蛋雞肝臟中脂質(zhì)代謝基因表達(dá)

RT-qPCR檢測肝臟脂攝入相關(guān)基因(圖3A)和脂清除相關(guān)基因(圖3B)，與CON組比較，HF組脂質(zhì)從頭合成基因ACC、FASN及硬脂酰輔酶 A 脫飽和酶-1 (SCD1)顯著升高(P<0.05)；與HF組比較，HFA組上述基因顯著降低(P<0.05)。

2.4 蛋雞肝臟中核轉(zhuǎn)錄因子GR基因和蛋白表達(dá)

RT-qPCR檢測肝臟GR的mRNA表達(dá)量(圖4B)，與CON相比較，HF組GR mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與HF組比較，HFA組GR mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。Western blot 檢測GR蛋白表達(dá)水平(圖4A，4C)，與CON組相比較，HF組GR 蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與HF組比較，HFA組蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，與RT-qPCR結(jié)果一致。

3 討論

FLHS是一種常見的慢性代謝性疾病，是目前蛋雞集約化養(yǎng)殖過程中死亡率最高的疾病[25]。目前已報道有多種藥物可以緩解蛋雞脂肪肝。女貞子提取物[26]、苜草素[27]及甜菜堿[28]均可有效地緩解使用高能低蛋白日糧人工誘發(fā)的蛋雞FLHS。在臨床實踐中，孟憲勇等[4]指出包含澤瀉的當(dāng)歸芍藥湯可以有效地控制FLHS的發(fā)生。許英民[3]指出茯苓、澤瀉、白皮、厚樸、陳皮、當(dāng)歸及枳殼等水劑可以使雞群FLSH得到合理控制。這些報道表明藥物添加可以有效預(yù)防FLHS的發(fā)生。在嚙齒動物模型中，澤瀉提取物[17，29-30]、包含澤瀉的方劑[15，31-32]及澤瀉提取物單體[16，18-19，33]均可以有效緩解不同方式誘發(fā)的NAFLD。我們的試驗結(jié)果表明，在高能低蛋白模型下，蛋雞肝臟甘油三酯顯著升高，同時油紅染色發(fā)現(xiàn)肝臟中的脂滴明顯增多，添加澤瀉粉顯著逆轉(zhuǎn)蛋雞高能低蛋白日糧誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積。在哺乳動物上，NAFLD包括單純的脂肪變性、肝炎，一旦發(fā)生炎癥進(jìn)而可以發(fā)展成肝纖維化、肝硬化甚至肝癌[34]。單純的脂肪變性表現(xiàn)為肝臟中甘油三酯的升高，但是無其他的病理學(xué)特征，是一種良性脂肪肝[35]。谷丙轉(zhuǎn)氨酶是反應(yīng)肝損傷的指標(biāo)，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在該模型下沒有顯著性變化，暗示蛋雞肝臟還未發(fā)展到肝損傷階段，以上結(jié)果表明澤瀉粉可以緩解蛋雞高能低蛋白日糧誘導(dǎo)的良性脂肪肝。

脂質(zhì)從頭合成基因(FASN、ACC1和SCD1)在肝細(xì)胞中脂質(zhì)內(nèi)源性輸入中扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn)FASN、ACC1及SCD1在NAFLD發(fā)生時顯著升高[36-37]。本研究結(jié)果顯示，在高能低蛋白日糧飼喂模型中，脂從頭合成基因(FASN、ACC1和SCD1)mRNA顯著增加，而脂質(zhì)攝入(CD36)、脂質(zhì)β氧化(CPT1、PPARα)、脂質(zhì)外排(MTTP)及脂解(ATGL、HSL)等調(diào)控基因在該模型下沒有顯著變化，日糧添加澤瀉粉能夠顯著逆轉(zhuǎn)高能低蛋白日糧誘導(dǎo)的FASN、ACC1和SCD1 mRNA升高，說明澤瀉粉通過調(diào)控脂質(zhì)從頭合成緩解蛋雞肝臟脂質(zhì)沉積。

實驗室之前的研究表明，在皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的雞肝臟脂質(zhì)沉積模型中GR通過與啟動子結(jié)合上調(diào)FASN、ACC1和SCD1基因的表達(dá)[38]。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，高能低蛋白處理組可以顯著促進(jìn)GR mRNA和蛋白的表達(dá)，說明高能低蛋白日糧可能通過激活GR，調(diào)控脂質(zhì)的從頭合成，從而促進(jìn)了肝臟的脂質(zhì)沉積。澤瀉粉添加顯著逆轉(zhuǎn)高能低蛋白日糧誘導(dǎo)GR mRNA水平和蛋白的含量的升高，原因可能是澤瀉中三萜類化合物可以作為配體與GR結(jié)合，抑制GR的活性[39]。

4 小結(jié)

澤瀉粉添加到蛋雞飼料中可以有效緩解高能低蛋白日糧誘導(dǎo)的肝臟甘油三酯的升高，導(dǎo)致肝臟脂滴明顯減少。在基因水平上，澤瀉顯著降低了高能低蛋白日糧誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝基因FASN、ACC1和SCD1以及核轉(zhuǎn)錄因子GR基因和蛋白水平的升高，說明澤瀉可能通過抑制GR降低從頭合成基因的表達(dá)，從而緩解肝臟中的脂質(zhì)沉積。綜上，高能低蛋白日糧可能通過GR介導(dǎo)的脂質(zhì)從頭合成基因過量表達(dá)，導(dǎo)致蛋雞肝臟脂質(zhì)沉積；澤瀉能夠通過減輕上述反應(yīng)，對蛋雞FLHS有一定的保護(hù)作用。