高娉娉,劉漢清,張鳳,凌新,郭麗瓊*,林俊芳*

1(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,廣東 廣州,510640)2(廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心,廣東 廣州,510640)

益生菌(probiotics)的概念最早是由來(lái)自俄羅斯的諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Elie Metchnikoff提出的,他發(fā)現(xiàn)保加利亞農(nóng)民長(zhǎng)壽的原因是食用了大量的發(fā)酵乳制品,于是提出腸道微生物對(duì)食物具有的依賴性有可能促使我們體內(nèi)有益的微生物取代有害的微生物[1]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織將益生菌定義為足量攝入后對(duì)宿主有益的活性微生物[2]。最常應(yīng)用的益生菌微生物包括乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和酵母菌屬(Saccharomyces)的物種,其他屬的益生菌包括芽孢桿菌(Bacillus)、丙酸桿菌(Propionibacterium)、鏈球菌(Streptococcus)和大腸桿菌(Escherichia)等[3]。益生菌具有抑制胃腸道的致病菌、降低血壓和高血糖水平、改善腸道健康、降低血清膽固醇水平、降解毒素、產(chǎn)生輔助因子和維生素、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)及預(yù)防腫瘤和癌癥等功能[4]。其主要以個(gè)體或菌群的方式向宿主微生物群補(bǔ)充細(xì)菌種類(lèi)、消除致病微生物或改變內(nèi)源性微生物群的組成來(lái)發(fā)揮作用[5]。因此,益生菌被廣泛應(yīng)用于食品和膳食補(bǔ)充劑中。最常用的益生菌被認(rèn)為是安全的,可用作一般健康人群的食品和膳食補(bǔ)充劑的一部分[6]。然而,有研究表明,一些益生菌微生物可能具有潛在的致病因子[7]或在臨床上沒(méi)有顯著效果[8],導(dǎo)致益生菌產(chǎn)品的有效性和安全性不斷受到質(zhì)疑。因此,開(kāi)發(fā)出活性穩(wěn)定、功能優(yōu)良且安全的益生菌產(chǎn)品成為食品行業(yè)的研究熱點(diǎn)。

盡管目前發(fā)現(xiàn)了許多菌株具有益生特性并已被開(kāi)發(fā)為適用于不同宿主的益生菌補(bǔ)充劑,但仍需要繼續(xù)尋找比現(xiàn)有益生菌具有更好促進(jìn)健康特性的新益生菌菌株。傳統(tǒng)的微生物育種方法一般是從自然界、宿主或發(fā)酵食品中分離篩選菌株,其工作量大、育種周期長(zhǎng)且效率低。微生物遺傳育種解決了上述問(wèn)題,它是運(yùn)用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對(duì)特定生產(chǎn)目的菌株進(jìn)行改造,增加其有益新性狀,以獲得遺傳穩(wěn)定、高產(chǎn)、耐受性優(yōu)良和低耗的菌種,從而更好地滿足工業(yè)生產(chǎn)和其他特定需求。為此,本文綜述了原生質(zhì)體融合、基因組重排技術(shù)、常壓室溫等離子體誘變(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)技術(shù)和基因編輯技術(shù)[成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated,CRISPR-Cas)技術(shù)和堿基編輯技術(shù)]等育種方法,并對(duì)這些遺傳育種方法的發(fā)展現(xiàn)狀以及在益生菌中的應(yīng)用展開(kāi)分析總結(jié),同時(shí)討論了遺傳育種的安全性,也對(duì)其未來(lái)研究的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 益生菌的益生功效及生理特性

在益生菌育種過(guò)程中,菌株的益生功效是評(píng)價(jià)育種效果的重要指標(biāo)。幾十年來(lái),隨著人們對(duì)健康和功能食品的需求不斷增加,科學(xué)家和食品藥品行業(yè)人員廣泛地研究了益生菌對(duì)人類(lèi)的影響。目前研究表明,益生菌主要通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、與腸道微生物群的相互作用、生產(chǎn)有機(jī)酸、競(jìng)爭(zhēng)性排斥、改善屏障功能、制造具有系統(tǒng)效應(yīng)的小分子物質(zhì)和酶的產(chǎn)生等發(fā)揮益生作用[4]。乳酸桿菌和發(fā)酵乳桿菌通過(guò)產(chǎn)生抑菌素降低了炎癥性腸病患者的炎性細(xì)胞因子(TNF-α、NF-кBp65、IL-6)的表達(dá),減輕了炎癥性腸病癥狀[9]。鼠李糖乳桿菌能夠降低小鼠卵磷脂引起的食物過(guò)敏特異性IgE、IgG1、IgG2a和IgA的水平,使小鼠過(guò)敏性癥狀得到了緩解[10]。乳酸桿菌、雙歧桿菌、唾液鏈球菌和丙酸桿菌亞種可以在回腸末端產(chǎn)生共軛亞油酸(cojugated linoleic acid, CLA),CLA可以被結(jié)腸細(xì)胞吸收或與結(jié)腸細(xì)胞相互作用抑制癌癥的產(chǎn)生[11]。乳酸桿菌屬的許多成員代謝產(chǎn)生的肽聚糖、細(xì)胞外多糖、表面蛋白和代謝產(chǎn)物(短鏈脂肪酸)以及無(wú)機(jī)多磷酸鹽液體可以通過(guò)腸-肺軸和增強(qiáng)呼吸道局部黏膜免疫力來(lái)改善或治療宿主的呼吸道疾病[12]。干酪乳桿菌可通過(guò)改變單鏈脂肪酸和煙酰胺的代謝,減輕腎損傷和腎衰竭,對(duì)急、慢性腎臟疾病有一定的緩解作用[13]。同時(shí),干酪乳桿菌菌株Shirota對(duì)急性肝損傷具有治療作用,可減輕肝臟和腸道損傷,降低血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、總膽汁酸、IL-5、IL-10、G-CSF和RANTES的升高,還可減輕肝臟中視黃醇代謝和過(guò)氧化物酶體增殖激活受體(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下調(diào)以及丙酮酸代謝途徑的上調(diào)[14]。此外,益生菌在皮膚護(hù)理中的作用也引起了廣泛的關(guān)注,例如用乳酸菌發(fā)酵紅參會(huì)增加紅參中抗氧化活性物質(zhì)的含量(如尿酸、多酚和黃酮類(lèi)化合物),對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用也得到改善,其毒性也得到降低[15]。表1總結(jié)了不同益生菌的益生功效及作用機(jī)制。然而,現(xiàn)有的關(guān)于有益特性的機(jī)制仍有許多是未知的,且已知的機(jī)制也未能全部在人類(lèi)身上得到證實(shí)。因此,識(shí)別和建立某些負(fù)責(zé)特定健康益處的精確機(jī)制仍然是目前的研究熱點(diǎn)。

表1 不同益生菌的益生功效及益生機(jī)制Table 1 Probiotic efficacy and mechanism of different probiotics

此外,在益生菌選育過(guò)程中,菌株生理特性的優(yōu)化同樣尤為重要,并且往往與代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提升相得益彰。進(jìn)行益生菌生理特性篩選時(shí)一般考慮菌株對(duì)機(jī)體內(nèi)胃酸、膽鹽和消化液的耐受性,這是益生菌存活的基礎(chǔ)。其次,菌株的定植和黏附能力決定了其益生作用的發(fā)揮。以提高乳酸菌在宿主腸道中的黏附力為例,植物桿菌HE-1產(chǎn)生的AI-2信號(hào)分子可以增強(qiáng)生物膜的形成,并最終增加對(duì)腸道上皮細(xì)胞的潛在黏附性[19]。luxS基因的表達(dá)水平可以影響乳酸菌的細(xì)菌素合成、耐受性和黏附特性,luxS基因的表達(dá)水平與特性效應(yīng)呈正相關(guān)關(guān)系。到目前為止,luxS基因介導(dǎo)的乳酸菌研究?jī)?nèi)容主要包括細(xì)菌素特性、抗逆性和黏附能力3個(gè)方面,未來(lái)可以以此進(jìn)行菌種選育。

2 益生菌育種技術(shù)

2.1 原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合技術(shù)是通過(guò)組合來(lái)自不同菌株或物種的有益等位基因來(lái)產(chǎn)生具有優(yōu)良表型的微生物[20]。具有克服遠(yuǎn)緣雜交、提升優(yōu)良性狀、操作簡(jiǎn)單和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[21]。原生質(zhì)體融合技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母菌、乳桿菌類(lèi)、雙歧桿菌類(lèi)、芽孢桿菌類(lèi)和鏈球菌類(lèi)中。當(dāng)所選用的菌株的基因組未被表征時(shí),很難利用基因工程手段提高其益生性能和生理特性。而原生質(zhì)體融合技術(shù)能使遺傳基因高頻率重組,達(dá)到高效育種的目的。比如德氏乳桿菌突變體和解淀粉芽孢桿菌通過(guò)融合將淀粉轉(zhuǎn)化率增加到了96%[22];提高了嗜酸乳桿菌耐酸和耐膽鹽能力[23];雙歧桿菌和釀酒酵母融合得到了既具有雙歧桿菌的特異性序列又具有親本菌的生物學(xué)特性的菌株[24]。同時(shí),嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌的融合為產(chǎn)芽孢乳酸菌的育種和改良提供新的思路,篩選得到了既能形成芽孢又可產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶的乳酸菌[25]。此外,近期也有利用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌重組動(dòng)力學(xué)的研究,在將不同遺傳距離的芽孢桿菌菌株進(jìn)行雜交后,發(fā)現(xiàn)物種水平的遺傳距離不影響全基因組重組[20],這將有助于更好地理解自然系統(tǒng)中的細(xì)菌進(jìn)化,為改善細(xì)胞功能提供潛在的見(jiàn)解。

原生質(zhì)體融合是一種簡(jiǎn)單、高效的遺傳育種技術(shù),但也存在融合效率不高的問(wèn)題。同時(shí),在進(jìn)行遠(yuǎn)源物種間的原生質(zhì)體融合時(shí),可能會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的不親和性和排斥性,導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法融合[26]。因此,尋找高效的原生質(zhì)體融合方法具有重要意義。

2.2 基因組重排

基因組重排是經(jīng)過(guò)多輪遞推的原生質(zhì)體融合技術(shù),主要基于原生質(zhì)體融合。它允許多個(gè)親本之間的重組,可獲得具有多種有益突變的菌株[27]。此外,基因組重排可以突破種甚至屬的限制,加速重要微生物的定向進(jìn)化,且不需要全面遺傳背景或代謝網(wǎng)絡(luò)信息[22,28]。最重要的是,基于原生質(zhì)體融合的自然同源重組,基因組重排獲得的融合體不被視為“轉(zhuǎn)基因”,克服了轉(zhuǎn)基因生物應(yīng)用的巨大障礙[27,29]。作為一種實(shí)用高效的育種技術(shù),其在微生物菌種改良及代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)和產(chǎn)業(yè)化等研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[30]。

基因組重排的效率取決于原生質(zhì)體的產(chǎn)生和融合效率、融合后原生質(zhì)體的回收效率、融合后獲得的二倍體或多倍體細(xì)胞中異質(zhì)染色體之間的重組效率以及僅含一個(gè)基因組的真正目標(biāo)生物的最終分離效率[31]。通過(guò)基因組重排技術(shù)進(jìn)行菌種選育的關(guān)鍵是:構(gòu)建具有基因和表型多樣性的親本文庫(kù)、原生質(zhì)體的高效制備、原生質(zhì)體的理性融合和基因組重排突變菌的高效篩選和驗(yàn)證(圖1)[30,32]。基因組重排已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種乳酸菌的遺傳育種中。基因組重排有效地規(guī)避了微生物基因工程改造所有的必需條件,對(duì)許多特殊種類(lèi)或無(wú)法進(jìn)行遺傳操作的益生菌而言,仍是最有效的菌種選育方法。比如增強(qiáng)鼠李糖乳桿菌ATCC11443的耐酸性和乳酸產(chǎn)量[33]及植物乳桿菌C88的黏附性[34],提高乳酸片球菌對(duì)腸道沙門(mén)氏菌的抗菌活性[35],增加解淀粉芽孢桿菌ES-2-4的抗菌肽芬薺素產(chǎn)量[36],在乳酸乳球菌YF11中提高乳酸鏈球菌素的產(chǎn)量[37]。此外,目前鮮有在雙歧桿菌屬中應(yīng)用基因組重排技術(shù)的報(bào)道。未來(lái)可在雙歧桿菌屬中嘗試使用基因組重排技術(shù)進(jìn)行遺傳育種?；蚪M重排主要通過(guò)基因轉(zhuǎn)換引起基因組保守區(qū)域的單點(diǎn)突變和基因重復(fù)[28]。有研究表明,菌株通過(guò)基因組重排增強(qiáng)的耐受性主要是由于細(xì)胞倍性調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)基因表達(dá)水平的變化[38]。如在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶基因UBP7的逆向突變有效地提高了菌株對(duì)亞硫酸鹽廢液的耐受性,RNA-seq分析確定其與應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄抑制因子(neuregulin 1, Nrg1p)以及依賴NADPH的谷氨酸脫氫酶(glutamate derydrogenase 1, Gdh1p)有關(guān)[39]。另外,基因組重排所導(dǎo)致的益生菌有益性能提升不僅受到其代謝網(wǎng)絡(luò)全局變化的調(diào)控,還涉及到許多關(guān)鍵生物過(guò)程和應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程的交叉影響[30]。如釀酒酵母中谷胱甘肽的產(chǎn)量的提升涉及到mRNA轉(zhuǎn)錄和合成酶GSH-I的過(guò)表達(dá),以及蛋白質(zhì)合成、DNA合成和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)[40]。

圖1 基因組重排的技術(shù)流程概括[30,32]Fig.1 The general process of genome shuffling[30,32]

基因組重排技術(shù)的難點(diǎn)是如何實(shí)現(xiàn)融合子的高通量篩選,尤其是在融合子重組片段是隨機(jī)組合的情況下。目前也有研究報(bào)道了一些操作簡(jiǎn)單、高效的高通量篩選方法,但無(wú)法廣泛應(yīng)用。因此,建立高通量篩選方法仍是今后益生菌育種工作中的研究熱點(diǎn)。此外,隨著組學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展,學(xué)者可以聯(lián)合運(yùn)用多種組學(xué)技術(shù),對(duì)基因組重排突變菌及其親本進(jìn)行全面分析來(lái)揭示其不同表型的遺傳基因和物質(zhì)基礎(chǔ)之間的相互作用關(guān)系,同時(shí)選擇合適的生物信息學(xué)工具將多組學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果聯(lián)系起來(lái)評(píng)估菌株性能[30]。

2.3 常壓室溫等離子體誘變

近年來(lái)興起的ARTP技術(shù)是基于等離子體的帶電粒子、自由基、激發(fā)態(tài)中性物質(zhì)、高電場(chǎng)、紫外輻射等多種誘變劑對(duì)微生物進(jìn)行誘變的一種新型高效的育種技術(shù)[41]。ARTP技術(shù)具有高效的誘變性能、適用范圍廣、操作條件溫和、遺傳物質(zhì)損傷機(jī)制多樣和安全性高等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于微生物育種中[42]。

用于微生物誘變的兩種典型等離子體分別為大氣介質(zhì)阻擋放電(dielectric barrier discharge, DBD)等離子體和大氣壓射頻輝光放電(radio frequency atmospheric pressure glow discharge, RF APGD)等離子體。RF APGD等離子體射流可以被用來(lái)改變生物體的基因序列,這意味著溫和而均勻的RF APGD等離子體技術(shù)是一種有前途的新型微生物突變工具[43]。WANG等[44]首次報(bào)道了利用ARTP技術(shù)誘變阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)以產(chǎn)生具有高產(chǎn)阿維菌素B1a的突變體的成功范例。隨后,這種ARTP方法引起了科研人員和企業(yè)的廣泛關(guān)注,加速了ARTP技術(shù)在益生菌育種中的應(yīng)用,如表2所示。ARTP將蠟樣芽孢桿菌的殼聚糖酶活性提高到原菌的2.49倍[45];在羅伊氏乳桿菌中對(duì)大腸桿菌的抑菌率提高了10.64%,對(duì)沙門(mén)氏菌抑菌率提高了9.42%,對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌率提高了9.20%[49];增加了嗜酸乳桿菌的耐酸性[51]。ARTP能夠通過(guò)增加胞外多糖水平和細(xì)胞膜內(nèi)K+濃度提高細(xì)菌的耐受性[52],且能夠通過(guò)改變微生物的整體代謝[53]和細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)量[54]來(lái)提高細(xì)菌的有益性能。如乳酸乳球菌主要涉及到嘌呤代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)代謝通路,可通過(guò)群體感應(yīng)機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)菌素的產(chǎn)生,提升其抑菌活性[55]。大腸桿菌經(jīng)ARTP后在葡萄糖特異性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、丙酮酸鹽裂解酶系統(tǒng)和發(fā)酵乳酸脫氫酶系統(tǒng)中發(fā)生突變,減少了副產(chǎn)物的形成并增加了琥珀酸和ATP的產(chǎn)量[54]。目前,ARTP技術(shù)的應(yīng)用在乳酸菌屬中的報(bào)道較多,而在雙歧桿菌屬的報(bào)道鮮少。在今后的工作中,可將等離子體物理學(xué)與基因組學(xué)及其他組學(xué)分析相結(jié)合在益生菌育種中開(kāi)展科學(xué)研究。

表2 使用ARTP誘變的益生菌突變案例列表Table 2 List of the probiotics mutation cases using the ARTP

到目前為止,還沒(méi)有能夠定量描述常壓室溫的等離子體作用劑量的有用變量。因此,評(píng)估和比較由不同方法產(chǎn)生的不同等離子體的作用強(qiáng)度,用于處理具有不同作用模式的生物材料,仍然非常困難。

2.4 基因編輯技術(shù)

近年來(lái),基因組測(cè)序的價(jià)格越來(lái)越低,一些編輯和修改微生物基因組的工具也越來(lái)越強(qiáng)大,使我們能夠按照自己的想法來(lái)設(shè)計(jì)益生菌,從而開(kāi)發(fā)出個(gè)性化的益生菌[56]。

近幾十年在細(xì)菌中應(yīng)用的CRISPR-Cas技術(shù)預(yù)示益生菌菌株開(kāi)發(fā)的有利機(jī)會(huì)。目前展示的優(yōu)勢(shì)是可以對(duì)頑固菌株進(jìn)行工程化處理、極其有效的反選擇系統(tǒng)、用于基因調(diào)控、減少基因組操作時(shí)間以及可以進(jìn)行多重基因組編輯和調(diào)控[57]。CRISPR-Cas系統(tǒng)一般按CRISPR相鄰的Cas蛋白基因分類(lèi)。目前報(bào)道的CRISPR-Cas系統(tǒng)主要分為兩大類(lèi)、6種類(lèi)型和33種亞型[58]。兩類(lèi)Cas蛋白家族中的核酸酶Cas9和Cas12a(Cpf1)應(yīng)用較為廣泛,易于編輯識(shí)別特定的DNA序列[59]。其中,Ⅱ型CRISPR-Cas9系統(tǒng)是目前比較常用的基因組編輯蛋白[60]。通過(guò)人工設(shè)計(jì),crRNA和tracrRNA可以轉(zhuǎn)化為小向?qū)NA,引導(dǎo)Cas9進(jìn)行定點(diǎn)的DNA切割、基因敲除和插入[61]。CRISPR技術(shù)已經(jīng)在大腸桿菌、葡萄球菌、乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌上實(shí)施[62](表3)。BERLEC等[63]開(kāi)發(fā)了一個(gè)單質(zhì)粒誘導(dǎo)型CRISPR-Cas9系統(tǒng)(pNZCRISPR),使CRISPR干擾介導(dǎo)的UPP基因沉默,用于乳酸菌的高級(jí)遺傳改造。ZHOU等[66]使用CRISPR-Cas9輔助的雙鏈DNA和單鏈DNA重組技術(shù),在植物乳桿菌中進(jìn)行了無(wú)縫基因組編輯,使植物乳桿菌WCFS1在不引入外源基因或質(zhì)粒的情況下,通過(guò)增強(qiáng)GlcNAc途徑產(chǎn)生了797.3 mg/L N-乙酰氨基葡萄糖。PAN等[72]利用內(nèi)源性I-G型CRISPR-Cas系統(tǒng),并采用外源性CRISPR堿基編輯技術(shù)用于雙歧桿菌的基因組工程,通過(guò)在tetW中產(chǎn)生一個(gè)500 bp的缺失,消除了雙歧桿菌的四環(huán)素抗性。CRISPR技術(shù)不僅可用于功能缺失的研究,如CRISPR敲除(CRISPRKO)和CRISPR干擾或抑制(CRISPRi),還可用于功能增益的篩選研究,如CRISPR激活(CRISPRa)[62,73]。基因編輯技術(shù)特別是CRISPR的發(fā)展為下一代益生菌的出現(xiàn)提供了必要的支持。

表3 CRISPR技術(shù)在益生菌中的應(yīng)用Table 3 Application of CRISPR technology in probiotics

此外,基于CRISPR-Cas9技術(shù)發(fā)展而來(lái)的堿基編輯技術(shù)具有高效、安全、副產(chǎn)物少等顯著優(yōu)勢(shì),但是存在編輯窗口大小和精確度有限、脫靶效應(yīng)和細(xì)胞毒性等問(wèn)題[74]。堿基編輯技術(shù)主要分為基礎(chǔ)編輯(base editors,BEs)和主要編輯(rime editors,PEs)2種。BEs是一種在單堿基分辨率下精確修改活細(xì)胞的基因組(DNA)或轉(zhuǎn)錄組(RNA)的新技術(shù)。堿基編輯是由催化受損的Cas核酸酶組成,該核酸酶與核苷酸脫氨酶融合,有時(shí)還與DNA修復(fù)蛋白融合。目前可用的DNA堿基編輯可以進(jìn)一步分類(lèi)為胞嘧啶BEs(CBEs)和腺嘌呤BEs(ABEs)[75]。CBEs和ABEs可以分別實(shí)現(xiàn)C到T(互補(bǔ)鏈中的G到A)和A到G(互補(bǔ)鏈中的T到C)突變?？偟膩?lái)說(shuō),CBEs和ABEs使我們能夠?qū)崿F(xiàn)12個(gè)可能的堿基取代中的4個(gè),并且只催化堿基轉(zhuǎn)換(嘧啶到嘧啶,嘌呤到嘌呤)。盡管BEs在引入高效的點(diǎn)突變方面很強(qiáng)大,但它們不能產(chǎn)生精確的插入缺失,也很難避免在其他方面的突變。相比之下,PEs可以引入所有12種可能的轉(zhuǎn)換或過(guò)渡性轉(zhuǎn)換突變和小缺失,以及它們的組合,并有利于對(duì)插入缺失比率進(jìn)行預(yù)期編輯[76]。PEs是多功能、精確的基因組編輯工具,使用與工程逆轉(zhuǎn)錄酶融合的Cas9切口酶能夠直接將新的遺傳信息寫(xiě)入指定的DNA靶位點(diǎn)[76]。堿基編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物育種、家畜育種和人類(lèi)疾病治療等方面,但是在益生菌育種中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。隨著堿基編輯技術(shù)的不斷優(yōu)化,其編輯精確度和安全性正逐漸提高,有望廣泛應(yīng)用于益生菌基因編輯育種中。

通過(guò)基因編輯能夠?qū)F(xiàn)有的益生菌修改成所需的新益生菌,這種工程改造使我們能夠直接驗(yàn)證這些新型微生物的遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)和功能作用是否已經(jīng)發(fā)生了預(yù)期的變化?；蚓庉嫾夹g(shù)的進(jìn)步為益生菌的基因編輯提供了新的可能性。然而,工程益生菌的應(yīng)用仍然面臨著一系列的挑戰(zhàn)。例如,許多微生物可操作的遺傳工具很少,這導(dǎo)致益生菌的改造僅限于少數(shù)菌株。盡管工程益生菌的研究和應(yīng)用存在這些局限性,但我們不能忽視它們?cè)诟纳迫祟?lèi)健康方面的潛在作用。此外,工程益生菌可能成為治療癌癥、炎癥、感染和其他一些疾病的新方法。

3 益生菌遺傳育種安全性

雖然益生菌的使用已經(jīng)在普通大眾中得到了普及,但是隨著研究的不斷深入,益生菌產(chǎn)品的安全性不斷受到質(zhì)疑。因此,需要對(duì)使用遺傳育種的方法選育得到的益生菌菌株的安全性做出客觀且全面的評(píng)估。為保證選育的益生菌菌種安全,首先需要在分類(lèi)學(xué)上對(duì)益生菌菌株進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定,其次需要確定菌種的功能特性(如安全性、抗逆性、定植性、穩(wěn)定性、有效性等)[77]。針對(duì)益生菌的不同特性,糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織提出了多種益生菌菌株安全性評(píng)價(jià)方法,如抗生素抗性、溶血性測(cè)定、產(chǎn)毒能力測(cè)定和毒力因子測(cè)定等[77]。迄今為止還沒(méi)有在乳酸菌[78]或雙歧桿菌[79]中發(fā)現(xiàn)含有與致病菌相似的毒性因子。此外,由于乳酸菌安全使用的歷史悠久,被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局和歐洲食品安全局分別列為公認(rèn)安全和安全合理推定[80]。因此,給予一些乳酸菌物種一般是安全的。

原生質(zhì)體融合和基因組重排技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)跨物種融合,一些含有抗生素抗性基因的菌株可能會(huì)將該基因轉(zhuǎn)移至所選育的菌株中,可能會(huì)引發(fā)菌血癥[81];此外,一些毒力基因可能會(huì)保留在所選育的菌株中,導(dǎo)致益生菌的安全性問(wèn)題。如一些乳桿菌能夠同時(shí)產(chǎn)生L-乳酸和D-乳酸,而D-乳酸的大量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致特定高危人群(如兒童)發(fā)生短腸綜合癥[82],因此將能夠產(chǎn)生D-乳酸的益生菌用于嬰幼兒配方奶粉中時(shí),其安全性需引起人們的重視。安全應(yīng)用益生菌微生物的主要風(fēng)險(xiǎn)因素是對(duì)其活性缺乏了解。充分了解益生菌的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系將減少選育所帶來(lái)的副作用[80]。常壓室溫等離子體誘變屬于物理誘變,具有很高的安全性。值得注意的是,基因編輯技術(shù)篩選得到的菌株屬于轉(zhuǎn)基因生物范疇,它的應(yīng)用在大多數(shù)國(guó)家受到嚴(yán)格地管制。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局已有轉(zhuǎn)基因益生菌被批準(zhǔn)用于食品和藥物,如布拉迪酵母、動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12、短雙歧桿菌M-16V等;澳新食品標(biāo)準(zhǔn)局批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因大腸桿菌K-12生產(chǎn)的2′-FL可用于嬰兒配方食品。而歐盟目前限制使用經(jīng)外源基因改造的益生菌;我國(guó)也尚未有批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因益生菌用于食品和藥物的相關(guān)文件。以益生菌為基礎(chǔ)的食品、保健品和藥品尚無(wú)明確區(qū)分標(biāo)準(zhǔn),不同國(guó)家之間也存在較大差異。因此,監(jiān)管、立法和技術(shù)方面的復(fù)雜性成為市場(chǎng)增長(zhǎng)的主要障礙[83]。另外,轉(zhuǎn)基因益生菌經(jīng)過(guò)滅活處理也能發(fā)揮作用[84-85],經(jīng)過(guò)滅活處理的轉(zhuǎn)基因益生菌不屬于轉(zhuǎn)基因食品,也就不受到國(guó)家法規(guī)的約束,并且容易使公眾接受。腸道微生物和宿主之間的相互作用對(duì)宿主整體健康狀況有重大影響。因此,在人類(lèi)使用益生菌之前,應(yīng)該充分了解益生菌的活動(dòng)機(jī)制,還應(yīng)該考慮到單一菌株或不同物種甚至屬的混合菌株的活性差異[86]。

4 總結(jié)與展望

隨著人們對(duì)健康和功能食品的需求不斷增加,益生菌的益生特性將促使其市場(chǎng)價(jià)值持續(xù)增加。很顯然,單一的育種方法已經(jīng)很難滿足益生菌的高效選育,未來(lái)應(yīng)更多的聯(lián)合使用多種不同育種方法或開(kāi)發(fā)新型高效的育種方法來(lái)增加益生菌的突變效率。此外,遺傳育種獲得的菌株可能會(huì)存在潛在的安全性問(wèn)題。盡管通常銷(xiāo)售的益生菌具有良好的安全記錄,但對(duì)于用于高危人群的益生菌可能存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)[87]。由于益生菌是活的微生物,因此可能需要開(kāi)發(fā)特殊的方法來(lái)驗(yàn)證產(chǎn)品安全性。

遺傳育種的方法主要集中在已知的基因和已知的突變上,這些方法錯(cuò)過(guò)了發(fā)展優(yōu)良生產(chǎn)特性所涉及的許多未知因素,如宿主的功能或引入的基因的相互作用。因此,它們也需要與一系列其他技術(shù)相結(jié)合來(lái)對(duì)菌株進(jìn)行選育,如下一代測(cè)序、生物信息學(xué)和高通量表型等。此外,需要通過(guò)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和通量組學(xué)快速分析尚未完全了解其特性的菌株,以便對(duì)菌株進(jìn)行全面的功能表征,并對(duì)代謝和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提出新見(jiàn)解。