李慶榮 肖 陽 邢東旭 張偉龍 楊 瓊

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 廣東廣州 510610）

我國蠶桑資源極為豐富，桑園種植面積超過1 300萬畝，蠶蛹年產(chǎn)量30萬t以上。蠶蛹中蛋白質(zhì)含量較高，占其干物質(zhì)重的45%～50%，蠶蛹蛋白是一種比大豆蛋白更具營養(yǎng)價(jià)值的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源。近幾年蠶蛹肽蛋白在大口黑鱸、鳊魚、草魚、鴨嘴魚、南美白對(duì)蝦、羅氏沼蝦等養(yǎng)殖上的應(yīng)用研究表明，蠶蛹肽蛋白能明顯降低飼料成本，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖生物生長速度，降低餌料系數(shù)等[1-3]。蠶蛹不僅是優(yōu)質(zhì)蛋白原料，還富含黃酮、抗菌肽、誘食肽等功能性活性物質(zhì)。其中，抗菌肽是家蠶蛹血淋巴內(nèi)重要的抑菌物質(zhì)，具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力、促進(jìn)機(jī)體的新陳代謝等生物學(xué)功能[4]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，小型生態(tài)系統(tǒng)生物繁多，抗生素飼料添加劑容易在諸多生物體內(nèi)殘留，不利于生態(tài)環(huán)境良性循環(huán)，而抗菌肽替代抗生素可增強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物對(duì)病原微生物的抵抗力。有研究表明，用抗菌肽喂養(yǎng)魚可以提高其生長性能，提高魚血清中抗氧化酶的活性，最終會(huì)增加魚的體重（DG）、特定生長率（SGR）等，在對(duì)抗水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病原性感染方面有著重要的作用[5-7]。但是，家蠶體內(nèi)天然抗菌肽豐度相對(duì)較低，抗菌活性不足，特異性不強(qiáng)，無法完全抵抗病原菌的入侵。有研究表明，微生物誘導(dǎo)可以提高家蠶蛹體內(nèi)相關(guān)抗菌肽的表達(dá)水平，提高其抑菌活性[8]。理論上，微生物誘導(dǎo)家蠶蛹后，提高了蠶蛹體內(nèi)抗菌肽表達(dá)量，從而能夠提高血淋巴的抑菌活性，因此本研究采用不同微生物誘導(dǎo)家蠶蛹，分析家蠶蛹血淋巴對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中不同病原微生物的抑菌活性的差異，為人工誘導(dǎo)蠶蛹提高其血淋巴抑菌活性，開發(fā)蠶蛹功能性飼料添加劑提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

家蠶幼蟲及蠶蛹：在正常飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)的5齡家蠶幼蟲及家蠶蛹，來源于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所。

白僵菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蟲草菌、美人魚發(fā)光桿菌、哈維氏弧菌、維氏氣單胞菌等試驗(yàn)菌株均為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所蠶桑南藥與微生物資源加工利用研究室留存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微生物誘導(dǎo)蠶（蛹）的方法

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蟲草菌、美人魚發(fā)光桿菌、哈維氏弧菌、維氏氣單胞菌劃線培養(yǎng)后，挑取單菌落，分別接種入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和BHI培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)。將一定數(shù)量凍存的白僵蠶放入含5‰吐溫-80的無菌水中，攪拌20 min，過濾，獲得白僵菌懸液。將過夜培養(yǎng)的菌液和白僵菌懸液分別配置成106CFU/L～107CFU/L的懸液后，分別采用3種誘導(dǎo)方式處理蠶（蛹），比較誘導(dǎo)后蠶（蛹）血淋巴上清液的抑菌活性。誘導(dǎo)方法包括：（1）蠶蛹注射法。無菌微量注射器注射蠶蛹腹部，每個(gè)蛹注射1 μL菌懸液，放置24 h～96 h；（2）幼蟲喂食法。將桑葉在菌懸液中浸泡后立即取出，喂食5齡幼蟲；（3）噴灑法。將配置好的菌懸液均勻噴灑到蠶蛹的表面。

1.2.2 蠶蛹血淋巴抑菌活性檢測(cè)

取誘導(dǎo)后的蠶蛹血淋巴，煮沸5 min后，離心取上清，獲得血淋巴上清，4 ℃保存?zhèn)溆谩７謩e配制含有5×106CFU/L大腸桿菌、美人魚發(fā)光桿菌、哈維氏弧菌、維氏氣單胞菌等菌株的培養(yǎng)基，倒平板，待其凝固后，用打孔器打孔，每孔加入20 μL的誘導(dǎo)血淋巴上清。陰性對(duì)照為孔內(nèi)加入20 μL未誘導(dǎo)的血淋巴上清或無菌水，陽性對(duì)照為孔內(nèi)加入5 μL 100 μg/mL的氨芐青霉素，靜置吸收后，30 ℃倒置培養(yǎng)過夜，觀察抑菌圈大小。

2 結(jié)果及分析

2.1 不同微生物菌株誘導(dǎo)家蠶蛹血淋巴的抑菌活性差異

利用平板抑菌法檢測(cè)注射不同微生物菌株誘導(dǎo)家蠶蛹后其血淋巴上清的抑菌效果，結(jié)果如圖1所示。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：經(jīng)白僵菌誘導(dǎo)后的家蠶蛹血淋巴上清液對(duì)魚類廣譜病原菌美人魚發(fā)光桿菌、維氏氣單胞菌及哈維氏弧菌有顯著的抑菌效果，而其他檢測(cè)的微生物菌株誘導(dǎo)后，除美人魚發(fā)光桿菌誘導(dǎo)的家蠶蛹血淋巴上清對(duì)美人魚發(fā)光桿菌、維氏氣單胞菌有一定的抑菌效果外，其余病原菌誘導(dǎo)的家蠶蛹血淋巴上清對(duì)美人魚發(fā)光桿菌、維氏氣單胞菌及哈維氏弧菌均沒有明顯抑菌效果。

圖1 不同微生物誘導(dǎo)后家蠶蛹血淋巴的抑菌效果

2.2 不同誘導(dǎo)方式處理后家蠶（蛹）血淋巴抑菌活性分析

比較分析蠶蛹注射、幼蟲喂食及蠶蛹表面噴灑白僵菌后不同時(shí)間家蠶（蛹）血淋巴抑菌活性的差異，結(jié)果如圖2所示?？梢钥吹?，注射和噴灑蠶蛹表面1 d和3 d的血淋巴上清液在大腸桿菌培養(yǎng)基中產(chǎn)生的抑菌圈明顯，而喂食含有白僵菌孢子的桑葉1 d和3 d后的蠶幼蟲血淋巴對(duì)大腸桿菌沒有明顯的抑菌效果。為后期批量誘導(dǎo)易操作考慮，在后續(xù)的分析中，采用噴灑病原菌的方式開展下一步試驗(yàn)。

圖2 不同誘導(dǎo)方式處理的家蠶（蛹）血淋巴對(duì)大腸桿菌的抑菌效果

2.3 白僵菌誘導(dǎo)不同時(shí)間的抑菌結(jié)果分析

取噴灑白僵菌后不同時(shí)間的家蠶蛹血淋巴進(jìn)行抑菌圈檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出：在誘導(dǎo)12 h～96 h的時(shí)間范圍內(nèi)，誘導(dǎo)的家蠶蛹血淋巴對(duì)所檢測(cè)病原菌都有抑菌效果，而正常未經(jīng)過誘導(dǎo)的蠶蛹血淋巴、無菌水等對(duì)所檢測(cè)病原菌沒有明顯抑制效果。其中48 h和72 h的抑菌效果最好，說明在后期的應(yīng)用中，2 d～3 d為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

圖3 白僵菌誘導(dǎo)不同時(shí)間的家蠶蛹血淋巴的抑菌效果

3 分析與討論

抗菌肽是一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)，具有抗菌譜廣、無殘留、殺菌速度快等優(yōu)點(diǎn)，是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中無抗飼料添加劑的優(yōu)質(zhì)替代品。正常情況下，家蠶體內(nèi)抗菌肽豐度低、活性不足，在外源微生物侵染的情況下，大部分抗菌肽誘導(dǎo)性表達(dá)，家蠶體內(nèi)抗菌肽含量提高，對(duì)病原微生物的抑菌活性增加。

本文通過對(duì)喂食、注射及噴灑三種病原誘導(dǎo)方式的分析發(fā)現(xiàn)，家蠶蛹對(duì)注射和噴灑白僵菌比較敏感，誘導(dǎo)后血淋巴上清的抑菌效果顯著，而對(duì)幼蟲喂食浸泡過白僵菌的桑葉后，其血淋巴上清的抑菌圈不明顯，因此本實(shí)驗(yàn)后期采用簡單易操作的噴灑病原菌誘導(dǎo)家蠶蛹的方式提高蠶蛹體內(nèi)抗菌肽的豐度。通過不同病原微生物誘導(dǎo)蠶蛹的血淋巴上清對(duì)三種水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的抑菌結(jié)果可以看出，只有白僵菌誘導(dǎo)后抑菌效果相對(duì)穩(wěn)定，這可能是由于不同微生物侵染蠶蛹的途徑不一樣，或者不同微生物誘導(dǎo)的抗菌肽成分不一樣，造成其對(duì)本研究所選用的三種水產(chǎn)病原菌的抑菌效果不明顯。

本研究明確了體外誘導(dǎo)家蠶蛹提高其血淋巴上清抑菌活性的方法，對(duì)家蠶蛹噴灑106CFU/L～107CFU/L的白僵菌，誘導(dǎo)2 d～3 d后蠶蛹的血淋巴抑制美人魚發(fā)光桿菌、維氏氣單胞菌及哈維氏弧菌等活性較高。后期可基于該研究結(jié)果，針對(duì)家蠶蛹的高值化利用問題進(jìn)一步研究，如開發(fā)一種可以增強(qiáng)魚免疫力的飼料添加劑等。