劉辰玥，梁鐸，劉芯怡，程沙沙

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球約有20 億人經(jīng)常飲酒，其中超過7 500 萬人被診斷出患有與酗酒相關(guān)的疾病，并面臨發(fā)展為與酒精相關(guān)的肝病的風(fēng)險[1]。酒精性肝損傷是酒精與肝臟細(xì)胞頻繁接觸而導(dǎo)致的一種肝損傷，主要由于酒精代謝產(chǎn)物會改變細(xì)胞色素P450s的酶活性、增加細(xì)胞內(nèi)游離鐵的水平以及降低谷胱甘肽、谷氨酸等抗氧化劑的水平，從而促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和肝細(xì)胞損傷[2-5]。過量飲酒會導(dǎo)致酒精性肝損傷，繼而引發(fā)一系列病理特征，包括從單純性脂肪變性到急性酒精性肝炎、慢性纖維化、肝硬變以及肝細(xì)胞癌等[6]。

目前，對于酒精性肝損傷的改善途徑，主要通過減輕酒精性肝損傷的嚴(yán)重程度、阻止肝纖維化、改善繼發(fā)性營養(yǎng)不良和治療酒精性肝硬化等[7]。主動戒酒是目前緩解酒精性肝損傷最有效的方法，但對大多數(shù)人來說比較困難。近年來，營養(yǎng)或功能食品干預(yù)逐漸成為緩解或預(yù)防酒精性肝損傷的新策略，營養(yǎng)功能食品越來越受到人們的關(guān)注。降低活性氧水平可減輕酒精引起的氧化應(yīng)激，從而有助于抑制酒精性肝損傷[8]。Kirpich 等[9]最早使用益生菌治療酒精性肝損傷患者，發(fā)現(xiàn)B.bifidum和L.plantarum8PA3 顯著增加了人糞便中乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，改變了血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、低密度脂蛋白和總膽紅素水平。Zhou 等[10]發(fā)現(xiàn)生物活性多肽如玉米肽和鯊魚肝源性多肽，由于其抗氧化能力而顯示出對酒精性肝損傷的保護(hù)作用。此外，根據(jù)Li 等[11]的報道，桑葚多糖的肝臟保護(hù)活性可能與其對乙醇脫氫酶的活化、自由基的消除和/或脂質(zhì)過氧化能力的抑制有關(guān)。

雨生紅球藻（Haematococcuspluvialis）是一種單細(xì)胞綠藻，可在細(xì)胞內(nèi)積累大量具有良好抗氧化活性的蝦青素，已被我國批準(zhǔn)為新資源食品原料[12]。目前，大多數(shù)研究主要集中在雨生紅球藻中蝦青素的提取和功能活性的評價，而對其蛋白利用的報道相對較少[13-14]。事實(shí)上，雨生紅球藻中的蛋白質(zhì)含量為18%～30%，其必需氨基酸模式接近聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織提出的理想模式，是一種潛在的可利用蛋白質(zhì)來源[15]。研究表明，雨生紅球藻蛋白具有良好的乳化特性和乳化穩(wěn)定性，為Pickering 乳液乳化劑的發(fā)展提供了新的可能性[16-17]。作為一種藻類來源的乳化劑，雨生紅球藻蛋白的提取率可能較其他植物蛋白低，但其具有用量更少、不易受溫度影響、對環(huán)境影響小等優(yōu)勢。

因此，本研究通過鹽析法提取雨生紅球藻蛋白（Haematococcuspluvialisprotein，HPP），并通過一步乳化法制備穩(wěn)定的Pickering 乳液。通過構(gòu)造急性小鼠酒精性肝損傷模型，研究雨生紅球藻蛋白Pickering乳液對小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用，以期為雨生紅球藻蛋白的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

C57BL/6J 小鼠：遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，雄性，周齡8～10 周，體質(zhì)量（20±2）g，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2020-0001。飲用自來水，飼以標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料，每日進(jìn)行12 h 光照和12 h 黑暗，室內(nèi)溫度維持在（23±2）℃，相對濕度保持在40%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。

1.2 材料與試劑

雨生紅球藻藻粉：昆明白鷗微藻技術(shù)有限公司（中國昆明）；玉米油：西王集團(tuán)有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性測定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）活性測定試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性測定試劑盒、丙二醛（malondi aldehyde，MDA）試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器與設(shè)備

高速分散機(jī)（MICCRA D-4）：廣州邁卡徠克工業(yè)技術(shù)有限公司；熒光倒置顯微鏡（Ti-S）：日本Nikon 公司；多功能酶標(biāo)儀（Infinite M200）：上海帝肯實(shí)驗(yàn)器材有限公司；臺式離心機(jī)（H1850R）：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（SY-2000）：上海亞榮生化儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 雨生紅球藻蛋白Pickering 乳液的制備及表征

參考朱明輝[18]的方法稍作修改，提取HPP。將100 g雨生紅球藻藻粉加入2 L 2%氯化鈉溶液中，攪拌至均勻分散，室溫下過夜，使其充分溶脹。將雨生紅球藻藻液在45 ℃的水浴中超聲作用2 h，使雨生紅球藻細(xì)胞壁破裂，提高蛋白質(zhì)的提取效率。超聲處理后，在4 ℃下以7 000 r/min 離心15 min，收集上清液。向上清液中加入0.662 g/mL 的硫酸銨粉末，充分溶解后以12 000 r/min的速度在4 ℃下離心5 min 收集蛋白質(zhì)沉淀。將沉淀物溶于250 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）中，得到雨生紅球藻蛋白溶液。用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法將蛋白質(zhì)溶液在45 ℃下濃縮，備用。

采用高速分散機(jī)通過一步均質(zhì)法，將2%的HPP 水溶液與玉米油（70%油相比）的混合物在10 000 r/min 下剪切3 min，制備HPP 穩(wěn)定的水包油型Pickering 乳液。

將乳液樣品滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，采用倒置顯微鏡觀察乳液液滴的大小及分布。采用掃描電子顯微鏡和樣品制備系統(tǒng)觀察HPP 的形貌。將HPP 穩(wěn)定的Pickering 乳液樣品放在冷凍傳輸-掃描電子顯微鏡的樣品臺上，液氮冷凍后轉(zhuǎn)移至樣品制備系統(tǒng)進(jìn)行斷裂和噴金，再轉(zhuǎn)移到電鏡觀察室，在-140 ℃下進(jìn)行觀察。采用體外模擬消化模型評估乳液的可消化性，使用的模擬唾液、胃液和腸液根據(jù)文獻(xiàn)[19]的方法預(yù)先進(jìn)行配制。將7.5 mL 乳液與等體積的模擬唾液混合，并在37 ℃下以100 r/min 的速度混勻2 min；之后加入7.5 mL 的人工胃液，并在37 ℃下以100 r/min 的速度攪拌120 min；將模擬胃液消化混合物的pH 值調(diào)節(jié)至7.0，并與模擬腸液以1∶2 的體積比混合。消化過程中的乳液狀態(tài)采用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.4.2 動物分組與處理

將50 只小鼠隨機(jī)分組，每組10 只。小鼠共分為5 組：對照（Control）組、模型（ALD）組、玉米油（Oil）組、雨生紅球藻蛋白（HPP）組和雨生紅球藻蛋白Pickering乳液（PE）組。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后，重新記錄時間，記錄為0 d。對照組在第0～16 天正常飼喂飼料和飲用自來水；模型組在第0～14 天正常飼喂，第15 天斷水?dāng)嗉Z并灌胃濃度30%的酒精1 次，12 h 后再次灌胃濃度50%的酒精1 次；其他樣品組在第0～14 天進(jìn)行正常飼喂的基礎(chǔ)上，分別灌胃200 μL 的玉米油、雨生紅球藻蛋白、雨生紅球藻蛋白乳液進(jìn)行干預(yù)，第15 天處理與模型組相同。在酒精肝損傷模型構(gòu)建期間時刻關(guān)注小鼠情況，第16 天采血后將小鼠全部處死，并摘取小鼠的組織和器官，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)測定。

1.4.3 標(biāo)本的采集與處理

利用眼球取血法采集小鼠血液樣品，置于4 ℃預(yù)冷的離心機(jī)中，4 000 r/min 離心10 min，取上清并做好標(biāo)記保存于-80 ℃的冰箱中。采血后使用頸椎脫位法處死小鼠，剖開小鼠腹腔取小鼠各部分器官，每個器官都精準(zhǔn)測量其質(zhì)量并記錄。每組取3 只小鼠的肝臟、心臟、腎臟和胃等器官用4%多聚甲醛溶液固定，其中，肝臟只切割出整個肝組織的一葉。其余小鼠器官迅速放入液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存。

1.4.4 小鼠體質(zhì)量的測定

從樣品開始干預(yù)的第0 天開始，每隔1 d 稱1 次質(zhì)量，直至樣品干預(yù)結(jié)束。

1.4.5 小鼠肝臟指數(shù)的測定及肝臟形態(tài)的觀察

在小鼠處死前稱其質(zhì)量，處死后取出小鼠肝臟，稱其質(zhì)量，并觀察其形態(tài)。肝臟指數(shù)（X，%）的計算公式如下。

X=m1/m2×100

式中：m1為肝臟質(zhì)量，g；m2為小鼠體質(zhì)量，g。

1.4.6 組織病理學(xué)觀察

取出的肝臟、心臟、腎臟和胃組織迅速固定于4%多聚甲醛固定液，進(jìn)行組織切片，蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）處理，送回后使用倒置顯微鏡觀察各組織的病理損傷情況。

1.4.7 血清生化指標(biāo)檢測

取保存好的血清樣本進(jìn)行測定。谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽固醇和甘油三酯的含量檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.4.8 肝臟生化指標(biāo)檢測

分別取不同組的小鼠肝組織200 mg，加入1.8 mL無菌生理鹽水，使用電動勻漿機(jī)將組織充分研磨，放至4 ℃預(yù)冷的離心機(jī)中，4 000 r/min 離心10 min，取出離心后的上清液，保存在-80 ℃的冰箱中。每個樣品中的蛋白濃度使用BCA 試劑盒測定。對超氧化物歧化酶、丙二醛、還原型谷胱甘肽和谷胱甘肽過氧化物酶水平進(jìn)行測定。所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用IBM SPSS Statistics 27 軟件分析，采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行組間比較，p＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pickering 乳液的外觀及微觀結(jié)構(gòu)

圖1 為雨生紅球藻蛋白Pickering 乳液的外觀及微觀結(jié)構(gòu)。

圖1 雨生紅球藻蛋白Pickering 乳液的外觀及微觀結(jié)構(gòu)Fig.1 Appearance and microstructure of Pickering emulsion stabilized by Haematococcus pluvialis protein

通過前期研究不同HPP 濃度與油相比例對Pickering 乳液穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻蛋白濃度為2%，油相比例為70%時，制備的Pickering 乳液狀態(tài)最佳。由圖1B 可知，乳液中沒有水相層或油相層的析出，顏色呈現(xiàn)出蝦青素的特征顏色，原因可能是蛋白提取過程中雨生紅球藻中的蝦青素和蛋白質(zhì)相結(jié)合。由圖1C 可知，Pickering 乳液中的油滴分布較為均勻且排列緊密，油滴的平均尺寸為（21±5）μm。由圖1D 可知，乳液中液滴的結(jié)構(gòu)呈球型，直徑大小為20～30 μm，與光學(xué)顯微鏡的觀察結(jié)果相一致。

2.2 Pickering 乳液的模擬消化

制備的Pickering 乳液在消化過程中的外觀及微觀結(jié)構(gòu)的變化如圖2所示。

圖2 雨生紅球藻蛋白Pickering 乳液模擬消化過程中的外觀及顯微結(jié)構(gòu)的變化Fig.2 Changes of appearance and microstructure of Pickering emulsion stabilized by Haematococcus pluvialis protein during simulated digestion

由圖2 可知，唾液中的液滴尺寸比新制備乳液液滴大，可能是在唾液的稀釋作用下，液滴不斷地聚集和融合的結(jié)果；經(jīng)胃液消化2 h 后，液滴大小沒有明顯變化，幾乎未見油滴聚集，因?yàn)槲敢褐胁缓纸庵镜拿?；?jīng)腸液消化1 h 和2 h 后，乳液液滴尺寸逐漸減小，乳液開始出現(xiàn)明顯的油滴，說明乳液在腸液中開始分解。上述結(jié)果顯示，由HPP 穩(wěn)定的Pickering 乳液能夠在模擬腸液中較好地消化，為后續(xù)探究乳液對急性酒精性肝損傷的保護(hù)效果提供參考。

2.3 小鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)變化

在樣品干預(yù)的整個過程中，小鼠的體質(zhì)量變化可以間接反映樣品的安全性。樣品干預(yù)期間小鼠的體質(zhì)量變化及各組小鼠的肝臟指數(shù)如圖3所示。

圖3 樣品干預(yù)過程中小鼠的體質(zhì)量變化及各組小鼠的肝臟指數(shù)Fig.3 Body weight changes of mice during sample intervention and liver index of mice in each group

從圖3 可以看出，在14 d 觀察時間內(nèi)，5 組小鼠的體質(zhì)量沒有發(fā)生明顯變化，在第14 天時，不同組小鼠之間的平均體質(zhì)量差異不明顯，說明玉米油、雨生紅球藻蛋白和雨生紅球藻蛋白穩(wěn)定的Pickering 乳液樣品的干預(yù)不影響小鼠體質(zhì)量的變化，對小鼠的正常生長沒有傷害性的影響，所制備的樣品具有良好的生物相容性。正常情況下，小鼠肝臟指數(shù)的比例相對穩(wěn)定，但當(dāng)肝臟器官充血、水腫，或增生、肥大時，肝臟指數(shù)增加；反之，肝臟指數(shù)下降。ALD 組與對照組相比肝臟指數(shù)顯著增加，較對照組升高29.9%，說明酒精造模使小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的增大、腫脹，使肝臟變重。與ALD 組相比，Oil 組和PE 組的肝臟指數(shù)分別顯著下降12.7%和14.7%（p＜0.05），但HPP 組的改善效果不顯著。以上結(jié)果顯示，玉米油和雨生紅球藻蛋白穩(wěn)定的Pickering 乳液的干預(yù)均能在一定程度上緩解酒精對肝臟指數(shù)的影響。

2.4 Pickering乳液對小鼠肝臟形態(tài)的影響

圖4 是不同處理組小鼠肝臟外觀組織形態(tài)的變化。

圖4 各組小鼠的肝臟外觀形態(tài)Fig.4 Liver appearance and morphology of mice in each group

從圖4 可以看出，對照組小鼠的肝臟正常，顏色呈玫瑰色，光澤鮮紅，有彈性，并且邊緣比較銳利，沒有發(fā)生病變；ALD 組小鼠經(jīng)酒精處理后的肝臟顏色暗淡無光澤，質(zhì)地變軟，邊緣變鈍，且有部分組織壞死；Oil 組小鼠的肝臟顏色較ALD 組有一定光澤，并且邊緣有一定的銳利度；HPP 組小鼠的肝臟狀態(tài)較ALD 組有所改善，但顏色仍比較暗淡，無光澤；PE 組小鼠的肝臟顏色鮮紅，彈性有所恢復(fù)，且邊緣也出現(xiàn)明顯的銳利現(xiàn)象，狀態(tài)與對照組接近。這一結(jié)果與肝臟指數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，經(jīng)樣品組的干預(yù)后，小鼠肝臟的病變現(xiàn)象較ALD 組均有所改善，其中PE 組改善效果最佳，說明HPP 穩(wěn)定的Pickering乳液對ALD 小鼠的肝損傷有一定的保護(hù)作用。

2.5 HPP 穩(wěn)定的Pickering乳液對小鼠器官組織病理學(xué)影響

對各組小鼠的肝臟、胃、心臟和腎臟組織進(jìn)行病理學(xué)觀察，結(jié)果如圖5所示。

圖5 各組小鼠的肝臟、胃、心臟和腎臟組織病理切片F(xiàn)ig.5 Pathological sections of liver，stomach，heart，and kidney of mice in each group

由圖5 可知，對照組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)正常，致密的肝細(xì)胞整齊排列在中央靜脈周圍，可以觀察到清晰的細(xì)胞間隙，且細(xì)胞核為規(guī)則的圓形，沒有發(fā)生病變；ALD 組小鼠的肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂且細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間隙模糊或過大，細(xì)胞核形狀不規(guī)則，有破裂或溶解現(xiàn)象出現(xiàn)，并伴有粒細(xì)胞的侵入，發(fā)生病變；Oil 組小鼠肝細(xì)胞仍有一定腫脹，細(xì)胞間隙稍有模糊但細(xì)胞沒有出現(xiàn)融合，病變情況優(yōu)于ALD 組，但不能完全改善酒精所導(dǎo)致的肝損傷；HPP 組中小鼠肝細(xì)胞排列較為整齊，結(jié)構(gòu)輪廓相對完整，細(xì)胞核形狀也較為規(guī)則，但仍有少量炎癥細(xì)胞的存在，在很大程度上預(yù)防了酒精性肝損傷；PE 組的肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，排列相對整齊，細(xì)胞間隙較為清晰，還有少量的肝細(xì)胞腫脹，但沒有炎癥細(xì)胞的存在，組織形態(tài)與對照組接近。以上結(jié)果表明，HPP 穩(wěn)定的Pickering 乳液能有效改善ALD小鼠中酒精所導(dǎo)致的肝臟損傷。另外，酒精處理還能引起胃組織微觀結(jié)構(gòu)的變化，造成胃黏膜腺體排列不均，細(xì)胞核排列紊亂，粒細(xì)胞堆積嚴(yán)重。經(jīng)Oil 組干預(yù)后，腺體排列的整齊度有所改善，但仍有炎癥細(xì)胞；HPP 組和PE 組小鼠的胃黏膜細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核分布均勻，黏膜損傷較少，基本無炎癥細(xì)胞。以上結(jié)果表明HPP 和HPP 穩(wěn)定的Pickering 乳液均可以減輕酒精所帶來的胃損傷。從心臟和腎臟結(jié)果來看，各處理組之間無明顯差異，表明酒精處理不會對心臟和腎臟器官造成顯著性的損傷。

2.6 HPP 穩(wěn)定的Pickering乳液對小鼠血清相關(guān)指標(biāo)的影響

為了進(jìn)一步研究酒精對小鼠肝臟的損傷情況，以及不同樣品處理對肝損傷的緩解情況，分別對小鼠血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性、總膽固醇和甘油三酯的含量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖6所示。

圖6 各組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽固醇和甘油三酯的水平Fig.6 Serum levels of alanine transaminase，aspartate transaminase，total cholesterol，and triglycerides in mice of each group

谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝組織受到損傷或有炎癥因子的侵入時，便會釋放到血液中，是檢測肝臟細(xì)胞是否受到損害的常用指標(biāo)[20]。由圖6 可知，與對照組相比，ALD 組小鼠血清的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均顯著升高（p＜0.05），說明酒精處理引起了小鼠肝臟損傷，也證明了ALD 小鼠模型的成功建立。與模型組相比，Oil 組、HPP 組與PE組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平分別下降30.2%、42.5%和63.9%，其中HPP 組和PE 組緩解效果顯著且PE 組水平下降最為明顯（p＜0.05）。對于谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，Oil 組、HPP組與PE 組均有明顯的緩解作用，其中PE 組較ALD組下降31.8%，且與對照組無顯著差異（p＞0.05）。以上結(jié)果表明，雨生紅球藻蛋白穩(wěn)定的Pickering乳液對ALD 組小鼠肝損傷具有最佳的改善作用。與對照組相比，ALD 組小鼠的總膽固醇和甘油三酯含量分別升高60.9%和121.3%，這表明ALD 組小鼠體內(nèi)膽固醇運(yùn)輸途徑受到損害，造成血脂的代謝紊亂[21]。在總膽固醇結(jié)果中，Oil 組、HPP 組與PE 組相較于ALD 組均可抑制酒精誘導(dǎo)的總膽固醇水平升高，其中PE 組小鼠的總膽固醇含量下降到與對照組相當(dāng)?shù)乃?，緩解效果最好。從甘油三酯的結(jié)果來看，Oil 組的甘油三酯水平與ALD 組幾乎無差別，可能是因?yàn)楣辔傅挠衩子驮谀懼?、脂酶的作用下被腸黏膜吸收，在腸黏膜的上皮細(xì)胞內(nèi)合成甘油三酯；HPP 組與ALD 組相比，甘油三酯水平降低最為顯著（p＜0.05），與對照組相比無顯著差異，對肝臟脂質(zhì)蓄積的抑制作用最強(qiáng)，可能是由于HPP中的蝦青素能有效地維持膽固醇的運(yùn)輸途徑，改善血脂代謝紊亂；而PE 組的甘油三酯水平雖較對照組明顯增加，但與ALD 組相比仍有19.7%的降低。

2.7 HPP 穩(wěn)定的Pickering乳液對小鼠肝臟中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量、還原型谷胱甘肽含量和谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

超氧化物歧化酶是酶防御系統(tǒng)中很重要的組成成分，其活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力[22]。丙二醛含量的高低可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。還原型谷胱甘肽可清除O2-、H2O2、LOOH 等自由基，是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，其含量多少是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要因素[23]。谷胱甘肽過氧化物酶可特異性催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應(yīng)，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[24]。因此，對以上指標(biāo)進(jìn)行測定，評價不同處理對酒精引起的肝臟氧化應(yīng)激的緩解作用，結(jié)果如圖7所示。

圖7 各組小鼠肝臟中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶的酶活以及還原型谷胱甘肽、丙二醛含量Fig.7 Activities of superoxide dismutase and glutathione peroxidase and content of reduced glutathione and malondialdehyde in the liver of each group of mice

由圖7 可知，與對照組小鼠相比，ALD 組小鼠肝臟勻漿中的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶的活性和還原型谷胱甘肽含量顯著降低，而丙二醛的含量顯著升高（p＜0.05），表明ALD 組小鼠體內(nèi)的代謝平衡被打破，發(fā)生了嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷。從超氧化物歧化酶活性來看，Oil、HPP 和PE 組均較ALD 組顯著增加，且HPP 組的超氧化物歧化酶水平恢復(fù)程度最佳，較ALD 組顯著升高，這可能是因?yàn)橛晟t球藻蛋白中含有的蝦青素能夠清除氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基；對于丙二醛含量，HPP 與PE 組含量較ALD 組分別降低21.8%和20.8%，而Oil 組小鼠的丙二醛含量與ALD組相比下降并不明顯，說明玉米油干預(yù)的小鼠機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度仍較為嚴(yán)重，緩解損傷的效果并不明顯。對于還原型谷胱甘肽含量，Oil 組不能明顯抑制酒精所導(dǎo)致的還原型谷胱甘肽水平降低，但HPP和PE 組的還原型谷胱甘肽含量明顯比ALD 組高，尤其是PE 組升高44.5%，幾乎恢復(fù)到與對照組相當(dāng)?shù)乃?，改善效果最佳。而對于谷胱甘肽過氧化物酶酶活，Oil 組與PE 組谷胱甘肽過氧化物酶活力較ALD 組升高不顯著，而HPP 組顯著升高。以上結(jié)果表明，雨生紅球藻蛋白穩(wěn)定的Pickering 乳液能在一定程度上抑制酒精代謝所造成的氧化應(yīng)激損傷。

3 結(jié)論

本研究首先通過雨生紅球藻藻粉提取蛋白，隨后利用雨生紅球藻蛋白成功制備了Pickering 乳液，所制備的Pickering 乳液具有較好的穩(wěn)定性和可消化性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過HPP 穩(wěn)定的Pickering 乳液干預(yù)，可使血液中作為肝損傷指標(biāo)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的水平分別降低63.9%和31.8%，且Pickering乳液還具有降低甘油三酯和總膽固醇的作用，可使總膽固醇水平下降37.5%。抗氧化酶和氧化產(chǎn)物的水平測定結(jié)果顯示，HPP 穩(wěn)定的Pickering 乳液可提高小鼠肝臟中超氧化物歧化酶酶活和44.5%的還原型谷胱甘肽含量，能有效抑制酒精代謝所造成的氧化應(yīng)激損傷。此外，小鼠肝臟指數(shù)、肝臟形態(tài)和HE 染色結(jié)果也顯示，Pickering 乳液干預(yù)能夠使肝組織損傷狀況有明顯改善。以上結(jié)果表明，雨生紅球藻蛋白Pickering 乳液可以作為一種預(yù)防和保護(hù)酒精性肝損傷的食源性功能成分，同時也為雨生紅球藻的綜合利用提供了新的思路和可能性。