程榮葉, 李樹(shù)東, 秦 達(dá), 楊啟堯, 李 穎, 余麗蕓*, 侯喜林*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江 大慶 163319;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)是一種哺乳動(dòng)物胃腸道宿主菌,在過(guò)去幾十年中,因其益生特性在臨床和動(dòng)物模型中被廣泛研究[1]。但是其干預(yù)腸道菌群,加強(qiáng)免疫反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制還不清楚,為了探究這個(gè)問(wèn)題,擬通過(guò)干酪乳桿菌口服實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼠,進(jìn)行腸道的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序,分析發(fā)生顯著變化的表達(dá)基因,挖掘這些基因在刺激免疫細(xì)胞分化成熟等方面的可能通路,為揭示這個(gè)科學(xué)問(wèn)題提供參考。近20年來(lái),益生菌的研究取得了突破性進(jìn)展,Toh等[2]研究報(bào)道了干酪乳桿菌作為對(duì)人類和家畜的一種益生菌,能夠穩(wěn)定腸道微生物群落,減少病原微生物入侵,減輕或預(yù)防由細(xì)菌和病毒引起的腹瀉,從而使腸道運(yùn)動(dòng)障礙達(dá)到一種正?；臓顟B(tài)?？诜庖吆?干酪乳桿菌攜帶抗原物質(zhì)附著在腸道和泌尿生殖系統(tǒng)中,刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng),進(jìn)一步阻礙病原微生物的入侵和黏附,減少了炎癥反應(yīng),并且干酪乳桿菌還可激活機(jī)體相關(guān)免疫細(xì)胞的活性,包括巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞[3-4]。除此之外,干酪乳桿菌進(jìn)入機(jī)體后還可以產(chǎn)生一些富含抑菌活性的多肽或前體多肽,抑制有害菌感染機(jī)體,促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌的增殖,進(jìn)而發(fā)揮益生作用[5]。重要的是重組乳酸菌增強(qiáng)了黏膜表面和血清中的lgA、IgM和IgG的水平,誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子,繼而加強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫[6-8]。特別是組學(xué)手段為深入研究提供了目標(biāo)和方向,加快了益生菌機(jī)制的研究進(jìn)程。Wang等[9]采用宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示了干酪乳桿菌的體內(nèi)表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)攝入的益生菌必須改變其轉(zhuǎn)錄模式才能在人類腸道中生存和適應(yīng),時(shí)間依賴性的激活模式研究表明益生菌和人類腸道微生物之間存在高度動(dòng)態(tài)的串?dāng)_。轉(zhuǎn)錄組學(xué)確定了驅(qū)動(dòng)嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)在腸道適應(yīng)性和活性的可能基因,揭示了這種益生菌促進(jìn)抗炎反應(yīng)、維持腸上皮穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)宿主晝夜代謝軸的作用[10]。同樣的高通量轉(zhuǎn)錄組分析揭示了芽胞桿菌(Bacillus)對(duì)雞的免疫、腸道屏障系統(tǒng)和代謝具有改善作用[11]。但是干酪乳桿菌在刺激腸道組織后產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子功能還沒(méi)有完全被揭示,有待進(jìn)一步的驗(yàn)證和研究。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究已經(jīng)取得了一些成果,揭示了一些轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控蛋白的作用,例如脂氧合酶(Aloxe)3基因編碼的一種新型代謝調(diào)控蛋白-表皮型Aloxe3的發(fā)現(xiàn)[12];白細(xì)胞分化抗原6 (Cluster of differentiation 6,CD6)鑒定為富含半胱氨酸的清道夫受體糖蛋白超家族中的一員[13],在胸腺發(fā)育、T細(xì)胞活化和機(jī)體的免疫應(yīng)答中均起著至關(guān)重要的作用[14-16]。在藥物代謝中,肝臟含有發(fā)揮重要作用的多種藥物代謝酶,例如羧酸酯酶(Carboxylesterase,CES )組成一個(gè)多基因家族,其基因產(chǎn)物多數(shù)分布在機(jī)體的各個(gè)組織和細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,這些酶以十分高效的催化去水解內(nèi)源性和外源性物質(zhì)[17]。ZBTB16基因?qū)儆谝职┗蚣易宄蓡T之一,最早發(fā)現(xiàn)于早幼粒細(xì)胞白血病的研究中,故稱之為早幼粒細(xì)胞白血病鋅指蛋白(ZBTB16或PLZF或ZNF145)[18],該基因可在人的肺組織中表達(dá)[19-21]。糖蛋白非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤蛋白B(GPNMB)是一種跨膜糖蛋白,因其在黑色素瘤細(xì)胞系中高表達(dá)且轉(zhuǎn)移性低而得名,由于GPNMB在成骨細(xì)胞分化和增加骨礦物質(zhì)沉積中的作用,也被稱為骨激活素[22-24]。OX40(CD134)及其配體OX40L(CD252)是TNF家族的成員,在CD4+、CD8+T細(xì)胞及其他幾種淋巴和非淋巴細(xì)胞上均有表達(dá)[25]。UBASH3A是蛋白絡(luò)氨酸磷酸激酶家族中的一員,包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域:N-末端UBA(泛素相關(guān))、SH3(Src同源性3)和C末端組氨酸磷酸酶PGM結(jié)構(gòu)域[26-27]。LZTS1亮氨酸拉鏈腫瘤抑癌基因1位于染色體8p22上[28-29]。研究發(fā)現(xiàn)Nanos1基因作為轉(zhuǎn)錄后阻遏子參與調(diào)節(jié)翻譯過(guò)程[30]。孕激素和脂肪Q受體7(PAQR7)是膜孕激素受體中不可或缺的一員[31]。血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1(SGK1)被鑒定為一種促腫瘤基因[34-35],是蛋白激酶“AGC”亞家族的成員,與AKT激酶家族具有結(jié)構(gòu)和功能的相似性,也稱為Akt[32-33]。TRIM46基因?qū)儆谌鼗?Tripartite Motif,TRIM)蛋白家族成員,也稱為GENEY,位于人染色體1q21上[36-37]。 這些基礎(chǔ)研究提示益生菌調(diào)節(jié)腸道微生物群落的同時(shí),有可能引起腸道組織的某些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生變化,進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性。因此,本研究以干酪乳桿菌為實(shí)驗(yàn)材料灌胃小鼠,取不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的腸道樣本進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序,利用NGS分析干酪乳桿菌刺激小鼠腸道的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),對(duì)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過(guò)GO功能富集和KEGG通路富集,對(duì)富集的相關(guān)功能的差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)(qRT-PCR)驗(yàn)證相關(guān)差異基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 試驗(yàn)用菌株干酪乳桿菌CICC6105(LactobacilluscaseiCICC6105)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心,-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只雌性 Balblc小鼠(SPF級(jí))購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司,為5～6周齡,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前在無(wú)菌環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,自由飲食。

1.1.3 主要試劑及儀器設(shè)備 蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、吐溫-80、瓊脂購(gòu)自Sigma公司;葡萄糖、無(wú)水乙酸鈉、檸檬酸三胺、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、碳酸鈣購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán); SYBR Green I核酸染料和HiScript III Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自諾唯贊公司; Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor購(gòu)自Promega公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler?96, 瑞士羅氏生物公司);微量紫外分光光度計(jì)(Evolution 220, 美國(guó) ThermoFisher 公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(DRP-9162, 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);空氣浴震蕩器(HZQ-C, 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)有限公司);旋渦震蕩器(QL-861, 海門市其林貝爾儀器制造有限公司);臺(tái)式低溫冷凍高速離心機(jī)(A-14C-1EU, 德國(guó) Sigma 公司)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物模型分組 選取20只體重相近狀態(tài)良好的5～6 周齡SPF級(jí)Balb/c小鼠,在相同飼養(yǎng)環(huán)境條件下隨機(jī)將其分為兩組,分別為對(duì)照組(NTC)、干酪乳桿菌組(TOA)。NTC組:用生理鹽水飼喂小鼠30 d,分別在第10天、20天、30天取3只小鼠的小腸組織;TOA組:用濃度為5×1011cfu/mL的干酪乳桿菌生理鹽水懸液200 μL飼喂小鼠30 d,分別在第10天、20天、30天取3只小鼠的小腸組織。

1.2.2 干酪乳桿菌懸液的制備 將凍存的干酪乳桿菌菌株從-80 ℃冰箱取出,取出后將凍存菌平板劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h后,挑取單菌落在5 mL MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜,再以2%(體積分?jǐn)?shù))的比例接種于100 mL進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),5 000 r/min,4 ℃離心10 min收集菌體,菌體用生理鹽水洗滌,重復(fù)3次。然后進(jìn)行平板細(xì)菌計(jì)數(shù),再用生理鹽水將菌體稀釋為5×1011cfu/mL,對(duì)小鼠進(jìn)行每天一次的灌胃。

1.2.3 小鼠腸道的提取 對(duì)各組小鼠進(jìn)行12 h禁食,禁食后,利用頸椎脫臼法處死小鼠,隨后將處死的小鼠放置濃度為75%的酒精中消毒,在無(wú)菌的超凈工作臺(tái)解剖小鼠,剪取胃幽門至回盲部的小腸,放入含有生理鹽水的平皿中,使用含有生理鹽水的注射器對(duì)小腸中的內(nèi)容物進(jìn)行洗滌,重復(fù)3次,洗滌后將小腸放入凍存管中。將凍存管放置液氮中速凍30 min,隨后將小腸保存至-80 ℃冰箱中,待整體試驗(yàn)取樣完成后,將小腸用干冰運(yùn)輸送至上海派森諾生物技術(shù)有限公司。

1.2.4 差異基因分析 小腸樣本經(jīng)測(cè)序公司測(cè)序后返回,測(cè)序 Raw counts 數(shù)據(jù)采用 DESeq2 分析,得到顯著差異的基因,將篩選條件設(shè)為Pvalue≤0.05,且差異倍數(shù)|Fold change|>1 。隨后將表達(dá)差異分析結(jié)果進(jìn)行可視化,通過(guò)熱圖可視化體現(xiàn)樣本間差異表達(dá)情況。

1.2.5 差異基因的GO和KEGG富集分析 為了研究干酪乳桿菌刺激小鼠腸道后產(chǎn)生的差異基因功能,利用派森諾平臺(tái)(https://www.genescloud.cn/login)對(duì)篩選出的差異基因做基因本體分析(GO)和KEGG通路分析,差異基因顯著富集結(jié)果利用柱狀圖對(duì)其進(jìn)行可視化。

1.2.6 基本特性分析 使用在線網(wǎng)站ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)14個(gè)基因分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)和脂溶系數(shù)進(jìn)行分析;利用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)在線網(wǎng)站對(duì)基因編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析;使用NCBI的Conserved-Domains數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)14個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白的功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析。

1.2.7 染色體定位分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的小鼠基因組gff文件,利用Tbtools軟件對(duì)14個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行染色體定位分析。

1.2.8 基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析 使用在線網(wǎng)站MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)對(duì)14個(gè)基因的保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè);使用Gene Structure Dispaly Server(http://gsds.gao-lab.org/)在線分析基因結(jié)構(gòu),得出基因中CDS (Sequence coding for amino acids in protein)分布情況。

1.2.9 qRT-PCR表達(dá)分析 利用NCBI primer designer,以14個(gè)差異表達(dá)基因的核苷酸序列為模板設(shè)計(jì)熒光定量引物,擴(kuò)增長(zhǎng)度控制在80 ～ 150 bp以內(nèi),SDHA作為內(nèi)參基因,引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成(表1)。qRT-PCR反應(yīng)時(shí)以反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA稀釋10倍作為模板。反映體系參照諾唯贊公司的HiScript III Reverse Transcriptase說(shuō)明書(shū),利用 Lightcycler 96 Real-time PCR System進(jìn)行 qPCR。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按照平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)方差計(jì)算;數(shù)據(jù)分析均使用 Graphpad prism 9.0 軟件進(jìn)行;組間顯著性差異使用 Student′st-test 法進(jìn)行分析;P< 0.05 代表組間顯著(*P< 0.05, **P< 0.01 和 ***P< 0.001, ****P< 0.000 1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)差異基因分析

為了分析處理組與對(duì)照組之間差異基因的表達(dá)情況,對(duì)D10NTC vs.D10TOA 組、D20NTC vs. D20TOA組、D30NTC vs. D30TOA 組的差異基因利用 Deseq2 包對(duì)原始 counts 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,閾值設(shè)置為P≤ 0.05 和|log2(Fold change)|>1,結(jié)果發(fā)現(xiàn)D10NTC vs. D10TOA 組、D20NTC vs. D20TOA組、D30NTC vs.D30TOA 組中分別有176、32、261個(gè)基因發(fā)生變化。其中在 D10NTC vs.D10TOA 組有 59 個(gè)基因上調(diào)與 117 個(gè)基因下調(diào);D20NTC vs. D20TOA 組有 23 個(gè)基因上調(diào)與 9 個(gè)基因下調(diào);D30NTC vs. D30TOA 組有 181 個(gè)基因上調(diào)與 80 個(gè)基因下調(diào);利用熱圖對(duì)上述差異基因進(jìn)行可視化(圖1)。

圖1 各組之間差異基因表達(dá)熱圖Fig.1 The heat map of differential gene expression among groups

2.2 GO功能富集分析結(jié)果

對(duì)差異基因的生物進(jìn)程進(jìn)行GO功能富集分析,干酪乳桿菌組(TOA)和生理鹽水組(NTC)的GO富集分析結(jié)果(圖2A、圖2B、圖2C):D10NTC vs. D10TOA 組表達(dá)的差異基因主要富集在免疫系統(tǒng)負(fù)調(diào)控、細(xì)胞分化、細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)、T細(xì)胞激活等進(jìn)程;D20NTC vs. D20TOA 組表達(dá)的差異基因主要富集在淋巴細(xì)胞活化、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化進(jìn)程和T細(xì)胞激活等進(jìn)程;D30NTC vs. D30TOA組表達(dá)的差異基因主要富集在免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)過(guò)程、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)正調(diào)控、T細(xì)胞激活等進(jìn)程。以上分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞免疫相關(guān)的功能基因有Gpnmb、Hist1h4c、Zbtb16、Hist2h4、Sgk1、Aloxe3、Cspg5、Lzts1、Paqr7、Trim46、Ces1d、Nanos1、Cd6、OX40,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)將選取這14個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2 干酪乳桿菌組與空白組GO功能富集柱狀圖Fig.2 Histogram of GO function enrichment in Lactobacillus casei group and blank groupA: D10NTC vs.D10TOA組柱狀圖; B: D20NTC vs. D20TOA組柱狀圖; C: D30NTC vs. D30TOA組柱狀圖;D:14個(gè)差異表達(dá)基因熱圖 A: D10NTC vs. D10TOA; B: D20NTC vs. D20TOA; C: D30NTC vs. D30TOA;D: Heat map of 14 differentially expressed genes

2.3 KEGG富集分析結(jié)果

對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析,干酪乳桿菌組(TOA)和生理鹽水組(NTC)的KEGG分析結(jié)果(圖3):D10NTC vs. D10TOA 組的通路主要富集在PPAR信號(hào)通路、半乳糖代謝、脂肪的消化和吸收類固醇激素的生物合成等(圖3A);D20NTC vs. D20TOA 組主要富集在皮質(zhì)醇的合成和分泌、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、膽固醇代謝、煙酸和煙酰胺代謝等(圖3B);D30NTC vs. D30TOA 組主要富集在細(xì)胞黏附分子(CAM)、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路等(圖3C)。

圖3 干酪乳桿菌組與空白組KEGG通路富集氣泡圖Fig.3 The enrichment Bubble Diagram of KEGG pathway in L. casei group and blank groupsA:D10NTC vs.D10TOA;B:D20NTC vs.D20TOA;C:D30NTC vs.D30TOA

2.4 基本特性分析結(jié)果

供試的14個(gè)差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度為103～759 aa,分子量在11.37～83.45 kDa之間,其中ENSMUSG00000042766(Trim46)編碼的蛋白長(zhǎng)度最大為759 aa,ENSMUSG00000060678(Hist1h4c)和ENSMUSG00000091405(Hist2h4)蛋白最小為103 aa;等電點(diǎn)pI在4.42～11.36之間,其中ENSMUSG00000060678(Hist1h4c)和ENSMUSG00000091405(Hist2h4)的pI最大,ENSMUSG00000032482(Cspg5)的pI最小;亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明,它們分別定位在細(xì)胞質(zhì)、溶酶體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞外和細(xì)胞核內(nèi),均為不穩(wěn)定的脂溶性蛋白,且均含有功能結(jié)構(gòu)域(表2)。

2.5 染色體分析結(jié)果

14個(gè)差異表達(dá)的基因分布于小鼠染色體的3、4、6、8、9、10、11、13、和19號(hào)染色體上,其中Trim46和Hist2h4基因位于3號(hào)染色體,Paqr7和OX40基因位于4號(hào)染色體,Gpnmb基因位于6號(hào)染色體上,Lzts1和Ces1d基因位于8號(hào)染色體上,Zbtb16和Cspg5基因位于9號(hào)染色體上,Sgk1基因位于10號(hào)染色體上,Aloxe3基因位于11號(hào)染色體上,Hist1h4c基因位于13號(hào)染色體上,Cd6和Nanos1基因位于19號(hào)染色體上,從分布結(jié)果可以看出基因在染色體分布較為分散,沒(méi)有出現(xiàn)聚集并形成基因簇的現(xiàn)象(圖4)。

圖4 染色體定位Fig.4 Chromosomal localization

2.6 基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析結(jié)果

基因上的保守基序Motif分布稀疏,其中Hist2h4和Hist1h4c的保守基序分布及種類相似度高,保守基序模型較為保守。其余基因保守基序相似性不高,表明它們之間不具有類似的功能(圖5 A)。Hist1h4c、Hist2h4不含CDS序列,Gpnmb、Zbtb16、Aloxe3和Ces1d含有一個(gè)CDS序列,Sgk1、Cspg5、Paqr7、Trim46、Nanos1、Cd6和OX40含有2個(gè)CDS序列,Lzts1基因均含有3個(gè)CDS序列 (圖5 B)。

圖5 基因結(jié)構(gòu)、保守基序可視化分析Fig.5 Visual analysis of gene structure and conserved motifsA:基因結(jié)構(gòu); B:保守基序A:Gene structure; B:Conserved motif

2.7 qRT-PCR分析結(jié)果

為驗(yàn)證 RNA-seq 分析結(jié)果,利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)(qRT-PCR)對(duì)篩選出來(lái)的14個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證,分析在不同時(shí)間差異基因的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),其中Hist1h4c、Hist2h4、Cspg5、Cd6、Gpnmb、Trim46和Nanos1基因的表達(dá)模式一致,在不同時(shí)間處理下的整體表達(dá)水平都比較低,組間表達(dá)不顯著。Sgk1、Ces1d、Lzts1、Paqr7、Aloxe3、Zbtb16和OX40整體表達(dá)水平較高,表達(dá)峰值明顯與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相符。其中Sgk1基因在第20天和第30天有顯著差異,Ces1d、Lzts1、Paqr7、Aloxe3、Zbtb16基因在第10天和第20天有顯著差異,OX40基因在第10天、第20天和第30天均有顯著差異(圖6)。

3 討 論

Jung等[38]發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌能預(yù)防病原體感染、對(duì)機(jī)體有保護(hù)和預(yù)防癌癥等作用。Devi等[6]發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌進(jìn)入機(jī)體后,刺激黏膜激活機(jī)體免疫系統(tǒng),影響特異性免疫應(yīng)答能力,促進(jìn)T、B細(xì)胞的增殖和成熟。腸道屬于最早接觸環(huán)境因素(食物、毒素和病原體等)的主要器官之一,具備近端到遠(yuǎn)端的黏膜結(jié)構(gòu)梯度和營(yíng)養(yǎng)處理能力[39]。干酪乳桿菌對(duì)腸道的研究具有重要的意義,但是目前干酪乳桿菌刺激小鼠腸道,其對(duì)免疫細(xì)胞的影響還不清楚,因此,我們的研究旨在揭示干酪乳桿菌干預(yù)腸道后什么基因變化,能夠激活T細(xì)胞,致使T細(xì)胞增殖;T細(xì)胞激活對(duì)黏膜免疫有什么樣的作用效果?本研究通過(guò)RNA-seq測(cè)序探究了干酪乳桿菌刺激小鼠腸道后基因表達(dá)譜的變化,發(fā)現(xiàn)7個(gè)基因功能主要與免疫系統(tǒng)過(guò)程、固有免疫反應(yīng)、T細(xì)胞激活等相關(guān),為進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。

在建立干酪乳桿菌刺激小鼠腸道模型中,發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌飼喂10 d時(shí),飼喂組對(duì)比對(duì)照組的上調(diào)基因數(shù)量比下調(diào)基因少,飼喂到20 d、30 d時(shí),上調(diào)基因數(shù)量相比下調(diào)基因的數(shù)量增多。這種現(xiàn)象的原因可能是飼喂干酪乳桿菌10 d后,小鼠腸道內(nèi)菌群的變化還沒(méi)有趨于穩(wěn)定,有些作用還沒(méi)有顯現(xiàn)。但是繼續(xù)飼喂干酪乳酸菌之后,隨著飼喂時(shí)間的增加,小鼠可能產(chǎn)生耐受反應(yīng),小鼠腸道內(nèi)益生菌群趨于穩(wěn)定,有些基因開(kāi)始上調(diào)。干酪乳酸菌在小鼠腸道中為優(yōu)勢(shì)菌屬,刺激小鼠腸道細(xì)胞上調(diào)相關(guān)基因,類似的研究報(bào)道表明,當(dāng)飼喂益生菌之后,雞腸道上調(diào)基因數(shù)目相比下調(diào)基因數(shù)目增多[40],但具體機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。對(duì)差異基因進(jìn)行生物進(jìn)程富集分析,顯示差異基因多數(shù)富集在T 細(xì)胞活化、免疫調(diào)節(jié)負(fù)調(diào)控、細(xì)胞分化和先天免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)上。KEGG通路富集顯示和PPAR信號(hào)通路、半乳糖代謝、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路相關(guān)。以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了干酪乳桿菌刺激小鼠腸道可能通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞激活、細(xì)胞分化等以增強(qiáng)免疫系統(tǒng)能力。Lian等[41]研究結(jié)果表明抑制CES1(Ces1d的人類同源基因)可能是預(yù)防和治療非酒精性脂肪肝(NAFLD)的一個(gè)新的藥理學(xué)靶點(diǎn)。Kawaue等[42]研究證明Lzts1可作為細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的主要調(diào)節(jié)器發(fā)揮作用,在進(jìn)化過(guò)程中增加了大腦結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。Tan等[43]證明PAQR7可能介導(dǎo)孕酮誘導(dǎo)BPBC EMT逆轉(zhuǎn),由孕酮激活的PAQR7與小窩蛋白-1相互作用(Cav-1)或調(diào)節(jié)表皮生長(zhǎng)因子的活性受體(EGFR),使PI3K/Akt信號(hào)通路失活,最終抑制BPBC中的EMT。Higgins等[44]研究發(fā)現(xiàn)Aloxe3作為一種潛在的新的肝細(xì)胞禁食反應(yīng)效應(yīng)器,利用PPARy介導(dǎo)和多效性效應(yīng)來(lái)增強(qiáng)肝臟和整個(gè)宿主的代謝,作為改善代謝性疾病的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。對(duì)于顯著表達(dá)的PLZF基因(早幼粒細(xì)胞白血病鋅指蛋白),有研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)Na?ve T細(xì)胞的正常發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[45-47]。 Zhang等研究發(fā)現(xiàn),OX40調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖,主要在后期對(duì)維持細(xì)胞存活發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[48-49]。以上基因在乳酸菌刺激腸道后表達(dá)也顯著上升,和腸道黏膜免疫有什么相關(guān)性還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究用干酪乳桿菌刺激小鼠腸道,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了與T細(xì)胞激活相關(guān)的功能基因,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞黏附分子(CAM)、B細(xì)胞受體信號(hào)通路發(fā)生了顯著變化,初步表明干酪乳桿菌對(duì)機(jī)體的免疫過(guò)程發(fā)揮著重要的作用,為后續(xù)深入詳細(xì)研究干酪乳桿菌對(duì)免疫系統(tǒng)的作用機(jī)制提供參考。