顧 欣, 黃凱悅, 田彥梅, 馬群飛, 楊 娜

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

沼氣發(fā)酵是秸稈和畜禽糞污資源化利用的主要方式之一,能有效處理有機(jī)廢棄物,減少污染源,保護(hù)環(huán)境,具有經(jīng)濟(jì)效益、環(huán)境效益和能源效益[1-2]。截止2020年,我國(guó)大中小型沼氣工程已建成13萬(wàn)余處[3],每年產(chǎn)生多達(dá)1.3 億t的沼渣和沼液[4]。沼渣通常含有大量未腐熟的有機(jī)質(zhì)和含氮化合物,具有較高的化學(xué)需氧量,對(duì)植物具有高毒性,易造成燒苗或其他植物病害[5]。因此,必須對(duì)沼渣進(jìn)行降毒處理才能將環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)降至最低[5]?；谡釉胸S富的有機(jī)碳和植物養(yǎng)分,利用微生物作用進(jìn)行好氧堆肥,將其轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)肥料是當(dāng)前主要的資源化利用方式[6]。沼渣成分主要有纖維素、木質(zhì)素、果膠質(zhì)等非礦物質(zhì)和礦物質(zhì)等,其中纖維素含量占64%[7]。這些物質(zhì)在好氧堆肥過(guò)程中會(huì)釋放大量熱量,使高溫期的堆溫超過(guò)60 ℃。此階段正是纖維素和木質(zhì)素等大分子物質(zhì)降解的重要階段[8]。因此,分離篩選并應(yīng)用耐高溫的纖維降解菌,將促進(jìn)好氧堆肥的生物進(jìn)程,對(duì)沼渣肥料化生產(chǎn)具有重要意義。環(huán)境中不同微生物之間的關(guān)系較為復(fù)雜。一種微生物可以利用其它微生物的代謝產(chǎn)物作為底物進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖,或者不同微生物分別利用環(huán)境中的不同物質(zhì)[9-10]。因此,兩種或兩種以上相容的微生物能實(shí)現(xiàn)很多單一菌株難以實(shí)現(xiàn)的功能[11]。這說(shuō)明微生物以群體形式存在能夠?yàn)閭€(gè)體生存提供更好的保障,有利于群體對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)[12]。為了促進(jìn)好氧堆肥發(fā)酵,縮短生產(chǎn)時(shí)間,針對(duì)纖維素和木質(zhì)素降解功能構(gòu)建復(fù)合菌劑成為研究熱點(diǎn)[13]。用于菌劑復(fù)配的有多種真菌、細(xì)菌和放線菌,其中真菌資源開發(fā)較早,研究較多[14]。近年來(lái),具有纖維降解功能的細(xì)菌越來(lái)越受到重視。傅冰等[15]從白蟻腸道中分離出3株纖維素降解細(xì)菌,經(jīng)復(fù)配試驗(yàn)明確了蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)和鏈球菌(Streptococcussp.)的組合產(chǎn)酶能力高于單一菌株或其他組合,纖維素酶活性達(dá)3 670 U/L。單德鑫等[16]從農(nóng)村自然堆肥還田土中篩選出耐15 ℃低溫的纖維素降解細(xì)菌。何宙陽(yáng)等[17]以秸稈和豬糞為堆肥原料,以米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)NJAU-F4-5、芽胞桿菌NJAU-N20和芽胞桿菌NJAU-N30制備復(fù)合菌劑,發(fā)現(xiàn)添加復(fù)合菌劑的堆體升溫速率最快,高溫期溫度最高,后熟期降溫更快且物料腐熟度最好,表明接種復(fù)合菌劑能有效驅(qū)動(dòng)堆肥發(fā)酵進(jìn)程。以上纖維降解菌均具有較好的促發(fā)酵作用,但是并未對(duì)菌株的耐高溫性能進(jìn)行探討。考慮到堆肥物料的成分差異,有必要針對(duì)沼渣開展耐高溫纖維降解菌的篩選和復(fù)配進(jìn)行研究。本研究以纖維素酶活性為核心指標(biāo),分離篩選耐高溫的纖維降解細(xì)菌,構(gòu)建復(fù)合菌劑并通過(guò)場(chǎng)地試驗(yàn)進(jìn)一步探明復(fù)合菌劑對(duì)沼渣堆肥物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)的影響,重點(diǎn)測(cè)定不同發(fā)酵階段物料的濾紙酶活性(Filter paper activity,FPA)、漆酶活性(Laccase activity,LAA)、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性(Lignin peroxidase activity,LPA)和錳過(guò)氧化物酶活性(Manganese peroxidase activity,MPA),以評(píng)價(jià)該復(fù)合菌劑對(duì)沼渣堆肥的促發(fā)酵效果,為沼渣快速肥料化提供菌種支撐和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 從寧夏中衛(wèi)市采集自然堆肥樣品4份、稻秸腐爛物樣品3份和新鮮牛羊糞便樣品5份。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①LB培養(yǎng)基用于纖維素降解菌株的富集培養(yǎng);②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于纖維素降解菌的分離和菌株培養(yǎng);③羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉20.0,Na2HPO42.5,KH2PO41.5,蛋白胨2.5,酵母浸膏粉0.5,瓊脂20,去離子水定容至1 L,pH調(diào)至7.0[19],用于高效纖維素降解菌的篩選;④發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮50.0,蛋白胨3.0,NaCl 5.0,(NH4)2SO43.0,KH2PO41.0,MgSO4·7H2O 0.3,去離子水定容至1 L,pH調(diào)至7.0,用于測(cè)定纖維素和木質(zhì)素降解酶活性;⑤濾紙條崩解培養(yǎng)基: (NH4)2SO43.0,KH2PO41.0,Mg SO4·7H2O 0.4,酵母浸膏粉0.1,去離子水定容至1 L,調(diào)pH 7.0[20],用于濾紙條崩解試驗(yàn)。以上培養(yǎng)基均1×105Pa滅菌30 min。

1.1.3 堆肥材料與場(chǎng)地 堆肥試驗(yàn)地點(diǎn)位于寧夏中衛(wèi)市鎮(zhèn)羅鎮(zhèn),有遮雨設(shè)施。發(fā)酵物料(新鮮沼渣,由寧夏阜康生物科技股份有限公司提供)pH值7.21,有機(jī)質(zhì)含量811.44 g/kg,全氮含量17.93 g/kg,全磷含量21.71 g/kg,全鉀含量15.97 g/kg,含水率66.25%。

1.1.4 主要試劑與儀器設(shè)備 ①HAc-NaAc 緩沖液(pH 3.8):0.2 mol/L的NaAc 1.2 mL與0.2 mol/L的HAc 8.8 mL混勻;②1 mmol/L ABTS溶液:稱取0.514 6 g ABTS溶于1 L HAc-NaAc 緩沖液(pH 3.8);③10 mmol/L藜蘆醇溶液:稱取0.168 1 g藜蘆醇溶解至1 L去離子水中;④酒石酸緩沖液(50 mmol/L,pH 4.5):將50 mmol/L酒石酸溶液17 mL與483 mL酒石酸鈉溶液混合均勻;⑤HAc-NaAc緩沖液(pH 4.8):0.2 mol/L的NaAc 5.9 mL與0.2 mol/L的HAc 4.1 mL混勻。高壓蒸汽滅菌鍋(LDZX-75KBS,上海申安);紫外分光光度計(jì)(UV754,上海奧析);超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD,蘇凈安泰);電熱恒溫培養(yǎng)箱(SPX-250-Z,上海一恒);恒溫氣浴振蕩箱(ZD-85,上海予卓);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(101-1S,力辰科技);消煮爐(KXL-1010,常州諾基);火焰光度計(jì)(6400A,上海精科);可見光分光光度計(jì)(752N,中科瑞捷)。

1.2 方法

1.2.1 富集培養(yǎng)與菌種的分離篩選 ①富集培養(yǎng)與細(xì)菌分離:將10.0 g樣品與90 mL無(wú)菌水震蕩30 min混勻。取1 mL懸液接入LB液體培養(yǎng)基,60 ℃、180 r/min富集培養(yǎng)24 h。采用稀釋平板法對(duì)富集培養(yǎng)后的懸液進(jìn)行細(xì)菌分離,60 ℃培養(yǎng)48 h,挑取形態(tài)具有差異的菌落轉(zhuǎn)接于新的牛肉膏蛋白胨平板上,經(jīng)劃線法純化,4 ℃斜面保存。②初篩:將菌落點(diǎn)接于CMC-Na平板,60 ℃倒置培養(yǎng)24 h,滴加剛果紅染液,觀察有無(wú)水解圈,用游標(biāo)卡尺測(cè)量水解圈直徑(D,mm)與菌落直徑(d,mm),計(jì)算D/d比值。根據(jù)比值大小初步確定分離菌株的纖維素酶活性,以D/d值較大者進(jìn)入復(fù)篩。③復(fù)篩:采用濾紙條崩解試驗(yàn),將初篩的菌株分別用無(wú)菌水制備活菌數(shù)為6.9×108cfu/mL的菌懸液,將菌株分別以10%(體積分?jǐn)?shù),下同)接種量接種于濾紙條崩解培養(yǎng)基,60 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d,以不接菌的培養(yǎng)基為對(duì)照,觀察濾紙條的崩解情況。用無(wú)菌水制備活菌數(shù)為6.9×108cfu/mL的菌懸液,將菌株分別以10%接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基,60 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h,5 000 r/min離心10 min,取上清液檢測(cè)纖維素和木質(zhì)素降解酶活性。以濾紙條崩解程度較嚴(yán)重、酶活性較高的菌株為目標(biāo)菌株。

1.2.2 菌株的分類鑒定 目標(biāo)菌株經(jīng)活化,轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨平板28 ℃培養(yǎng)12 h,觀察菌落的生長(zhǎng)狀況和形態(tài)特征。依次開展革蘭染色試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、糖醇發(fā)酵試驗(yàn)和溶血試驗(yàn),依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行細(xì)菌生理生化特性鑒定[21]。提取目標(biāo)菌株DNA,對(duì)其16S rDNA基因進(jìn)行克隆、電泳和回收,委托南京奧維森基因科技有限公司完成測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)是進(jìn)行BLAST,對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定,同時(shí)在庫(kù)中選取相近種屬的基因序列,使用MegaX分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,確定菌株的分類地位。

1.2.3 菌劑的構(gòu)建 ①拮抗試驗(yàn):在牛肉膏蛋白胨平板上對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行交叉劃線培養(yǎng),菌株之間生長(zhǎng)無(wú)影響說(shuō)明兩菌株可以進(jìn)行復(fù)配。②菌株配比試驗(yàn):按1.2.1③制備菌懸液,將W44和X51菌懸液分別以體積比1∶0、0∶1、1∶1、1∶2和2∶1混合制備菌劑,按10%接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基,60 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h,5 000 r/min離心10 min,取上清液檢測(cè)發(fā)酵液中纖維素和木質(zhì)素降解酶活性,以酶活性最高的處理為最優(yōu)菌劑配方。

1.2.4 堆肥發(fā)酵試驗(yàn) 按1.2.1③制備菌懸液,將W44和X51菌懸液以體積比1∶1、1∶2、2∶1混勻制備菌劑,分別添加在400 kg新鮮沼渣中,充分?jǐn)嚢韬?制成1.5 m高的圓錐形發(fā)酵堆,分別為T1、T2、T3處理,以不加菌劑為對(duì)照(CK)。當(dāng)堆溫達(dá)到60 ℃時(shí)進(jìn)行人工翻堆。樣品采集時(shí),從堆體上、中、下部距堆體表面10 cm處分別采集約100 g物料,混合均勻作為1個(gè)樣品,置于無(wú)菌密封袋中,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。堆制2 h后進(jìn)行第1次采樣,作為0 d樣品。以后3 d測(cè)1次堆溫,采樣檢測(cè)pH值和全鹽含量。分別于堆肥的潛育期(Incubation period,IP,第1天)、中溫期(Medium temperature period,MP,第3天)、高溫期(High temperature period,HP,第9天)、腐熟期(Rotten period,RP,第27天)各取1次樣,檢測(cè)物料的有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀含量、纖維素和木質(zhì)素降解酶活性和腐熟度。

1.2.5 檢測(cè)方法 革蘭染色試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、糖醇發(fā)酵試驗(yàn)和溶血試驗(yàn),方法參照文獻(xiàn)[18]。濾紙酶活性(Filter paper activity,FPA)采用3,5-二硝基水楊酸法[18];漆酶活性(Laocase activity,LAA)采用ABTS法,一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化1 μmol ABTS所需的酶量;木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性(Lignin peroxidase activity,LPA)采用藜蘆醇氧化法,一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化藜蘆醇產(chǎn)生1 μmol藜蘆醛所需的酶量;錳過(guò)氧化物酶活性(Manganese peroxidase activity,MPA)采用錳離子氧化法,一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化Mn2+產(chǎn)生1 μmol Mn3+所需的酶量[22]。溫度檢測(cè):每天15:00時(shí)使用電子溫度計(jì)對(duì)堆體中部同一高度(50 cm)隨機(jī)測(cè)量3個(gè)點(diǎn),取平均溫度作為堆體的實(shí)際溫度;pH和全鹽檢測(cè):采用105 ℃烘干法測(cè)定肥料的含水量,每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù),新鮮樣品和去離子水以1∶10(m/V)混合,置于水平搖床振蕩2 h,靜置30 min過(guò)濾后用pH計(jì)和電導(dǎo)儀測(cè)定,每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù);全氮檢測(cè)采用H2SO4-H2O2消煮半微量凱氏定氮法;有機(jī)質(zhì)檢測(cè)采用灼燒法;全磷檢測(cè)采用H2SO4-H2O2消煮釩鉬酸銨比色法;全鉀檢測(cè)采用H2SO4-H2O2火焰光度法[23];腐熟度檢測(cè)采用種子發(fā)芽指數(shù)(Germination index,GI)測(cè)定法[24],用小油菜種子做發(fā)芽試驗(yàn)。GI(%)=((樣品發(fā)芽率×樣品根長(zhǎng))/(對(duì)照發(fā)芽率×對(duì)照根長(zhǎng)))×100%。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)制表與作圖采用Excel 2019和Origin 2018,統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0(P<0.05,n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

2.1.1 菌株初篩 分離純化細(xì)菌38株,而在CMC-Na培養(yǎng)基上有透明圈,即具有纖維素降解能力的菌株13株,其中菌株W44、X51、Y2、Td1、T52的D/d值較高(表1)。菌株X51的菌落直徑具有顯著性且最大,說(shuō)明生長(zhǎng)迅速;菌株W44的D/d最高,為2.79,表明該菌株纖維素降解能力高于其他菌株。

2.1.2 菌株復(fù)篩 初篩獲得的5株菌株對(duì)濾紙的降解情況有差異。菌株W44和X51使濾紙崩解成為糊狀,菌株T52和Y2使濾紙結(jié)構(gòu)嚴(yán)重變形且不完整,菌株Td1僅使濾紙發(fā)生膨脹并彎曲。因此,菌株W44和X51降解纖維能力較強(qiáng),作為目標(biāo)菌株。

2.1.3 菌株酶活性比較 將初篩獲得的5株細(xì)菌進(jìn)行復(fù)篩,酶活性測(cè)定結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明菌株W44的FPA最高,為34 812.69 U/L,只與菌株Td1差異顯著,與其他3株細(xì)菌差異不顯著,菌株X51的FPA也很高。在LAA中,菌株Y2較其他4株菌有顯著性差異;在LPA中,菌株W44、T52和X51沒有顯著性差異,其中菌株X51的酶活性最高,為191.76 U/L;在MPA中,菌株W44有顯著性且酶活性最高。其中菌株W44的FPA和MPA在5株菌中既有顯著性差異且酶活性較高,其他4株菌中T52和X51的木質(zhì)素酶活都較好,但是菌株T52的FPA沒有菌株X51的好。綜合來(lái)看,菌株W44和X51的總體酶活性最好。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 菌株W44的菌落近圓形,邊緣不規(guī)則,質(zhì)地軟,稍有光澤,呈白色,表面粗糙,培養(yǎng)基顏色無(wú)變化(圖1A)。菌體呈桿狀,大小為(1.0～1.2) μm×(3.0～5.0) μm,革蘭染色為陽(yáng)性(圖1B),產(chǎn)芽胞。菌株X51的菌落為圓形,邊緣規(guī)則,呈白色,扁平,表面粗糙,培養(yǎng)基顏色無(wú)變化(圖1C)。革蘭染色為陽(yáng)性(圖1D),產(chǎn)芽胞。根據(jù)形態(tài)學(xué)特性初步鑒定菌株W44和X51均為芽胞桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌。

圖1 菌株W44和X51的菌落形態(tài)和革蘭染色Fig.1 Colony morphology and gram staining of strain W44 and X51A:W44的菌落形態(tài);B:W44菌體的革蘭染色;C:X51的菌落形態(tài);D:X51菌體的革蘭染色A: colony morphology of W44; B: gram staining of W44; C: colony morphology of X51; D: gram staining of X51

2.2.2 菌株生理生化特性 菌株W44和X51的生理生化檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 菌株的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains

2.2.3 菌株分子學(xué)鑒定 將菌株W44和X51的基因測(cè)序結(jié)果登入NCBI,通過(guò)BLAST與庫(kù)中其他細(xì)菌的基因序列進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。菌株W44和X51分別與芽胞桿菌CLY07(MT775468)和MCCC1A00365(NR157735)的序列相似性達(dá)99%和98%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征,鑒定菌株W44為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus),X51為解蛋白芽胞桿菌(Bacillusproteolyticus)?；蚓幪?hào)分別為OM371110和OM371062。

圖2 菌株W44(A)和X51(B)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain W44(A) and X51(B)

2.3 菌劑的復(fù)配

2.3.1 拮抗試驗(yàn) 劃線培養(yǎng)結(jié)果顯示,菌株W44和X51劃線生長(zhǎng)情況良好,交叉處無(wú)溶菌現(xiàn)象,說(shuō)明二者間無(wú)拮抗作用,可進(jìn)行復(fù)配。

2.3.2 菌株的復(fù)配 菌株W44和X51不同配比的纖維素和木質(zhì)素降解酶活性不同(表4)。兩個(gè)菌株復(fù)配處理的FPA均顯著高于單菌處理,且三個(gè)復(fù)配處理間無(wú)顯著差異,菌株W44/X51(1∶2)的FPA最高,為47 725.17 U/L,較菌株W44和X51的單菌酶活性分別增加37.10%和39.71%。不同處理LAA差異較大,菌株W44/X51(1∶2)顯著高于其他處理,為266.97 U/L,比單株菌LAA高近一倍。三個(gè)復(fù)配處理的LPA均顯著高于單株菌,且三者間無(wú)顯著差異,其中菌株W44/X51(1∶2)為675.62 U/L,較菌株W44和X51的單菌處理分別增加371.24%和252.33%。在MPA指標(biāo)上,菌株W44/X51(1∶2)和(2∶1)為586.71 U/L和576.52 U/L,比單株菌高。因此,菌株W44/X51(1∶2)組合表現(xiàn)的酶活性最高,菌株W44/X51(2∶1)稍遜,菌株W44/X51(1∶1)次之。

表4 纖維素降解酶和木質(zhì)素降解酶活性(U/L)Table 4 Degradation enzyme activity of cellulose and lignin(U/L)

2.4 堆肥發(fā)酵試驗(yàn)

2.4.1 復(fù)合菌劑對(duì)沼渣堆肥溫度、pH值和全鹽含量的影響 沼渣堆肥溫度整體變化趨勢(shì)均為先快速上升,然后保持一定水平,隨后逐漸下降至環(huán)境溫度。各處理對(duì)堆溫的影響具有差異(圖3A)。堆肥時(shí)間為夏季,環(huán)境氣溫32.3 ℃,堆肥第0天,CK、T1、T2和T3的堆溫分別為32.7、33.6、33.4和32.9 ℃。堆肥第6天,T1、T2和T3處理均達(dá)到50 ℃以上,而CK只有47.8 ℃,說(shuō)明添加菌劑處理的堆肥升溫快,先到達(dá)HP。到第15天,各處理的堆溫達(dá)到最高,T2的最高溫度為65.7 ℃,比同時(shí)期的CK高10.42%。至第30天堆溫趨于穩(wěn)定,接近環(huán)境溫度。其中,加菌劑的處理比對(duì)照處理先進(jìn)入HP,最高堆溫比對(duì)照處理高,且比對(duì)照處理先進(jìn)入降溫期。沼渣堆肥的pH值呈現(xiàn)先上升后降低的規(guī)律(圖3B)。初始物料pH值為7.21。隨著堆肥進(jìn)程,CK、T1、T2和T3的pH值隨之增加,最高值分別為8.07、8.16、7.97、7.67,其中T1高于CK,T2和T3低于CK,表明不同菌劑配施對(duì)堆肥物料pH值的影響具有差異。至堆肥結(jié)束,物料pH值在7.37～7.52之間。由圖3C可知,物料的全鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨堆肥進(jìn)程呈現(xiàn)波動(dòng),最終升高的變化趨勢(shì)。堆肥初期的全鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.17～2.22 g/kg。隨著堆溫升高,該指標(biāo)隨之增加。至HP時(shí),CK、T1、T2和T3的全鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)較初始值分別增加了38.29%、39.82%、36.87%和31.92%。至堆肥結(jié)束,各處理的全鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加至2.41、2.52、2.37 g/kg和2.42 g/kg,分別較初始值增加了8.56%、11.50%、9.22%和10.50%。

圖3 不同處理對(duì)沼渣堆肥溫度、pH值和全鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 ffects of different treatments on temperature, pH and mass fraction of total saltA:溫度;B:pH值;C:全鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)A: Temperature; B: pH level; C: Mass fraction of total salt

2.4.2 復(fù)合菌劑對(duì)沼渣堆肥有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 ①有機(jī)質(zhì):有機(jī)質(zhì)是堆肥中微生物生命活動(dòng)的能量來(lái)源,或被氧化分解為CO2和H2O,或轉(zhuǎn)化為微生物組織,或形成腐殖質(zhì)。由圖4A可知,在堆肥過(guò)程中,沼渣中的有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著堆肥進(jìn)程逐漸下降。初始物料有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為811.44 g/kg。至堆肥結(jié)束,CK、T1、T2和T3的有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較堆肥初期減少30.23%、34.95%、42.85%、39.59%,可以看出T2的有機(jī)質(zhì)消耗最多,CK消耗的有機(jī)質(zhì)最少。說(shuō)明施用菌劑有利于加快堆肥中有機(jī)質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化,其中T2有機(jī)質(zhì)降解速率最快。②全氮:圖4B表明,沼渣堆肥中添加復(fù)合菌劑對(duì)物料全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)有影響。各處理全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨發(fā)酵進(jìn)程呈下降趨勢(shì),不同處理的降幅具有顯著差異(P<0.05)。堆肥初期的物料全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.93 g/kg,至堆肥結(jié)束,CK、T1、T2和T3處理較初期分別降低了68.77%、37.53%、26.60%和34.41%。T2的氮損失率最低,較CK的氮損失率降低42.17%,T1和T3次之,較CK氮損失率分別降低了31.42%和34.36%。這表明添加復(fù)合菌劑能顯著降低堆肥的全氮損失,其中T2處理的降低效果尤為顯著。③全磷:由圖4C可知,物料全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨堆肥進(jìn)程呈上升趨勢(shì)。物料初始全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.71 g/kg。RP均有上升,CK、T1、T2和T3處理較初始值分別提高18.33%、23.26%、25.70%和23.68%。其中,T2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,較CK增加了7.37%。

圖4 不同處理對(duì)沼渣堆肥有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷和全鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effects of different treatments on mass fraction of organic matter, total nitrogen, total phosphorus and total potassium in biogas residue compostA:有機(jī)質(zhì);B:全氮;C:全磷;D:全鉀;IP:潛育期;MP:中溫期;HP:高溫期;RP:腐熟期。圖中不同小寫字母代表各處理在P<0.05水平上差異顯著,下同A:Organic matter; B: Total nitrogen; C: Total phosphorus; D: Total potassium; IP: Incubation period; MP: Medium temperature period; HP: High temperature period; RP: Rotten period. Different lowercase letters in the figure indicate significant differences at the P<0.05 level. The same below

表明添加復(fù)合菌劑可以顯著提高堆肥物料中的全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù),其中T2增幅最高。④全鉀:圖4D表明,在堆肥過(guò)程中,全鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢(shì)。初始物料的該指標(biāo)為15.97 g/kg。到RP時(shí),CK、T1、T2和T3處理較初始值分別增加15.15%、27.93%、27.99%和33.50%。增幅最大的是T3,較CK增加了18.35%。表明添加復(fù)合菌劑可以有效提升堆肥物料中全鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù),其中T3增幅最高。

2.4.3 復(fù)合菌劑對(duì)沼渣堆肥纖維素酶和木質(zhì)素酶活性的影響 由圖5可知,堆肥物料的FPA、LAA、LPA和MPA隨著堆肥進(jìn)程均呈先增加后降低的趨勢(shì),均在HP達(dá)到最高水平,但是不同的酶其活性及變化幅度有差異。FPA是4種酶中酶活水平較高的酶。由圖5A可知,在IP時(shí),各處理的FPA已經(jīng)產(chǎn)生差異,CK、T1、T2和T3分別為1 846.01、2 324.25、2 711.11、2 451.78 U/L。所有處理的FPA均在HP達(dá)到最高水平,較IP的增幅分別達(dá)到54.40%、237.31%、240.33%、128.09%。其中,T2處理的FPA增幅更大,較同階段CK提高185.93%。RP各處理的FPA都低于對(duì)應(yīng)的HP酶活性。表明復(fù)合菌劑能有效提高堆肥物料中的纖維素酶活性。圖5B表明,IP時(shí),CK、T1、T2和T3的LAA均處于較低水平,分別為555.56、725.31、611.11、469.14 U/L。發(fā)酵進(jìn)入MP時(shí),LAA顯著提高。至HP時(shí),各處理的LAA達(dá)到最高水平,其中T2的LAA水平最高,較CK、T1、T3分別提高了11 528.56%、688.28%和100.73%。RP時(shí),各處理LAA較HP均顯著下降,但仍高于IP。如圖5C,IP時(shí)CK、T1、T2和T3的LPA分別為58.68、106.33、116.49、125.45 U/L。HP時(shí),各處理的LPA達(dá)到最高值,較IP分別增加132.11%、224.95%、504.60%、144.28%。其中T2的LPA增幅最大,較同期CK提高了372.49%。RP的各處理酶活性較HP下降。MPA在4種酶中處于最低水平。由圖5D可知,IP時(shí),CK、T1、T2和T3處理的MPA范圍為30.20～93.47 U/L。HP較IP分別增加了185.70%、233.35%、563.09%、712.09%。其中T3處理的MPA增幅最大,較同期CK提高了526.39%。RP的MPA較HP顯著下降,但是仍然較IP高?？傊?沼渣堆肥中添加復(fù)合菌劑能顯著提高FPA、LAA、LPA和MPA,其中,T2處理的前三種酶活性增幅最高,T3處理的MPA增幅最高。

2.4.4 復(fù)合菌劑對(duì)沼渣堆肥種子發(fā)芽指數(shù)的影響 通常以種子發(fā)芽指數(shù)表征堆肥物料的腐熟度。由圖6可知,堆肥過(guò)程中GI呈上升趨勢(shì),對(duì)種子發(fā)芽的抑制作用逐漸減弱,但是不同處理的腐熟進(jìn)程有差異。以GI大于50%和大于80%分別作為物料基本腐熟和完全腐熟的判斷依據(jù)[25]。發(fā)酵初期,各處理的GI均值為38.26%,均未達(dá)到50%。至MP時(shí),只有T2處理為53.55%,達(dá)到基本腐熟。堆肥至HP(第9天),T2處理的GI增至80.74%,已充分腐熟,而T1、T3和CK都于27 d才達(dá)到充分腐熟。說(shuō)明添加復(fù)合菌劑能顯著促進(jìn)沼渣堆肥的腐熟,縮短堆肥時(shí)間。其中T2處理促腐熟效果最好,比CK提前了18 d。

圖6 不同處理對(duì)沼渣堆肥種子發(fā)芽指數(shù)的影響Fig.6 Effect of different treatments on seed germination index of biogas residue compost

3 討 論

理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用均表明,耐高溫的纖維降解菌對(duì)促進(jìn)好氧堆肥很重要[26]。目前已篩選到多種纖維素降解真菌并開展了較為系統(tǒng)的研究,但是對(duì)耐高溫的纖維降解細(xì)菌研究相對(duì)較薄弱[27]。本研究篩選獲得的纖維素降解細(xì)菌W44和X51可以耐60 ℃高溫,同時(shí)具有較好的纖維降解酶活性,其纖維素酶活性分別為34 812.69 U/L和34 159.10 U/L,木質(zhì)素酶活性分別為733.42 U/L和670.85 U/L,顯示出較好的堆肥應(yīng)用潛力,為沼渣好氧堆肥提供了菌種資源。

芽胞桿菌是堆肥中一類重要的微生物。劉心吾等[28]和周望平等[29]均發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌分別是秸稈物料和畜禽糞便堆肥發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群。芽胞桿菌的芽胞具有極強(qiáng)的抗逆性,包括抗熱、抗鹽、抗酸、抗堿、抗輻射、抗靜水壓等[30]。田偉等[31]從牛糞中分離篩選到蠟樣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌(B.subtilis),菌體耐受50 ℃高溫。黃翠等[32]在研究農(nóng)業(yè)固廢堆肥時(shí)獲得具有纖維素降解能力且耐受55 ℃高溫的芽胞桿菌、類芽胞桿菌(Paenibacillussp.)、地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)、枯草芽胞桿菌、凝結(jié)芽胞桿菌(B.coagulans)和短芽胞桿菌(Brevibacillusborstelensis)等。以上細(xì)菌產(chǎn)生的芽胞是菌體細(xì)胞的休眠體, 形成于生長(zhǎng)發(fā)育后期,具有含水量低、含大量吡啶二羧酸鈣的厚壁,可逆性好且具有較強(qiáng)的抗熱性[33]。本研究以堆肥高溫期的翻堆溫度60 ℃為條件進(jìn)行篩選,經(jīng)分類鑒定,明確2個(gè)菌株分別為蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)菌株W44和解蛋白芽胞桿菌(B.proteolyticus)菌株X51。2個(gè)菌株對(duì)高溫的耐受有助于其在堆肥發(fā)酵中的生存及代謝。根據(jù)農(nóng)業(yè)部NY/T1109-2017《微生物肥料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則》[34],蠟樣芽胞桿菌屬于第三級(jí),即需做致病性試驗(yàn)的菌種。該菌株的致病性將被進(jìn)一步檢測(cè),以保證農(nóng)業(yè)使用的安全性。

堆肥發(fā)酵的生物學(xué)本質(zhì)是微生物對(duì)有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化作用,涉及大量生物化學(xué)反應(yīng),且?guī)缀蹙鶠槊复俜磻?yīng)[35]。因此,針對(duì)堆肥物料的組成性質(zhì),篩選具有高降解酶活性的微生物是重要的功能菌篩選策略。沼渣富含纖維素,其次是木質(zhì)素[36],因此,沼渣降解菌的篩選通常以纖維素降解酶和木質(zhì)素降解酶活性為核心指標(biāo),并依據(jù)酶活性高低進(jìn)行復(fù)合菌劑的研究[37]。遲暢等[38]在秸稈降解菌的篩選時(shí),以羧甲基纖維素鈉酶活性為主要篩選指標(biāo)。康躍等[39]開展園林廢棄物木質(zhì)素降解菌的篩選,以LAA、LPA和MPA等木質(zhì)素降解酶活性作為核心篩選指標(biāo)。聶文翰等[40]進(jìn)行秸稈降解復(fù)合菌劑的構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)復(fù)合接種劑JFB-1較單菌株處理和其他組合具有更高的酶活性。因此,結(jié)合底物組分特征開展降解菌的篩選,同時(shí)綜合考慮各菌株的相容性和組合的酶活性,有助于快速實(shí)現(xiàn)研發(fā)目標(biāo)。本研究以高溫下的纖維素降解酶為主要篩選指標(biāo),以木質(zhì)素降解酶作為次要指標(biāo),并依據(jù)核心酶活性評(píng)價(jià)不同菌株組合的產(chǎn)酶效果,從而快速篩選獲得目標(biāo)菌株和具有潛力的復(fù)配組合。

為縮短堆肥腐熟時(shí)間,提高生產(chǎn)效率和堆肥品質(zhì),在物料中添加促腐熟菌劑已成為公認(rèn)可行的方法[41]。張曉倩等[42]在牛糞便和稻草堆肥中添加黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)和變色栓菌(Thametesversicolor)組成的復(fù)合菌劑,發(fā)現(xiàn)堆肥中的β-葡萄糖苷水解酶活性、羧甲基纖維素鈉酶活性、LAA和MPA均比CK有顯著提高,加快了纖維素和木質(zhì)素的降解與轉(zhuǎn)化,提升了最高堆溫,將腐熟時(shí)間縮短了5 d,提高了堆肥品質(zhì)。研究表明,植物類廢棄物堆肥中添加促腐熟菌劑,既增加了物料中的微生物豐度,又能利用活躍的微生物代謝促進(jìn)物料的酶解和礦化進(jìn)程,能顯著提高物料腐熟度,同時(shí)使腐熟時(shí)間更短。本研究在沼渣堆肥中添加菌株W44/X51(1∶2)復(fù)合菌劑,其FPA、LAA和LPA均顯著高于其他處理,MPA也具有較高水平,說(shuō)明該復(fù)合菌劑提高了堆肥中沼渣降解的酶活性,減少了堆肥物料的碳氮損失,促進(jìn)了養(yǎng)分轉(zhuǎn)化,顯著縮短了腐熟時(shí)間。該研究既能獲得品質(zhì)較高的腐熟物,又減少了生產(chǎn)的時(shí)間成本。因此,該復(fù)合菌劑具有較好的應(yīng)用前景,有關(guān)菌劑的生產(chǎn)工藝條件和堆肥生產(chǎn)流程優(yōu)化有待進(jìn)一步探索。