林凌桑，陳 潔，李思廣，張 蕾，丁毅鵬，3

（1.海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院，海南 海口 570311；2.海南省人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570311；3.海南省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570311）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種嚴(yán)重的慢性間質(zhì)性肺疾病，其主要病理改變是肺泡壁及間質(zhì)異常增生和纖維化［1］。這種病理改變導(dǎo)致肺組織中纖維蛋白沉積，從而使肺泡無法正常展開，進(jìn)而影響氣體交換功能［2］。該病的成因多樣，可能與長(zhǎng)期吸入有害顆粒物、某些藥物或遺傳因素有關(guān)。盡管目前尚無針對(duì)性的治療方法，但如胞外基質(zhì)抑制劑、糖皮質(zhì)激素、抗氧化劑、免疫抑制劑等藥物可以減緩病情的進(jìn)展，并幫助改善癥狀［3，4］。

近年來，中醫(yī)辨證論治的中藥復(fù)方對(duì)肺間質(zhì)纖維化有明顯改善作用，且毒副作用?。?，6］。尤其值得關(guān)注的是一種名為“化瘀理肺方”的中藥復(fù)方，它以“活血化瘀、祛痰理肺、暢利氣機(jī)”為治則［7］。已有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 分子通路與肺纖維化的發(fā)展密切相關(guān)［8］，且該通路受微小RNA-27a-3p（miR-27a-3p）的調(diào)控［9］。然而，“化瘀理肺方”在治療博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化時(shí)，是否會(huì)對(duì)miR-27a 和α-平滑肌蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達(dá)產(chǎn)生影響，目前尚無研究報(bào)道。

在本研究中，采用博萊霉素處理大鼠構(gòu)建肺纖維化模型［10］，并使用化瘀理肺方進(jìn)行干預(yù)治療，通過觀察α-SMA 的表達(dá)，檢測(cè)miR-27a 的表達(dá)以及驗(yàn)證它們的結(jié)合位點(diǎn)，研究其可能的作用機(jī)制，為理解化瘀理肺方的作用機(jī)制提供了新的視角。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

健 康 雄 性Wistar 大 鼠，4～6 周 齡，體 重 范 圍180～220 g，清潔級(jí)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物服務(wù)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)44005800002779。

博萊霉素從Sigma 公司采購(gòu)；HE 染色試劑盒、Masson 染色試劑盒和免疫組化試劑盒購(gòu)于北京Solarbio 公司；α-SMA 一抗購(gòu)于abcam 公司；293T 細(xì)胞株從中科院細(xì)胞資源庫(kù)購(gòu)買；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基和胰酶試劑從Invitrogen 公司購(gòu)買；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（P312）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q331）購(gòu)于南京諾唯贊生物；雙熒光素酶報(bào)告基因購(gòu)自上海吉瑪基因（GenePharma）。

1.2 化瘀理肺方來源與處理

化瘀理肺方所使用的中藥成分包括半夏、丹參、當(dāng)歸、水蛭、黃芪、薏苡仁等。該方劑各中藥采用濃縮顆粒劑，由江陰天江藥業(yè)有限公司負(fù)責(zé)生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)為0509025。經(jīng)過溶解后，含生藥量為1 341 mg/mL 的溶劑經(jīng)高壓滅菌并儲(chǔ)存在4 ℃冰箱備用［11］。

1.3 肺纖維化大鼠模型制備及分組

將Wistar 大鼠放入飼養(yǎng)環(huán)境經(jīng)過適應(yīng)1 周后，將其稱重和編號(hào)。將各組10 只大鼠分為：對(duì)照組、模型組（博萊霉素處理）和化瘀理肺方組（博萊霉素加化瘀理肺方處理）。博萊霉素所致的病理改變與人的肺纖維化極為類似，因而被廣泛用于建立肺纖維化的動(dòng)物模型［10］。在本研究中，使用1%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射，致其麻醉后，對(duì)大鼠肢體及頭部進(jìn)行固定，然后將與1 mL 注射器相連的導(dǎo)管插入氣管，注射0.4%濃度的博萊霉素0.25 mL（5 mg/kg），以正常對(duì)照的方式，對(duì)照組的大鼠注入等量的生理鹽水，注射后，立即對(duì)動(dòng)物進(jìn)行直立旋轉(zhuǎn)，以確保藥物均勻分布在肺內(nèi)，以此構(gòu)建肺纖維化模型?；隼矸畏浇M在造模后1 周灌胃給與化瘀理肺方藥物懸液2 mL（13.4 g·kg-1·d-1）治療，在隨后的1 周中持續(xù)給予該劑量藥物［11］。對(duì)照組及模型組每日以的生理鹽水（2 mL／只）灌胃。造模14 d 后將大鼠處死，取出右肺中葉作后續(xù)檢測(cè)。

1.4 肺組織HE 和Masson 染色

將實(shí)驗(yàn)大鼠的右肺中葉取出并放入10%甲醛中進(jìn)行固定。隨后，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋過程，制備連續(xù)4 μm 厚石蠟切片，采用蘇木精-伊紅染色法（也被稱為HE 染色法）和Masson 三色法對(duì)這些切片進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察其肺組織的改變特點(diǎn)。應(yīng)用HE 染色法，主要觀察實(shí)驗(yàn)鼠肺組織的炎癥病理學(xué)變化特征，包括脂肪變和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象。采用Masson 染色法，主要對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠肺組織肺纖維化程度進(jìn)行評(píng)估，包括纖維化細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量、肺組織形態(tài)學(xué)變化、肺泡壁結(jié)構(gòu)變化等。

1.5 免疫組化檢測(cè)

用75%乙醇對(duì)每組大鼠肺組織的石蠟切片進(jìn)行脫脂處理，分別在95%和100%乙醇中各浸泡5 min，接著進(jìn)行2 次二甲苯浸泡，每次10 min。用0.3% 的H2O2甲醛溶液對(duì)切片進(jìn)行去氧處理30 min，該方法能有效地消除內(nèi)源性過氧化物酶對(duì)肺組織切片造成的干擾。用PBS 緩沖液洗滌切片5 min，進(jìn)行3 次。在室溫條件下加入α-SMA 一抗，孵育1 h，隨后再次用PBS 緩沖液洗滌切片5 min，進(jìn)行3 次。加入熒光素二抗，并在室溫下孵育1 h，再次使用PBS 緩沖液洗滌切片，接著加入足量的熒光素室溫孵育30 min。最后使用PBS 緩沖液洗滌切片3次，每次5 min，將切片用蒸餾水沖洗干凈并封片。在顯微鏡下觀察切片，并進(jìn)行圖像記錄和分析。

1.6 qRT-PCR 檢測(cè)

以Trizol 為試劑，從不同組別大鼠肺組織中提取RNA。隨后，使用美國(guó)賽默飛的NanoDrop 2000對(duì)RNA 進(jìn)行了濃度和純度評(píng)估。接下來，我們使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用ABI 7500qPCR 儀進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)的參數(shù)為：首先進(jìn)行95 ℃的預(yù)變性處理，持續(xù)5 min，接下來進(jìn)行95 ℃變性5 s，62 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40 個(gè) 循 環(huán)。以U6 作為內(nèi)參，并 采 用2-ΔΔct法計(jì)算miR-27a 的表達(dá)量。miR-27a 上游引物：5′-TGCGGTTCACAGTGGCTAAG -3′，miR-27a 下游引物：5′- CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6上游引物：5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；U6下 游 引 物：5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)使用293T 細(xì)胞進(jìn)行。首先，將ACTA2 的野生型3'非翻譯區(qū)（UTR）及其突變體插入到pMIR-RB-REPORT?熒光素酶mRNA 表達(dá)報(bào)告載體中。接下來，將5×104個(gè)/孔的293T 細(xì)胞接種到6 孔板，并使用Lipofectamine 2000 將四組樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)染：ACTA2-WT 和miRNC 組、ACTA2-WT 和miR-27a 組、ACTA2-MUT和miR-NC 組，以 及ACTA2-MUT 和miR-27a 組。在轉(zhuǎn)染48 h 后，利用熒光分光光度計(jì)對(duì)Firefly 和Renilla 熒光素酶活性進(jìn)行評(píng)估，并將其歸一化為Renilla 熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 9.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，針對(duì)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，使用均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間數(shù)據(jù)比較，而對(duì)于多組數(shù)據(jù)之間的比較，采用單因素方差分析方法。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著的數(shù)據(jù)以P＜0.05表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察

使用HE 染色對(duì)各組大鼠肺組織進(jìn)行了病理學(xué)特征的觀察。結(jié)果表明，在模型建立后1 周，對(duì)照組大鼠的肺組織展現(xiàn)出正常的肺泡形態(tài)。肺組織完整且清晰可見，肺泡壁薄且較連續(xù)，并且沒有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。這表明對(duì)照組大鼠的肺部沒有發(fā)現(xiàn)異常的病理改變，沒有明顯的炎癥反應(yīng)發(fā)生。而模型組大鼠肺組織呈彌漫狀實(shí)變，觀察結(jié)果顯示肺泡壁顯著增厚，肺泡間隔也遭到破壞，肺泡內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間隔也增寬，且肺間質(zhì)內(nèi)有較多成纖維細(xì)胞。但化瘀理肺方對(duì)大鼠肺組織的影響卻與正常組相近，肺組織僅偶爾觀察到少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大部分均保持正常，見圖1。這些結(jié)果表明，化瘀理肺方能夠有效改善博萊霉素導(dǎo)致的大鼠肺纖維化。

圖1 化瘀理肺方對(duì)肺纖維化大鼠肺組織病理改變的影響（HE，400×）Fig 1 The impact of Huayu Lifei formula on the pathological alterations in lung tissue of bleomycin-induced rat lung fibrosis model（HE，400×）

2.2 化瘀理肺方改善博萊霉素誘導(dǎo)的肺組織膠原沉積

通過Masson 染色觀察，對(duì)照組大鼠的肺組織呈現(xiàn)出清晰的結(jié)構(gòu)，未觀察到明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原沉積（藍(lán)色沉積）；模型組大鼠肺間質(zhì)病變嚴(yán)重，伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及明顯藍(lán)色膠原沉積；而化瘀理肺方組大鼠的肺組織膠原結(jié)構(gòu)與對(duì)照組基本一致，見圖2。由此可推斷，化瘀理肺方有助于減少博萊霉素引起的肺組織膠原沉積的作用。

圖2 化瘀理肺方對(duì)肺纖維化大鼠肺組織膠原的影響（MASSON，400×）Fig 2 The effect of Huayu Lifei formula on the collagen in lung tissue of bleomycin-induced rat lung fibrosis model（MASSON，400×）

2.3 化瘀理肺方抑制博萊霉素誘導(dǎo)的α-SMA 表達(dá)

通過免疫組化檢測(cè)肺纖維化指標(biāo)α-SMA 表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果提示，α-SMA 在模型中高表達(dá)，提示肺纖維化模型構(gòu)建成功。而α-SMA 在正常組與化瘀理肺方組肺組織中表達(dá)量明顯下降，見圖3。以上結(jié)果提示，化瘀理肺方能夠抑制博萊霉素誘導(dǎo)所致的大鼠肺纖維化。

圖3 化瘀理肺方對(duì)肺纖維化大鼠肺組織α-SMA 表達(dá)的影響（400×）Fig 3 The effect of Huayu Lifei formula on the α-SMA in lung tissue of bleomycin-induced rat lung fibrosis model（400×）

2.4 化瘀理肺方促進(jìn)miR-27a 表達(dá)

通過qRT-PCR 檢測(cè)化瘀理肺方對(duì)肺纖維化大鼠肺組織中miR-27a 的影響。qRT-PCR 檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，模型組肺組織中miR-27a 的水平明顯 降 低（0.46±0.06vs.0.99±0.05，P＜0.001，t=11.14）；與模型組相比，化瘀理肺方組肺組織中miR-27a 的 表 達(dá) 量則 顯 著 上升（2.97±0.38vs.0.46±0.06，P＜0.001，t=11.19），見圖4。據(jù)此，可以推測(cè)miR-27a 在化瘀理肺方對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的抑制作用中發(fā)揮了作用。

圖4 化瘀理肺方對(duì)肺纖維化大鼠肺組織中miR-27a 的影響Fig 4 The effect of Huayu Lifei formula on the miR-27a in lung tissue of bleomycin-induced rat lung fibrosis model

2.5 miR-27a 靶 向 結(jié) 合ACTA2 基 因

Targetscan 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//www.targetscan.org/）預(yù)測(cè)顯示miR-27a 與編碼α-MA 的基因ACTA2 的3'UTR 存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見圖5A。將含有ACTA2 基因3'UTR 結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告載體分別與miR-27a 模擬物、miR-27a 抑制劑共轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h 后，對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行共同測(cè)試，結(jié)果顯示，ACTA2 3'-UTR-WT 和miR-27a的共轉(zhuǎn)染顯著抑制了熒光素酶活性（0.35±0.03vs.1.02±0.04，P＜0.001，t=22.6），而ACTA2 3' -UTR-MUT 和miR-27a 共轉(zhuǎn)染對(duì)熒光素酶活性無明顯 影 響（0.98±0.09vs.1.02±0.04，P=0.49，t=0.75），見圖5B，表明ACTA2 的3'UTR 與miR-27a存在結(jié)合位點(diǎn)。上述結(jié)果提示，miR-27a 可能通過靶向結(jié)合ACTA2 抑制α-SMA 蛋白表達(dá)參與化瘀理肺方對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化的抑制作用。

圖5 miR-27a 靶向結(jié)合ACTA2Fig 5 miR-27a binds to ACTA2

3 討論

肺纖維化是一種主要發(fā)生在肺組織中、表現(xiàn)為肺泡和小葉之間的結(jié)構(gòu)損傷的慢性肺部疾病，病理特點(diǎn)是肺組織內(nèi)肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維細(xì)胞異常增生，并可引起肺間質(zhì)纖維化及呼吸功能障礙［12］。肺纖維化病情進(jìn)展迅速，患者從確診后只有3～5 年的平均生存期，臨床表現(xiàn)主要為干咳和呼吸困難［1］。由于目前缺乏有效的防治措施，故對(duì)其致病機(jī)理進(jìn)行深入研究具有重要意義［2］。

中醫(yī)藥在中醫(yī)臨床中扮演著重要的角色，常被應(yīng)用于預(yù)防和治療各種疾病。相對(duì)于西藥，中醫(yī)藥具有副作用較小、療效持久，適應(yīng)范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)［13］。研究報(bào)道，復(fù)方補(bǔ)肺理氣湯能夠改善肺纖維化，降低TGF-β1 和α-SMA 的mRNA 水平［14］。在本研究中，根據(jù)中醫(yī)理論組成了化瘀理肺方。該方中，丹參活血化瘀，半夏燥濕化痰，兩者共同作用，有效消除絡(luò)脈中的痰濁和瘀血。作為臣藥的水蛭和當(dāng)歸，協(xié)助君藥化痰、通絡(luò)；黃芪則補(bǔ)氣、增強(qiáng)陽(yáng)氣；這三味藥物共同輔助作用，促進(jìn)滯血消散和經(jīng)絡(luò)通暢。同時(shí)，魚腥草、薏苡仁和地龍作為佐藥，協(xié)調(diào)全方藥性，共同發(fā)揮補(bǔ)肺固表、逐瘀和益氣的功效。本研究通過使用博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型，并對(duì)該模型組使用化瘀理肺方進(jìn)行了治療。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該藥方能有效改善博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型的病理狀態(tài)以及減少膠原沉積，與李飛等［15］的研究結(jié)果，即化瘀理肺方對(duì)博萊霉素所致肺纖維化大鼠有一定預(yù)防性治療作用一致。α-SMA 作為纖維化標(biāo)記物之一，常在肺纖維化中呈高表 達(dá) 水平［16，17］，本研究實(shí) 驗(yàn) 結(jié)果顯示，α-SMA 在正常組與化瘀理肺方組肺組織中表達(dá)量明顯下降，進(jìn)一步提示化瘀理肺方能夠抑制博萊霉素誘導(dǎo)所致的大鼠肺纖維化。

從分子機(jī)制角度，肺纖維化的發(fā)生與TGF-β、Wnt/β-catenin 和PI3K/Akt 等信號(hào)通路異常激活和失衡密切相關(guān)［8，18，19］。TGF-β 信號(hào)通路的異常激活被認(rèn)為是肺纖維化發(fā)展的核心機(jī)制之一［20］。最新研究顯示，微小RNA（miRNA）在肺纖維化的形成和發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，但其具體調(diào)節(jié)和個(gè)體病理作用在很大程度上仍然未知。部分miRNA，如miR-21、miR-33 等，已被發(fā)現(xiàn)能夠影響纖維母細(xì)胞的增殖和分化、基質(zhì)合成以及免疫反應(yīng)等過程［21-23］。miRNA 也被視為肺纖維化的潛在治療靶點(diǎn)，針對(duì)特定miRNA 進(jìn)行干預(yù)可以抑制肺纖維化的進(jìn)展［24］。miR-27a 是一種其定位在人類的第19 號(hào)染色體上的多效性微小RNA［25］。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-27a 能夠有效緩解博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化，它通過靶向抑制Wnt3a/β-catenin 信號(hào)通路，減少肺組織細(xì)胞外基質(zhì)的損害，從而改善肺纖維化癥狀［9，26］。本研究觀察到模型組肺組織中miR-27a 的水平大幅下降，而通過化瘀理肺方進(jìn)行治療則能夠顯著提高miR-27a的表達(dá)，這暗示了miR-27a 在化瘀理肺方對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的治療中發(fā)揮作用。據(jù)此，推測(cè)miR-27a 在化瘀理肺方對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的抑制作用中發(fā)揮了作用。

miRNA 在調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)方面發(fā)揮重要功能，對(duì)基因調(diào)控、細(xì)胞增殖、分化以及凋亡等生理生化過程有關(guān)鍵影響［27］。α-SMA 由ACTA2 基因編碼［28，29］，而ACTA2 作為重要的纖維化標(biāo)志物，其誘導(dǎo)是決定肌成纖維細(xì)胞分化的常見關(guān)鍵因素［30］。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中，miR-27a 的敲低誘導(dǎo)ACTA2 的表達(dá)，增強(qiáng)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化，并進(jìn)一步支持纖維化［26，31］。在本研究中，利用Targetscan 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)了miR-27a 與編碼α-SMA 的基因ACTA2 存在結(jié)合位點(diǎn)，這些數(shù)據(jù)支持已發(fā)表的研究結(jié)果［31］。因此，推測(cè)miR-27a 通過靶向結(jié)合ACTA2，抑制α-SMA 蛋白表達(dá)，從而介導(dǎo)化瘀理肺方對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化的治療作用。

研究結(jié)果表明，采用化瘀理肺方可治療博萊霉素所致大鼠肺纖維化，促進(jìn)miR-27a 表達(dá)，α-SMA的表達(dá)則明顯下降。而化瘀理肺方是否通過促進(jìn)miR-27a 的表達(dá)，抑制α-SMA 的表達(dá)，從而對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化產(chǎn)生有效的治療作用還需要藥物處理同時(shí)干預(yù)miR-27a 與α-SMA 表達(dá)探討其因果關(guān)系。

綜上所述，研究結(jié)果表明，化瘀理肺方能有效治療通過博萊霉素誘導(dǎo)所致的大鼠肺纖維化，且促進(jìn)miR-27a 表達(dá)，抑制α-SMA 表達(dá)。為化瘀理肺方治療機(jī)制深入理解提供理論依據(jù)。本方可作為中醫(yī)藥臨床防護(hù)肺纖維化的一種新的可行性策略。

作者貢獻(xiàn)度說明：

林凌桑：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與稿件寫作；陳潔：試劑采購(gòu)；李思廣：病理染色；張蕾：實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與修稿；丁毅鵬：經(jīng)費(fèi)支持與稿件確認(rèn)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。