李劍梅，郭玲玲，柴林山，謝存一，張疏雨，朱萬(wàn)芹

（遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽(yáng) 122000）

粗毛纖孔菌（Inonotushispidus）俗稱名粗毛黃孔菌或粗毛黃褐孔菌，屬于擔(dān)子菌門（Basidiomyeota）、傘菌綱（Agar ieomycetes）、銹革孔菌目（Hymenochaetales）、銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）、纖孔菌屬（Inonotus）[1-2]，主要寄生在榆樹、桑樹、桃樹等闊葉樹的樹干上，在新疆南部以及山東“黃河故道”夏津、臨清等地區(qū)一直將其當(dāng)作“桑黃”并沿用至今[3]，為桑黃的一種，用于治療癌癥、糖尿病、通風(fēng)、關(guān)節(jié)炎等疾病，是我國(guó)重要的藥用真菌[4-5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，粗毛纖孔菌的子實(shí)體含有豐富的多糖、多酚、黃酮、三萜類物質(zhì)和其它活性物質(zhì)[6-8]，具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎、活血化瘀、保肝、增強(qiáng)免疫力和抗氧化等多種功效，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在多個(gè)領(lǐng)域都具有應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)潛能[9-13]。

近年來(lái)，粗毛纖孔菌的藥用成分及其抗氧化能力引起了大量學(xué)者的關(guān)注。Liu 等[14]研究證明粗毛纖孔菌的多糖具有較好的抗氧化活性；昝立峰[15]從新疆南部桑樹粗毛纖孔菌子實(shí)體中分離鑒定出的9 個(gè)多酚類物質(zhì)中的桑黃酚可有效清除1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2，2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis-（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]陽(yáng)離子自由基、羥自由基（·OH），具有良好的抗氧化活性；陳志娜等[16]研究發(fā)現(xiàn)粗毛纖孔菌醇提取物中的總多酚和總黃酮含量較高、抗氧化活性較強(qiáng)；李學(xué)震等[17]通過(guò)對(duì)6 個(gè)桑黃菌株的羥自由基清除率、DPPH 自由基清除率和總還原力進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)粗毛纖孔菌182有較強(qiáng)抗氧化能力。因此，粗毛纖孔菌是天然抗氧化劑的良好來(lái)源。但是，野生粗毛纖孔菌資源稀少，很難找到大量的子實(shí)體，且受季節(jié)限制，雖然已有成功栽培出粗毛纖孔菌子實(shí)體的相關(guān)研究[18]，但存在著出菇率和產(chǎn)量低、品質(zhì)不穩(wěn)定的技術(shù)難題，難以滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。野生菌種質(zhì)資源的收集和鑒定是粗毛纖孔菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一項(xiàng)基礎(chǔ)性研究工作，要推動(dòng)珍稀藥用真菌粗毛纖孔菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展，必須創(chuàng)建和充分利用優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源庫(kù)。但是，目前對(duì)粗毛纖孔菌種質(zhì)資源的發(fā)掘和利用力度不足，亟需對(duì)優(yōu)質(zhì)野生粗毛纖孔菌種質(zhì)資源開展野外調(diào)查、菌株采集、評(píng)價(jià)工作，為優(yōu)質(zhì)高效的粗毛纖孔菌菌種選育、馴化培養(yǎng)及應(yīng)用提供豐富的種質(zhì)資源。本研究以采集于遼寧省喀左縣大營(yíng)子鄉(xiāng)活體桑樹樹干上的野生粗毛纖孔菌子實(shí)體為材料，分離獲得純培養(yǎng)菌株，進(jìn)一步開展分類學(xué)鑒定、培養(yǎng)特性及抗氧化活性評(píng)價(jià)研究，以期為珍稀藥用菌粗毛纖孔菌種質(zhì)資源挖掘及其開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生粗毛纖孔菌子實(shí)體：采集于遼寧省喀左縣大營(yíng)子鄉(xiāng)活體桑樹樹干，采集時(shí)間為2022年8月，由遼寧省微生物科學(xué)研究院藥用蕈菌研究室提供。

Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；無(wú)水乙醇、碳酸鈉、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂（均為分析純）：天津博迪化工股份有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測(cè)定試劑盒、DPPH自由基清除能力測(cè)定試劑盒、羥自由基清除能力測(cè)定試劑盒：蘇州格銳思生物科技有限公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：上海麥克林生化科技有限公司；pH7.0 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）：上海源葉生物科技有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）綜合培養(yǎng)基：200 g 馬鈴薯，20 g 葡萄糖，3 g 蛋白胨，3 g KH2PO4，1.5 g MgSO4·7H2O，10 mg 維生素B1，15 g 瓊脂粉，1 L 蒸餾水，pH6.0。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：200 g 馬鈴薯，3 g KH2PO4，1.5 g MgSO4·7H2O，10 mg 維生素B1，15 g 瓊脂粉，1 L 蒸餾水，pH6.0。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽消毒器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD（標(biāo)準(zhǔn)型）雙人單面凈化工作臺(tái)：常州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；DHP-PZ72 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；OLYMPUS生物顯微鏡：上海通灝光電科技有限公司；2720 thermal cycler 聚合酶鏈反應(yīng)核酸擴(kuò)增儀（polymerase chain reaction，PCR）：美國(guó)Applied Biosystems 公司；DYY-5電泳儀：北京市六一儀器廠；723N 型可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；PR224ZH/E 型電子天平：奧豪斯（上海）儀器有限公司；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離純化方法

采用組織分離法，將采集的子實(shí)體用75%酒精消毒表面，用無(wú)菌手術(shù)刀縱向切開，用接種針挑取子實(shí)體縱切面中心位置的菌塊置于PDA 綜合培養(yǎng)基表面，在25 ℃的環(huán)境中避光培養(yǎng)，待菌絲萌發(fā)后，挑取菌落邊緣新生菌絲于新的PDA 綜合培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，反復(fù)純化培養(yǎng)3 次后，獲得野生粗毛纖孔菌的純培養(yǎng)菌株，編號(hào)SK-4。

1.3.2 物種鑒定

1.3.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

結(jié)合表觀形態(tài)及顯微形態(tài)特征完成樣本形態(tài)學(xué)初步鑒定。利用解剖鏡和顯微鏡觀察子實(shí)體及孢子形態(tài)特征，同時(shí)無(wú)菌挑取供試菌株新鮮斜面培養(yǎng)物置于預(yù)制好的PDA 綜合培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌落形狀，挑取菌落的菌絲，壓片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.3.2.2 分子鑒定

將供試菌株接種至PDA 綜合培養(yǎng)基上，在25 ℃的環(huán)境中避光倒置培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿后取適量菌絲，利用真菌基因組提取試劑盒提取其DNA；利用通用引物內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）1 和ITS4 進(jìn)行ITS 片段擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物后，將PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。結(jié)合所得序列和GenBank 下載的相關(guān)序列，運(yùn)用ClustalX 1.81 進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用MEGA 3.1 的鄰接法（N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3.3 培養(yǎng)特性研究

1.3.3.1 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，其他培養(yǎng)基分別以蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖為碳源。將直徑5 mm 供試菌株的菌塊接種至預(yù)先制備好的供試培養(yǎng)基中央，于25 ℃的環(huán)境中避光、倒置培養(yǎng)。采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，并記錄菌絲生長(zhǎng)情況，確定最適碳源。

1.3.3.2 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，其他培養(yǎng)基分別以牛肉膏、蛋白胨、乙酸銨、硫酸銨、酵母粉為氮源。接種、培養(yǎng)及測(cè)量方法同1.3.3.1，確定最適氮源。

1.3.3.3 pH 值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

采用PDA 綜合培養(yǎng)基，用0.01 mol/L 的HCl 和NaOH 溶液調(diào)節(jié)PDA 綜合培養(yǎng)基初始pH 值分別為3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0。接種、培養(yǎng)及測(cè)量方法同1.3.3.1，確定培養(yǎng)基最適初始pH 值。

1.3.3.4 培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

采用PDA 綜合培養(yǎng)基，接種后分別置于19、22、25、28、31、35 ℃環(huán)境中避光培養(yǎng)。接種、培養(yǎng)及測(cè)量方法同1.3.3.1，確定最適培養(yǎng)溫度。

1.3.4 子實(shí)體抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.3.4.1 子實(shí)體活性成分提取

以試劑殘留少、毒性低的水及70%乙醇為提取溶劑，準(zhǔn)確稱取粗毛纖孔菌子實(shí)體粉末0.500 0 g 共2 份于50 mL 磨口三角瓶中，分別加入20 mL 蒸餾水及70%乙醇，在50 Hz、60 ℃條件下回流超聲輔助提取2 h，分別用蒸餾水及70%乙醇定容至25 mL，于15 ℃、5 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，即可獲得桑黃子實(shí)體水提、醇提供試樣品溶液，于4 ℃保存，備用。

1.3.4.2 多酚含量測(cè)定

參照鄧真華等[19]的測(cè)定方法，以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的A750吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程為y=4.168x-0.008，R2=0.993 0。于750 nm 處分別測(cè)定不同條件下獲得的子實(shí)體提取液的吸光值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算供試樣品液中多酚的濃度，并換算成每克子實(shí)體相對(duì)于沒(méi)食子酸的量（mg/g）。

1.3.4.3 黃酮含量測(cè)定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法，按照龍華等[20]的測(cè)定方法，稍作修改。準(zhǔn)確吸取0.2 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于25 mL 比色管中，分別加70%乙醇至5.0 mL；加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，靜置6 min；加入4%NaOH 溶液10 mL，放置10 min 后用70%乙醇定容至25 mL，510 nm 下測(cè)定吸光值。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程為y=2.536 7x-0.000 4，R2=0.999 7。準(zhǔn)確吸取不同條件獲得的粗毛纖孔菌子實(shí)體提取液3.0 mL 于25 mL 比色管中，同法測(cè)定供試樣品液的吸光值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算供試樣品液中黃酮的濃度，并換算成每克子實(shí)體相對(duì)于蘆丁的量（mg/g）。

1.3.4.4 多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法，按照余麗等[21]的測(cè)定方法。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的A490吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程為y=12.274x+0.01，R2=0.999 1，于490 nm 處分別測(cè)定不同條件獲得的粗毛纖孔菌子實(shí)體提取液的吸光值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算供試樣品液中多糖的濃度，并換算成每克子實(shí)體相對(duì)于葡萄糖的量（mg/g）。

1.3.4.5 總抗氧化能力測(cè)定

采用Trolox 等效總抗氧化能力評(píng)價(jià)方法，使用總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒（ABTS 法）對(duì)子實(shí)體不同提取液進(jìn)行測(cè)試分析，測(cè)試步驟參考試劑盒說(shuō)明書，按照公式（1）計(jì)算供試樣品總抗氧化能力。

式中：M為總抗氧化能力，μmol Trolox/g；△A為吸光值差值；A測(cè)定為樣品ABTS 的吸光值；A對(duì)照為樣品與PBS 混合液吸光值；A空白為ABTS 工作液與PBS 混合液的吸光值；D為樣品的稀釋倍數(shù)；W為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4.6 DPPH 自由基清除率測(cè)定

利用DPPH 自由基清除能力測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)試分析，測(cè)試步驟參考試劑盒說(shuō)明書，按照公式（2）計(jì)算供試樣品液的DPPH 自由基清除率，按照公式（3）計(jì)算供試樣品的DPPH 自由基的清除能力。

式中：M1為DPPH 自由基清除率，%；M2為DPPH自由基清除能力，mg Trolox/g；A測(cè)定為樣品與DPPH 混合液吸光值；A對(duì)照為樣品與無(wú)水乙醇混合液吸光值；A空白為DPPH 與無(wú)水乙醇混合液吸光值；D為樣品的稀釋倍數(shù)；W為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4.7 羥自由基清除率測(cè)定

利用羥自由基清除能力測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)試分析，測(cè)試步驟參考試劑盒說(shuō)明書，按照公式（4）計(jì)算供試樣品的羥自由基清除率。

式中：N為羥自由基清除率，%；A測(cè)定為測(cè)定管的吸光值；A對(duì)照為對(duì)照管的吸光值；A空白為空白管的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用軟件Excel 2007、IBM SPSS Statistics25 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

SK-4 菌株子實(shí)體、菌落及菌絲體形態(tài)見圖1。

圖1 SK-4 菌株形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of SK-4 strain

由圖1 可知，試驗(yàn)菌株子實(shí)體平展至半圓形，無(wú)柄，木栓質(zhì)，新生子實(shí)體表面光滑、呈淡黃色；成熟子實(shí)體表面覆蓋著粗毛、呈黃褐色至暗褐色，菌蓋邊緣頓，菌管管口多角形，較菌肉色澤淺；擔(dān)孢子呈橢圓形，表面光滑，金黃色，有明顯厚壁；在PDA 綜合培養(yǎng)基上，以接種塊為中心呈輻射狀擴(kuò)張生長(zhǎng)，菌絲初期為白色絨毛狀，后逐漸變?yōu)檩^暗的淺黃褐色，邊緣為白色細(xì)微菌絲，菌絲有分枝和分隔，老熟菌絲呈淡黃色，無(wú)鎖狀聯(lián)合。這些特征與郭春宣等[22]描述的粗毛纖孔菌形態(tài)特征一致。

2.1.2 分子鑒定

經(jīng)過(guò)對(duì)SK-4 菌株ITS 序列的測(cè)定及生物大分子序列比對(duì)搜索工具比對(duì)，發(fā)現(xiàn)SK-4 菌株ITS 序列的長(zhǎng)度為738 bp，與粗毛纖孔菌MZ467700.1、MN699465.1 ITS 序列的相似度達(dá)到了99%以上，顯示較高的同源性比對(duì)結(jié)果。從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心選取與SK-4 菌株同源性較高的菌株及在分類上易與粗毛纖孔菌混淆的桑黃菌屬模式菌種的ITS 序列，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示。

圖2 基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由圖2 可知，SK-4 菌株與GenBank 中的3 株粗毛纖孔菌InonotushispidusITS 片段聚在一個(gè)高支持率的獨(dú)立支系，親緣關(guān)系較近，尤其是與粗毛纖孔菌MZ467700.1、MN699465.1 的親緣關(guān)系最近，屬于同一個(gè)物種，進(jìn)一步證實(shí)了SK-4 菌株為粗毛纖孔菌，該結(jié)果與子實(shí)體形態(tài)鑒定結(jié)果一致。結(jié)合形態(tài)鑒定和分子生物學(xué)結(jié)果，將采集的菌株鑒定為粗毛纖孔菌Inonotushispidus。

2.2 生物學(xué)特性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

不同碳源對(duì)試驗(yàn)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果見表1。

表1 不同碳源對(duì)SK-4 菌株菌絲生長(zhǎng)的影響Table 1 Effects of different carbon sources on the mycelium of SK-4 strain

由表1 可知，試驗(yàn)范圍內(nèi)，SK-4 菌株在不同碳源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況存在明顯差異。在菌絲生長(zhǎng)速度方面，供試菌株菌絲的生長(zhǎng)速度由快到慢依次為蔗糖＞甘露醇＞乳糖＞麥芽糖＞葡萄糖；在菌絲長(zhǎng)勢(shì)方面，相比其它碳源培養(yǎng)基，SK-4 菌株在蔗糖培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)最佳，菌落黃褐色、邊緣整齊、致密毯狀、菌絲濃密旺盛；葡萄糖培養(yǎng)基次之，甘露醇培養(yǎng)基上菌絲長(zhǎng)勢(shì)最差，菌落邊緣不整齊、菌絲較細(xì)弱稀疏；無(wú)碳源的對(duì)照培養(yǎng)基菌絲也能萌發(fā)生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)速度為1.93 mm/d，明顯低于葡萄糖培養(yǎng)基，菌絲長(zhǎng)勢(shì)較甘露醇培養(yǎng)基更為細(xì)弱稀疏。由此可見，碳源是菌絲生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)成分，培養(yǎng)基中添加不同的碳源對(duì)SK-4 菌株菌絲生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，綜合菌絲長(zhǎng)勢(shì)和菌絲生長(zhǎng)速度，SK-4 菌株生長(zhǎng)的最適碳源為蔗糖。

2.2.2 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

不同氮源對(duì)試驗(yàn)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果見表2。

表2 不同氮源對(duì)SK-4 菌株菌絲生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of the different nitrogen sources on the mycelium of SK-4 strain

由表2 可知，試驗(yàn)范圍內(nèi)，不同的氮源對(duì)SK-4菌株菌絲的生長(zhǎng)影響顯著。氮源為酵母粉、硫酸銨培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌株菌絲的生長(zhǎng)速度相近，分別為2.51、2.58 mm/d，明顯優(yōu)于其它氮源培養(yǎng)基，其次為無(wú)氮源對(duì)照、蛋白胨、乙酸銨、牛肉膏培養(yǎng)基。酵母粉為氮源培養(yǎng)基上的菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好，菌落呈淺黃褐色，菌絲濃密健壯，菌落呈致密毯狀、邊緣整齊；硫酸銨培養(yǎng)基次之，菌絲較為濃密健壯、菌落邊緣整齊；牛肉膏、蛋白胨為氮源培養(yǎng)基上的菌絲較為稀疏，菌落邊緣不整齊；乙酸銨培養(yǎng)基上的菌絲長(zhǎng)勢(shì)最差，菌落中心略顯淡黃色，菌落周邊白色菌絲氣生性強(qiáng)，且細(xì)弱稀疏；無(wú)氮源對(duì)照培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度（1.93 mm/d）介于硫酸銨（2.58 mm/d）和蛋白胨（1.66 mm/d）培養(yǎng)基之間，菌絲較為細(xì)弱稀疏，說(shuō)明酵母粉、硫酸銨對(duì)試驗(yàn)菌株菌絲的生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用。綜合菌絲長(zhǎng)勢(shì)和菌絲生長(zhǎng)速度，SK-4 菌株生長(zhǎng)的最適氮源為酵母粉。

2.2.3 pH 值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

不同pH 值對(duì)試驗(yàn)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響見表3。

表3 pH 值對(duì)SK-4 菌株菌絲生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of different pH on the mycelium of SK-4 strain

由表3 可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，SK-4 菌株在酸度較強(qiáng)的pH3.0 培養(yǎng)基上停止生長(zhǎng)，但在pH4.0～9.0 條件下均能生長(zhǎng)，除在pH4.0 菌絲生長(zhǎng)緩慢、長(zhǎng)勢(shì)細(xì)弱外，在pH 值為5.0～9.0 時(shí)菌絲生長(zhǎng)情況均較好，說(shuō)明SK-4菌株能較好地適應(yīng)pH 值為5.0～9.0 的環(huán)境；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH 值為5.0、5.5 時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度達(dá)到較高水平，分別為2.50、2.27 mm/d，明顯優(yōu)于其它處理，pH5.0菌絲生長(zhǎng)速度最快。因此，SK-4 菌株菌絲生長(zhǎng)最適pH值為5.0。

2.2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

不同培養(yǎng)溫度對(duì)試驗(yàn)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果見表4。

培養(yǎng)溫度的變化對(duì)食用菌菌株的影響較大，培養(yǎng)溫度過(guò)高或過(guò)低均不利于其生長(zhǎng)繁殖。由表4 可知，試驗(yàn)范圍內(nèi)，SK-4 菌株的菌絲生長(zhǎng)速度隨培養(yǎng)溫度升高逐漸加快，菌絲的長(zhǎng)勢(shì)也隨著培養(yǎng)溫度的升高而逐步改善，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到25～28 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度為2.52～2.56 mm/d，菌絲生長(zhǎng)速度相對(duì)穩(wěn)定，并且達(dá)到了較高水平，此時(shí)菌絲長(zhǎng)勢(shì)也最為濃密、旺盛；隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌絲生長(zhǎng)受到抑制，菌絲長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?、生長(zhǎng)速度減慢。由此可見，SK-4 菌株最適生長(zhǎng)溫度為25～28 ℃。

2.3 抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1 主要活性成分含量及抗氧化活性

SK-4 菌株子實(shí)體活性成分含量分析及抗氧化活性測(cè)試結(jié)果見表5。

表5 子實(shí)體不同提取物的主要活性成分含量及抗氧化活性Table 5 Content of active components and antioxidant activity of the fruiting body extracts prepared with different solvents

由表5 可知，SK-4 菌株子實(shí)體含有豐富的黃酮、多酚及多糖成分，不同提取溶劑所獲提取物中黃酮、多酚、多糖的含量存在明顯差異。其中，子實(shí)體70%乙醇提物中黃酮、多酚的含量明顯高于水提物，其黃酮、多酚含量分別是水提物的1.13、1.28 倍，而子實(shí)體多糖主要存在于水提物中，水提物中多糖的含量是醇提物多糖含量的1.99 倍，明顯高于醇提物，說(shuō)明SK-4 菌株子實(shí)體多糖主要為水溶性多糖，而70%乙醇溶液更有利于提取SK-4 菌株子實(shí)體酚類化合物。試驗(yàn)范圍內(nèi)，供試菌株子實(shí)體70%乙醇提取物的DPPH自由基清除能力（5.83 mg Trolox/g）雖略低于水提物（6.29 mg Trolox/g），但總抗氧化能力（70.98 μmol Trolox/g）是水提物（45.56 μmol Trolox/g）的1.56 倍，同時(shí)其醇提物具有羥自由基清除能力，未檢測(cè)到水提物羥自由基清除能力，可見試驗(yàn)菌株子實(shí)體不同提取物均具有一定的抗氧化活性，其中子實(shí)體70%乙醇提取物的抗氧化活性明顯優(yōu)于水提物。

2.3.2 抗氧化活性與主要活性成分含量相關(guān)性分析

抗氧化活性與主要活性成分含量相關(guān)性分析結(jié)果見表6。

表6 子實(shí)體不同提取物的抗氧化活性與活性成分相關(guān)性分析Table 6 Correlation coefficients of antioxidant activity with the active component content in fruiting bodies

由表6 可知，試驗(yàn)范圍內(nèi)，供試菌株子實(shí)體總抗氧化能力、羥自由基清除率與多酚和黃酮的含量呈線性正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)均大于0.95，與DPPH 自由基清除能力呈一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系；多糖含量與DPPH自由基清除能力相關(guān)系數(shù)為0.557，呈中等的正相關(guān)，與總抗氧化能力、羥自由基清除率呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。說(shuō)明黃酮及多酚是粗毛纖孔菌SK-4 總抗氧化能力、羥自由基清除能力的關(guān)鍵物質(zhì)，而多糖是其DPPH自由基清除能力的主要活性成分。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以寄生在活體桑樹上的粗毛纖孔菌子實(shí)體為材料，通過(guò)菌種的分離、純化，獲得純培養(yǎng)菌株SK-4，并通過(guò)形態(tài)特性觀察、ITS 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建將其鑒定為粗毛纖孔菌Inonotushispidus。培養(yǎng)特性試驗(yàn)結(jié)果顯示：試驗(yàn)范圍內(nèi)，寄生在活體桑樹上的野生菌株SK-4 菌絲生長(zhǎng)的最適碳源和氮源分別為蔗糖和酵母粉，最適pH 值為5.0，最適培養(yǎng)溫度為25～28 ℃。野生菌種資源是粗毛纖孔菌優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)菌種選育的重要來(lái)源，但由于生長(zhǎng)環(huán)境條件及菌種種性的差異，其菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)條件、培養(yǎng)溫度、pH 值等培養(yǎng)條件有所不同，故加強(qiáng)野生菌種質(zhì)資源采集、鑒定及培養(yǎng)特性研究，對(duì)豐富粗毛纖孔菌菌種資源及粗毛纖孔菌株SK-4 人工馴化培養(yǎng)具有重要意義。

在探究SK-4 菌株生物學(xué)特性基礎(chǔ)上，以試劑殘留少、毒性低的水及70%乙醇為提取溶劑，進(jìn)一步研究了野生粗毛纖孔菌SK-4 子實(shí)體主要活性成分的含量及體外抗氧化活性。結(jié)果表明，子實(shí)體70%乙醇提取物具有總抗氧化能力、DPPH 自由基清除能力、羥自由基清除能力3 個(gè)體系的抗氧化活性，抗氧化活性明顯優(yōu)于水提物，特別是總抗氧化能力達(dá)到了水提物的1.56 倍；SK-4 菌株子實(shí)體的水提物及醇提物均含有豐富的多糖、黃酮及多酚成分，其子實(shí)體多糖主要存在水提物中，水提物中多糖的含量是醇提物多糖含量的1.99 倍，且其多糖含量與DPPH 自由基清除能力呈中等正相關(guān)（R2=0.557），與總抗氧化能力、羥自由基清除率呈負(fù)相關(guān)；70%乙醇溶液有利于黃酮、多酚的提取，黃酮、多酚含量分別是水提物的1.13、1.28 倍，二者的含量與總抗氧化能力、羥自由基清除率呈極顯著正相關(guān)（R2＞0.95），與DPPH 自由基清除能力呈負(fù)相關(guān)。這一研究結(jié)果說(shuō)明了SK-4 菌株子實(shí)體多糖成分是其清除DPPH 自由基的主要活性成分，而其子實(shí)體中的黃酮、多酚對(duì)粗毛纖孔菌SK-4 抗氧化活性起到了關(guān)鍵作用。本研究為粗毛纖孔菌SK-4 菌株子實(shí)體中抗氧化活性成分提取及開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。