宋光明,鄧玲,趙祎,曾云軍,劉杰,鐘耕,5*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)2(重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,重慶,401334) 3(重慶市生物技術(shù)研究所有限責(zé)任公司,重慶,401121)4(重慶市糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站,重慶,400040) 5(川渝共建特色食品重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶,400716)

羊肚菌(Morchella)屬子囊菌門羊肚菌科羊肚菌屬,其表面由不規(guī)則網(wǎng)格交叉形成蜂巢狀,整體酷似羊肚而得名[1]。羊肚菌在我國(guó)分布廣泛,近年來,由于人工栽培的成功,關(guān)于羊肚菌的研究越來越多。研究表明,羊肚菌富含礦物質(zhì)、維生素和一些必需的生物大分子,如多糖、蛋白質(zhì)等,具有顯著的藥用和生物學(xué)特性[2]。羊肚菌多糖(Morchellapolysaccharide, MEP)是子實(shí)體中含量最豐富的成分之一,也是主要活性物質(zhì),PAN等[3]發(fā)現(xiàn)羊肚菌多糖羊肚菌多糖(Morchellaimportunapolysaccharide, MIP)可以通過調(diào)節(jié)糖尿病小鼠腸道微生物豐度來改善糖尿病引起的腸道疾病,并且MIP干預(yù)后小鼠肝臟代謝物紊亂也得到改善;ZHANG等[4]發(fā)現(xiàn)羊肚菌多糖羊肚菌子實(shí)體多糖可作為免疫調(diào)節(jié)劑通過刺激巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng),減輕氯霉素誘導(dǎo)的斑馬魚免疫損傷;此外羊肚菌多糖還具有抗腫瘤、抗衰老等生物活性[5],因此羊肚菌多糖作為天然生物活性物質(zhì)在生物醫(yī)藥、食品和保健品等領(lǐng)域具有較好的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

多糖的活性受其化學(xué)組成和空間構(gòu)象影響,多糖結(jié)構(gòu)和成分又因提取方法而異[6],因此高效提取羊肚菌多糖并維持生物活性,是充分利用羊肚菌多糖的重要前提。熱水提取是羊肚菌多糖提取最常用的方法,但是該方法提取時(shí)間長(zhǎng)、提取得率較低,通常輔以酸、堿或超聲等物理化學(xué)方法。據(jù)趙炳杰等[7]報(bào)道,羊肚菌中含有較多蛋白結(jié)合多糖,通常采用堿法破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)后與糖蛋白作用,使胞內(nèi)不溶性多糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄远嗵翘岣叩寐?但是堿濃度需嚴(yán)格控制,濃度過低達(dá)不到提取效果,過高會(huì)導(dǎo)致多糖分子降解、活性降低[8]并且產(chǎn)生廢水污染環(huán)境。

電解飽和電解質(zhì)生產(chǎn)的電解水,可以分為酸性電解水和堿性電解水,其中堿性電解水(alkaline electrolyzed water, AEW)是具有堿性特質(zhì)、強(qiáng)滲透性的小分子水,可以破壞細(xì)胞膜并滲入,用于活性成分的提取,并且具有一定的負(fù)氧化還原電位(oxidation-reduction potential, ORP),作為溶劑在提取過程中可以保護(hù)活性基團(tuán)[9]。提取后堿性電解水無需特殊處理,其活性成分可自然狀態(tài)下與光、活性氧等接觸逐漸分解,還原為普通水,對(duì)環(huán)境友好[10]。SOQUETTA等[11]用堿性電解水從柑桔皮中提取生物活性化合物,與純水相比多酚得率提高15.7%,黃酮得率提高21.6%,并可縮短提取時(shí)間;苗雨欣等[12]用堿性電解水替代同pH值堿水提取靈芝多糖,得率提高74.72%;LI等[13]用堿性電解水提杏蛋白,提取率提高了10.4%,且堿性電解水所提蛋白比堿水得蛋白表現(xiàn)出較好的起泡能力和乳液穩(wěn)定性。

現(xiàn)有的研究多集中在如何利用電解水提高提取成分的提取率,對(duì)其影響提取成分的理化性質(zhì)的研究很少,關(guān)于堿性電解水提取羊肚菌多糖的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以羊肚菌粉為原料,以堿性電解水為溶劑,提取羊肚菌子實(shí)體多糖,并以堿水和純水提取的多糖為對(duì)照,比較其結(jié)構(gòu)和抗氧化活性方面差異,以期為羊肚菌多糖高效綠色提取和應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肚菌,重慶市城口縣松坤菌草有限責(zé)任公司;葡萄糖、D-半乳糖醛酸等均為標(biāo)準(zhǔn)品,北京Solarbio試劑公司;木瓜蛋白酶、DPPH、ABTS、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolinone, PMP),天津市北辰區(qū)索羅門生物試劑銷售中心;其他試劑為分析純,重慶興光化玻公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CJ120超微粉碎機(jī),河南瀚華科技有限公司;Agilent 1260高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫公司;X射線衍射儀,遼寧通達(dá)科技有限公司;ALPH2-1/LD冷凍干燥機(jī),珀金埃爾默公司;XK-A7電解水生成器,廣東新康公司;UV-759紫外分光光度計(jì),成都析譜儀器有限公司;Spectrum100紅外光譜儀,珀金埃爾默公司;pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 堿性電解水的制備

堿性電解水由多功能電解水制備器制備。電解槽陽(yáng)極加入飽和KCl溶液,陰極接入純水,施加20 V電壓,電解一定時(shí)間測(cè)定得到pH值12的堿性電解水。

1.3.2 羊肚菌粗多糖的提取方法

將羊肚菌子實(shí)體烘干至恒重,經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎過250目篩,得到均勻的粉末樣品。

1.3.2.1 純水提取法

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將樣品(5.0 g)用純水在指定的料液比(1∶30,g∶mL)、提取溫度(80 ℃)、提取時(shí)間(1 h)提取。提取液5 500 r/min離心12 min,上清液4倍體積無水乙醇4 ℃沉淀8 h,收集沉淀,冷凍干燥得到粗多糖。置于干燥、避光處保存。將純水提多糖命名為WE-MEP。

1.3.2.2 堿水提取法

將1.3.2.1節(jié)中純水替換為pH值12的KOH溶液,其余步驟相同。將堿水提多糖命名為AW-MEP。

1.3.2.3 堿性電解水提取法

將1.3.2.1節(jié)中純水替換為pH值12的堿性電解水,其余步驟相同。將堿性電解水提多糖命名為AEW-MEP。

1.3.3 多糖分離及初步純化

分離及純化參考ZHU等[14]的方法略作修改,采用酶法除蛋白,分別將多糖溶解配制成溶液,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%木瓜蛋白酶(200 U/mg),55 ℃酶解35 min,滅酶、冷卻,加入體積分?jǐn)?shù)為8%的H2O2溶液脫色,4 500 r/min離心13 min,除去沉淀。上清液用4倍體積無水乙醇4 ℃沉淀8 h,收集沉淀冷凍干燥,得到3種方法提取的初步純化羊肚菌多糖。

1.3.4 純度鑒定和分子質(zhì)量測(cè)定

凝膠滲透色譜法測(cè)定多糖分子質(zhì)量分布和純度,配制樣品液(2 mg/mL)過0.45 μm微孔濾膜進(jìn)入系統(tǒng)。

使用Sepax SRT SEC-100(7.8 mm×300 mm)凝膠柱;流速1 mL/min,柱溫40 ℃;通過一系列不同分子質(zhì)量(708、344、107、47、5 908 Da)標(biāo)準(zhǔn)聚鈉鹽(苯乙烯磺酸鈉)校準(zhǔn),根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算待測(cè)多糖的分子質(zhì)量。

1.3.5 純化多糖理化性質(zhì)分析

1.3.5.1 純化多糖中總糖含量及提取率測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量,取10 mg純化多糖溶于10 mL純水配成溶液,取出1 mL加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的苯酚、5 mL濃硫酸反應(yīng)25 min,測(cè)定490 nm處吸光值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品多糖質(zhì)量,提取率的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:m,測(cè)得多糖質(zhì)量,g;c,稀釋倍數(shù);M,樣品質(zhì)量,g。

將上述溶液稀釋一定體積后,按同樣方法測(cè)定總糖含量,總糖含量的計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:n,測(cè)得多糖質(zhì)量,g;0.9,多糖校正系數(shù);N,所取羊肚菌多糖質(zhì)量,g。

1.3.5.2 蛋白含量測(cè)定

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量,參考ZHANG等[15]的方法略作修改,從1 mg/mL純化多糖溶液取1 mL上清液與5 mL考馬斯亮藍(lán)混合,反應(yīng)7 min測(cè)定595 nm處吸光值。以牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。

1.3.5.3 糖醛酸含量測(cè)定

參考HUO等[16]的方法略作修改,從1 mg/mL純化多糖溶液取0.25 mL,加1.5 mL四硼酸鈉-濃硫酸溶液,沸水浴6 min,降至室溫加入3-苯基酚溶液25 μL,室溫反應(yīng)15 min,測(cè)定520 nm處吸光值。以半乳糖醛酸溶液(0.1 mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算糖醛酸含量。

1.3.6 單糖組成測(cè)定

單糖組成參考LI等[17]的方法略作修改,取10 mg純化多糖三氟乙酸水解2 h,取1 mL水解液加入1 mL甲醇搖勻,70 ℃水浴同時(shí)N2吹干;分別取0.5 mL樣品水解液與單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液混合,加入0.5 mL的PMP-甲醇溶液混勻,70 ℃反應(yīng)2 h,調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.05,過0.22 μm水系膜進(jìn)液相系統(tǒng)分析。

使用Agilent EC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),進(jìn)樣量8 μL,流速0.8 mL/min,流動(dòng)相A為25 mmol/L乙酸銨緩沖液,流動(dòng)相B為乙腈,二者比例為80∶20。

1.3.7 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)檢測(cè)

將干燥預(yù)處理的羊肚菌多糖樣品3 mg置于壓片模具中,在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)以空氣為背景進(jìn)行掃描。

1.3.8 X-射線衍射檢測(cè)

將干燥的羊肚菌多糖樣品均勻置于X射線衍射儀樣品池,測(cè)試條件為:X射線的波長(zhǎng)λ=0.154 nm;管壓40 kV;掃描范圍(2θ)10～65 °,掃描速度5 °/min。

1.3.9 體外抗氧化活性測(cè)定

參考LI等[18]的方法略作修改,以抗壞血酸為標(biāo)品,測(cè)定不同溶劑所得羊肚菌多糖對(duì)DPPH自由基清除能力、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力及Fe3+還原力。

1.3.9.1 DPPH清除率測(cè)定

準(zhǔn)確稱取DPPH用無水乙醇配制成濃度為0.2 mmol/L的溶液。配制不同質(zhì)量濃度(2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL)的多糖樣品溶液與等體積DPPH混合,純水、乙醇做空白對(duì)照,搖勻后避光反應(yīng)25 min,測(cè)吸光值,清除率的計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

式中:A0,純水組吸光度;A1,乙醇組吸光度;A2,樣品吸光度。

1.3.9.2 Fe3+還原力測(cè)定

分別取0.50 mL不同質(zhì)量濃度(2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL)的樣品,與等體積磷酸緩沖液(pH=6.6)、10 g/L鐵氰化鉀混合,50 ℃水浴25 min,冷卻至室溫,再加入1.00 mL 100 g/L三氯乙酸,混勻取1 mL上清液加入0.25 mL 1 g/L氯化鐵溶液,避光反應(yīng)30 min,于700 nm測(cè)吸光度值。通過比較樣品和維生素C的吸光度,判斷多糖的還原能力。

1.3.9.3 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定

配制ABTS溶液(7 mmol/L)和過硫酸鉀溶液(2.45 mmol/L)等體積混合,4 ℃過夜放置,用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液調(diào)整其734 nm處吸光度為0.70±0.02。分別取1 mL不同質(zhì)量濃度(2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL)的多糖樣品加入3 mL ABTS工作液,混合均勻,避光放置5 min,在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度,清除率的計(jì)算如公式(4)所示:

(4)

式中:A0為純水組吸光度;A1為磷酸鹽緩沖液組吸光度;A2為樣品吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,使用SPSS 25通過Tukey檢驗(yàn)分析結(jié)果,差異顯著性為P<0.05。采用OriginPro 2018軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取對(duì)羊肚菌多糖提取率的影響

分別采用純水提取、堿水提取、堿性電解水提取從羊肚菌中分離多糖,提取率如表1所示。堿性電解水提取法提取率為(7.12±0.33)%,顯著高于堿水法和純水法提取率[(6.65±0.27)%,(5.46±0.15)%,P<0.05]。這是因?yàn)閴A性條件可以加速細(xì)胞壁破裂,釋放胞內(nèi)多糖,羊肚菌含有較多糖蛋白,堿性條件使糖蛋白更好地轉(zhuǎn)化為可溶性多糖[7],因此AW-MEP與AEW-MEP有更高的提取率。但是與傳統(tǒng)堿水不同,堿性電解水是通過外加電場(chǎng),破壞水分子氫鍵,形成由較少水分子組成的小水分子團(tuán)簇,不會(huì)引入雜質(zhì),且含有較多OH-[19],作為溶劑不僅可以提供堿性環(huán)境而且較堿水制備簡(jiǎn)單、綠色安全。

表1 多糖提取率及主要化學(xué)組成Table 1 Main compositions and yields of polysaccharide fractions

2.2 不同溶劑提取對(duì)羊肚菌多糖化學(xué)成分組成的影響

3種方法所得羊肚菌多糖中主要化學(xué)成分如表1所示,AEW-MEP中糖醛酸含量[(5.59±0.09)%]顯著高于WE-MEP和AW-MEP的糖醛酸含量[(3.92±0.17)%,(2.83±0.13)%,P<0.05];WE-MEP蛋白含量為(0.98±0.02)%,顯著低于其余2種方法,說明堿性條件下更多蛋白類物質(zhì)被溶出;AEW-MEP總糖含量(75.11±1.14)%,顯著高于WE-MEP[(67.91±1.05)%]、AW-MEP[(71.01±2.62)%]。堿水在提取過程中會(huì)破壞鏈結(jié)構(gòu),斷裂形成的小分子糖需高濃度醇沉析出,因此AW-MEP總糖含量、提取率低于AEW-MEP。

LI等[20]采用亞臨界水、純水2種方法提取羊肚菌多糖,亞臨界水溶解能力更強(qiáng),獲得更高的糖醛酸、蛋白質(zhì)和脂肪含量,說明不同溶劑提取對(duì)多糖化學(xué)成分組成有顯著影響;本研究中堿性電解水是強(qiáng)滲透性的小分子水,多糖類物質(zhì)分子中含有大量極性基團(tuán),對(duì)水分子具有較大親和力,多糖與小分子水締結(jié),增加溶解度[10],并且堿性條件下酸性多糖更易溶出,堿性電解水所提多糖表現(xiàn)出更高的提取率和糖醛酸含量,其中多糖中的糖醛酸含量會(huì)影響抗氧化活性、降血糖活性、免疫活性等[21],因此AEW-MEP可能具有更好的生物活性。

2.3 不同溶劑提取對(duì)多糖基本性質(zhì)的影響

2.3.1 分子質(zhì)量分布

采用凝膠色譜法對(duì)羊肚菌多糖的分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定,分子質(zhì)量分布如表2所示。WE-MEP與AEW-MEP所得多糖均具有2種不同分子質(zhì)量分布范圍,羊肚菌多糖WE-MEP平均分子質(zhì)量分布為9.0×105、3.9×105Da,所占比例為22.84%、77.16%;羊肚菌多糖AEW-MEP平均分子質(zhì)量分布為8.9×105、3.8×105Da,分別占23.93%、76.07%。而羊肚菌多糖AW-MEP具有3種分子質(zhì)量分布范圍,分別為8.1×105、3.6×105、1.7×104Da,分別占比13.12%、72.9%、13.97%;羊肚菌多糖AW-MEP峰1和峰2平均分子質(zhì)量分別顯著低于WE-MEP與AEW-MEP峰1和峰2平均分子質(zhì)量,并且分散性較差,可能是在強(qiáng)堿性、加熱條件下導(dǎo)致糖苷鍵斷裂,產(chǎn)生小分子多糖,使得AW-MEP峰1、峰2面積占比明顯減小,產(chǎn)生的峰3是不規(guī)則斷裂后的小分子片段,分散度較差。

表2 多糖相對(duì)分子質(zhì)量及其分布Table 2 Results of monosaccharide composition

與其他研究相比,YIN等[22]比較不同方法提取海帶多糖的影響,采用酸法輔助提取海帶多糖過程中糖苷鍵斷裂,多糖分子質(zhì)量分布范圍更廣且較純水提取法低,而相同條件下酶法輔助提取不影響分子質(zhì)量分布;在本實(shí)驗(yàn)中堿水提取過程中可能會(huì)導(dǎo)致氧原子連接側(cè)鏈、β-(1→4)和β-(1→6)連接的部分殘基發(fā)生斷裂[7],使多糖分子質(zhì)量分布更廣;堿性電解水中含有帶電離子和自由基團(tuán),具有一定負(fù)氧化還原電位(-900～-1 000 mV),可以保護(hù)多糖結(jié)構(gòu)不被破壞[9],堿性電解水所提多糖,多分散系數(shù)更接近1,說明多糖分子聚合度高且分布集中,多糖結(jié)構(gòu)保持較好,堿性電解水提取不會(huì)對(duì)多糖的分子質(zhì)量分布造成顯著影響。

2.3.2 單糖組成分析

采用高效液相色譜法對(duì)羊肚菌單糖組成進(jìn)行測(cè)定,與混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照,結(jié)果如圖1所示,羊肚菌多糖WE-MEP、AW-MEP、AEW-MEP均由3種單糖組成,分別為甘露糖、葡萄糖、半乳糖,摩爾質(zhì)量百分比分別為4.18%、54.77%、41.05%;3.87%、46.19%、49.94%;3.32%、56.03%、40.65%。單糖組成結(jié)果表明,羊肚菌多糖主要由葡萄糖和半乳糖組成,含有少量甘露糖;3種提取方法所得多糖在單糖組成種類上沒有顯著區(qū)別,在比例上AW-MEP與其他2種多糖具有顯著差異,有更高的半乳糖比例,較低的葡萄糖比例;造成差異的原因可能是多糖分子在提取過程中受高溫、堿性條件影響部分降解,導(dǎo)致單糖組成比例不同[6]。

Man-甘露糖;Rib-核糖;Rha-鼠李糖;Xyl-木糖; Glc-葡萄糖;Gal-半乳糖 a-單糖混標(biāo);b-3種多糖樣品圖1 單糖組成結(jié)果Fig.1 Results of monosaccharide composition

ZHANG等[23]采用深共熔溶劑提取香菇多糖,與純水提取所得多糖的單糖組成種類相同,在比例上具有顯著差異,說明不同的方法可能改變所提取多糖的基本結(jié)構(gòu),并可能影響多糖的活性。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)分子量分析結(jié)果,與純水提取法相比,堿水提取會(huì)改變多糖分子鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響單糖組成比例,堿性電解水提取法對(duì)多糖的基本結(jié)構(gòu)無顯著影響,因此不影響其單糖組成種類及比例。

2.3.3 紅外光譜分析

圖2 羊肚菌多糖的紅外吸收光譜Fig.2 The FT-IR spectra of MEPs

2.3.4 X-射線衍射分析

3種多糖在10～30 °均出現(xiàn)峰寬較寬、強(qiáng)度較大的衍射峰,表明MEP內(nèi)部結(jié)晶度較低不能形成單晶體,而是以非晶體形式存在,符合真菌多糖結(jié)晶特性[27]。LI等[28]采用純水提取、酶輔助提取、超聲提取、微波提取4種方法提取元菇多糖,4種多糖X射線衍射曲線均呈面包狀,沒有尖峰,說明提取方法不會(huì)影響多糖的結(jié)晶性。堿性電解水所提多糖在2θ為5～60 °內(nèi),與純水提取法所得多糖相比,X射線衍射曲線無顯著區(qū)別,未出現(xiàn)尖銳的小峰,這說明堿性電解水提取不會(huì)改變羊肚菌多糖結(jié)晶性。具體見圖3。

圖3 多糖的X衍射圖Fig.3 X-ray diffraction histogram of MEPs

2.4 抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力分析

DPPH自由基清除率如圖4-a所示,3種方法所得多糖均具有一定的自由基清除能力并且在一定濃度范圍內(nèi)清除率隨質(zhì)量濃度的增大而增加,在質(zhì)量濃度高于1.0 mg/mL后,各質(zhì)量濃度AEW-MEP的DPPH清除率顯著高于WE-MEP(P<0.05),相同質(zhì)量濃度下,AW-MEP清除率始終顯著低于另外兩者(P<0.05);在質(zhì)量濃度2.5 mg/mL時(shí),AEW-MEP自由基清除率達(dá)到83.12%。經(jīng)計(jì)算AEW-MEP、WE-MEP與AE-MEP的IC50分別為0.125 8、0.129 1、0.137 9 mg/mL,總體上AEW-MEP的DPPH自由基清除能力強(qiáng)于WE-MEP和AE-MEP。

a-DPPH自由基清除率;b-ABTS陽(yáng)離子自由基清除率;c-Fe3+還原力圖4 三種方法提取所得羊肚菌多糖DPPH自由基清除率、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率、Fe3+還原力比較Fig.4 The in vitro antioxidant activities of MEPs extracted with three solvents

ABTS陽(yáng)離子自由基清除率如圖4-b所示,3種方法所得多糖對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而上升,質(zhì)量濃度低于1 mg/mL時(shí)WE-MEP和AEW-MEP各濃度還原能力相近;質(zhì)量濃度高于1 mg/mL后AEW-MEP清除率明顯升高;在2.5 mg/mL時(shí)AEW-MEP的自由基清除率達(dá)到77.95%,高于WE-MEP清除率72.12%,較AE-MEP高15.62%。經(jīng)計(jì)算AEW-MEP的IC50值為1.637 mg/mL顯著低于WE-MEP與AE-MEP的IC50值,分別為1.919 4、2.343 8 mg/mL(P<0.05),因此ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力:AEW-MEP>WE-MEP>AE-MEP。

自由基由在人體內(nèi)積累會(huì)引發(fā)如動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、抑郁癥等慢性疾病[29]。多糖作為能清除自由基且安全、健康的天然抗氧化劑,受到人們廣泛關(guān)注。FU等[30]的研究表明,多糖對(duì)自由基清除能力與多糖支鏈上的基團(tuán)、糖醛酸含量和葡萄糖含量有關(guān),結(jié)合單糖組成和化學(xué)成分結(jié)果,AEW-MEP與WE-MEP較AW-MEP有更高的糖醛酸和葡萄糖含量,并且堿性電解水具有氧化還原電位,提取過程可以對(duì)多糖支鏈上的羰基、醛基起保護(hù)作用,而堿水提取過程中可能破壞多糖結(jié)構(gòu),影響生物活性,因此可能是AEW-MEP具有更高的清除率,AW-MEP清除率最低的原因。

2.4.2 Fe3+還原力分析

Fe3+還原力測(cè)定結(jié)果如圖4-c所示,3種方法所得羊肚菌多糖均具有一定的Fe3+還原能力且多糖還原能力隨質(zhì)量濃度的增加而上升,在質(zhì)量濃度超過1.5 mg/mL后還原能力隨質(zhì)量濃度增加的遞增趨勢(shì)逐漸變緩,在2.5 mg/mL時(shí)還原力達(dá)到最高,此時(shí)AEW-MEP還原力較AE-MEP高0.179 mmol/L?？傮w上相同質(zhì)量濃度下的Fe3+還原能力:AEW-MEP>WE-MEP>AE-MEP。

由于糖醛酸中羧基與離子形成交聯(lián)[21],從而多糖表現(xiàn)出對(duì)金屬離子的還原能力;結(jié)合糖醛酸測(cè)定結(jié)果AE-MEP中糖醛酸含量較低,這可能是導(dǎo)致其活性較低的原因。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn),純水提取法對(duì)多糖結(jié)構(gòu)和功能影響較小,但得率較低;堿水提取法可提高多糖得率,但會(huì)改變分子質(zhì)量分布和單糖組成比例,進(jìn)而影響多糖抗氧化活性;堿性電解水法提取羊肚菌多糖得率較純水法提高42.4%,并且提取過程不影響其分子質(zhì)量分布,不改變基團(tuán)結(jié)構(gòu),不影響結(jié)晶性,并且所得多糖具有更好的抗氧化能力。此外堿性電解水制備簡(jiǎn)單、提取過程對(duì)環(huán)境友好,可作為一種綠色高效的新提取技術(shù)用于羊肚菌多糖提取。