干世卿,戴杰科,徐藝橙,楊立啟,聶小華*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州,310014)2(杭州華味亨生物科技有限公司,浙江 杭州,311100)

乳酸菌發(fā)酵植物基飲品是近年來最受關(guān)注的益生產(chǎn)品,可綜合植物源活性物質(zhì)和乳酸菌等功能特性,且乳酸菌代謝作用可賦予植物基飲品發(fā)酵風(fēng)味[1],甚至影響到植物源活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與數(shù)量[2-3]。常見的商業(yè)化乳酸菌有植物乳桿菌、嗜酸乳球菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌等。由于果蔬基質(zhì)為低酸低氮源體系,在酸脅迫和低氮脅迫下,乳酸菌生長繁殖會受到一定程度上的抑制[4]。已有研究表明,乳酸菌種類很大程度上影響著其在果蔬基質(zhì)中的適應(yīng)能力、發(fā)酵過程以及代謝產(chǎn)物,這些都與產(chǎn)品品質(zhì)和風(fēng)味密切有關(guān)[1-2,5-6],因此應(yīng)選擇合適的乳酸菌進行果蔬基質(zhì)的發(fā)酵。

柑橘是我國重要的經(jīng)濟作物,富含低分子糖類、有機酸類、維生素C、纖維素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分,同時還存在著大量的酚酸、黃酮、類胡蘿卜素、類檸檬苦素和香豆素等活性物質(zhì)[7],尤其酚酸和黃酮是柑橘及其制品內(nèi)在營養(yǎng)品質(zhì)的特征成分[7]?，F(xiàn)有國內(nèi)外研究主要針對柑橘果汁進行乳酸菌輕度發(fā)酵[2,6,8],果皮活性物質(zhì)未能得到利用。迄今為止,以柑橘全果漿為基質(zhì)的乳酸菌深度發(fā)酵研究還較少[9]。

寬皮柑桔(CitrusreticulateBlanco)是一類果皮寬松、剝皮容易的柑橘品種群,年產(chǎn)量約占柑橘總量的60%。浙江省作為柑橘生產(chǎn)的主產(chǎn)區(qū)之一,寬皮柑桔廣泛種植于溫州、臺州、寧波和杭州等地。本文以溫州蜜桔這一寬皮柑桔為原料,采用植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌為發(fā)酵菌種,比較其在寬皮柑桔全果漿中的發(fā)酵性能,綜合評價其深度發(fā)酵過程中活性物質(zhì)、抗氧化活性與揮發(fā)性成分的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寬皮柑桔采用溫州蜜桔,產(chǎn)地浙江溫州,選擇無明顯缺陷、成熟度合適的果實;植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,Lp-115)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus,La-14)和副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei,Lpc-37)等凍干粉,美國杜邦公司生產(chǎn)。DPPH,Sigma公司;沒食子酸、蘆丁和維生素C,上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LHR-150型生化培養(yǎng)箱,上?？茖W(xué)儀器有限公司;JPB-607A型便攜式酸度計,上海雷磁儀器有限公司;CRZIG Ⅱ型冷凍離心機,日本日立公司;UV762型紫外可見分光光度計,上海精科實業(yè)有限公司;Trace1300-ISQ型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 柑橘全果漿發(fā)酵產(chǎn)物的制備

參考楊立啟等[9]的方法。全果用次氯酸鈉溶液(含有效氯0.06%)和水依次清洗后,壓榨得到渾濁型全果漿,調(diào)整pH值至4.5,無菌條件下分別接種一定量的Lp-115、La-14和Lpc-37,30 ℃下發(fā)酵。

1.3.2 pH的測定

采用JPB-607A便攜式酸度計測定全果漿及其發(fā)酵產(chǎn)物的pH值。

1.3.3 活性物質(zhì)含量的測定

全果漿及發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)離心(8 000 r/min,10 min)后,上清液用于活性物質(zhì)含量的測定。維生素C含量測定采用碘量法[10];總酚含量測定采用福林酚法[5],以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品;總黃酮含量測定采用氯化鋁法[11],以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.4 抗氧化活性的測定

全果漿及發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)離心(8 000 r/min,10 min)后,上清液用于抗氧化活性的測定。自由基清除能力測定采用DPPH法[6];鐵離子還原力測定采用鐵氰化鉀法[12]。以維生素C為對照品,結(jié)果表示為g維生素C當(dāng)量/L。

1.3.5 揮發(fā)性成分的測定

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPEM-GC-MS)方法。按照楊立啟等[9]的方法,應(yīng)用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭吸附全果漿及發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性成分。

GC-MS條件:DB-5 MS毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);30 ℃保留2 min,以5 ℃/min升溫至250 ℃,保留5 min;載氣(氦氣),流速1.0 mL/min,分流比10∶1。EI離子源,電子能量70 eV,離子源溫度250 ℃,m/z40～550范圍內(nèi)掃描。

數(shù)據(jù)進行圖譜庫NIST和Xcalibur 3.0(Thermo Fisher Scientific)檢索,匹配度大于80%,結(jié)合文獻資料確定揮發(fā)性成分;按峰面積歸一法計算每種揮發(fā)性成分的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組樣品平行測定3次,表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差;主成分分析(principal component analysis,PCA)采用SPSS軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵寬皮柑桔全果漿過程中pH變化

寬皮柑桔全果漿中富含葡萄糖、果糖和蔗糖等低分子糖類,乳酸菌可將其代謝形成有機酸,由此引起pH下降。乳酸菌發(fā)酵寬皮柑桔全果漿過程中pH變化如圖1所示。結(jié)果表明,寬皮柑桔全果漿pH發(fā)生快速下降,而后趨于平緩;其中發(fā)酵3 d時Lpc-37和La-14僅將pH值降低了0.59和0.5,Lp-115則使pH發(fā)生大幅下降;發(fā)酵10 d后全果漿pH由起始的4.5分別降至2.72(Lp-115)、3.63(La-14)和3.44(Lpc-37),說明不同種類的乳酸菌在寬皮柑桔全果漿中生長情況存在明顯差異。這是因為寬皮柑桔全果漿的起始pH較低(4.5),氮源匱乏,且酚酸、黃酮可能影響乳酸菌的生長[4,13];已有研究表明,乳酸菌耐受和適應(yīng)環(huán)境脅迫的能力與其菌株種類有著密切關(guān)聯(lián)[4]。

2.2 乳酸菌發(fā)酵寬皮柑桔全果漿過程中活性物質(zhì)含量變化

寬皮柑桔全果漿含有豐富的維生素C、酚酸和黃酮等活性物質(zhì)[7,12],其在乳酸菌發(fā)酵過程中變化如圖2所示。經(jīng)Lp-115、La-14和Lpc-37發(fā)酵后,寬皮柑桔全果漿中維生素C含量由起始0.73 g/L快速下降而后趨于平緩,三者之間無顯著差異;發(fā)酵10 d后維生素C含量下降了70%以上。該現(xiàn)象常見于果蔬基質(zhì)的發(fā)酵[8,14],維生素C屬于烯醇,易氧化形成醌。寬皮柑桔全果漿中總酚含量呈現(xiàn)不斷增加的趨勢,其中Lp-115的作用明顯強于La-14和Lpc-37,發(fā)酵10 d時分別達到3.23、2.08、1.84 g/L。這是因為全果漿為富含果肉果皮的渾濁體系,存在著大量的不溶性酚類物質(zhì),其在乳酸菌的糖苷酶和酚酸酯酶[3,15 ]作用下得到釋放;同時,酚類物質(zhì)在低酸環(huán)境中也不易被氧化成醌。但寬皮柑桔全果漿中總黃酮含量隨發(fā)酵時間呈現(xiàn)截然不同的趨勢,其在Lp-115發(fā)酵產(chǎn)物中提高1.35倍(3 d),而后維持在1.3 g/L附近;在La-14發(fā)酵產(chǎn)物中表現(xiàn)為先降后增,Lpc-37發(fā)酵產(chǎn)物中基本無變化(0.93～1 g/L)。一般來說,乳酸菌發(fā)酵果蔬基質(zhì)中總酚和總黃酮含量得到提高[2,6,8]。推測其原因是:乳酸菌分泌的糖苷酶將不溶性膳食纖維結(jié)合的黃酮釋放形成可溶性黃酮;也可能將可溶性黃酮苷水解成不溶性黃酮苷元[3]。

A-維生素C含量;B-總酚含量;C-總黃酮含量圖2 乳酸菌發(fā)酵寬皮柑桔全果漿過程中活性物質(zhì)的含量變化Fig.2 Changes in active compound contents in C.reticulate Blanco pulp during Lactobacillus fermentation

2.3 乳酸菌發(fā)酵寬皮柑桔全果漿過程中抗氧化活性的變化

乳酸菌發(fā)酵寬皮柑桔全果漿過程中抗氧化活性的變化如圖3所示。經(jīng)Lp-115和La-14發(fā)酵后,寬皮柑桔全果漿的DPPH自由基清除能力均呈現(xiàn)先增加而后基本穩(wěn)定,10 d后分別達到0.47、0.33 g維生素C當(dāng)量/L;鐵離子還原力也得到顯著提高,分別在發(fā)酵5 d和7 d達到最大值(2.82、1.89 g維生素C當(dāng)量/L);但Lpc-37明顯降低了全果漿清除DPPH自由基和還原鐵離子的能力。推測其原因有:a)不溶性酚類物質(zhì)的釋放情況[3,15];b)酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[2-3];c)乳酸菌分泌抗氧化酶的能力[16];d)酚類物質(zhì)的氧化程度[14,17];e)維生素C的損失狀況[8,14]。眾所周知,乳酸菌在果蔬基質(zhì)中的生長、發(fā)酵以及分泌糖苷酶、酯酶和抗氧化酶等,存在著較大的菌株差異性?？傮w上,乳酸菌發(fā)酵寬皮柑桔全果漿的抗氧化活性依次為:Lp-115發(fā)酵產(chǎn)物> La-14發(fā)酵產(chǎn)物 >Lpc-37發(fā)酵產(chǎn)物,前者明顯高于后二者。

A-DPPH自由基清除能力;B-鐵離子還原力圖3 乳酸菌發(fā)酵寬皮柑桔全果漿過程中抗氧化活性的變化Fig.3 Change in antioxidant activity of C.reticulate Blanco pulp during Lactobacillus fermentation

2.4 乳酸菌發(fā)酵寬皮柑桔全果漿過程中揮發(fā)性成分的變化

乳酸菌發(fā)酵寬皮柑桔全果漿過程中揮發(fā)性成分種類及相對含量如表1所示。寬皮柑桔全果漿及發(fā)酵產(chǎn)物中共鑒定出64種揮發(fā)性成分,包括36種烯類、10種醛類、7種醇類、4種酯類、3種有機酸類、1種酮類以及3種其他類,其中D-檸檬烯含量最高(59.73%～68.9%)。

表1 乳酸菌發(fā)酵寬皮柑橘全果漿中揮發(fā)性成分的相對含量 單位:%

烯類化合物是寬皮柑桔全果漿的重要揮發(fā)性成分,其相對含量從83.82%增加到87.11%(Lp-115)和87.62%(Lpc-37),La-14則使其降低至80.66%,說明發(fā)酵產(chǎn)物中烯類化合物與乳酸菌種類有關(guān)。D-檸檬烯是柑橘特征揮發(fā)性風(fēng)味成分[18],相對含量發(fā)生不同程度的下降,尤其La-14發(fā)酵產(chǎn)物中降低了9.17%;β-欖香烯、β-萜品烯和β-月桂烯等相對含量增加了1%以上,其中前二者可賦予產(chǎn)品檸檬香氣和茴香氣味,后者可賦予產(chǎn)品香脂香氣。

寬皮柑桔全果漿經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后,醛類化合物相對含量明顯降低,己醛、辛醛、癸醛、橙花醛和紫蘇醛等含量極低甚至未檢出,該結(jié)果說明柑橘特有清香風(fēng)味發(fā)生減弱;已有研究表明,醛類化合物在乳酸菌代謝作用下可還原成為相應(yīng)的醇類化合物[19]。醇類化合物主要為芳樟醇,相對含量從起始的5.13%分別降至4.17%(Lp-115)、3.52%(La-14)和2.04%(Lpc-37);乙醇、α-松油醇和4-松油醇等相對含量顯著提高,其中Lp-115發(fā)酵產(chǎn)物中乙醇相對含量提高較多;發(fā)酵產(chǎn)物中檢出了微量香茅醇,可賦予產(chǎn)品玫瑰香氣;La-14發(fā)酵產(chǎn)物中新增異戊醇,具有蘋果白蘭地香氣和辛辣味。全果漿及發(fā)酵產(chǎn)物中酯類化合物相對含量較低(0.21%～4.13%),其中乙酸乙酯相對含量提高了0.82%(Lp-115)、3.88%(La-14)和3.07%(Lpc-37),可賦予產(chǎn)品甜果香味。發(fā)酵產(chǎn)物中均檢出香芹酮,具有薄荷風(fēng)味,僅Lp-115明顯提高其相對含量。

寬皮柑桔全果漿中不存在短鏈脂肪酸,乳酸菌發(fā)酵后可檢出乙酸、異丁酸、異戊酸等,其在Lp-115發(fā)酵產(chǎn)物中相對含量極低。發(fā)酵產(chǎn)物中反式-檸檬烯氧化物消失;微量的正己烷和乙偶姻檢出,其中乙偶姻是乳酸菌發(fā)酵特有的代謝產(chǎn)物[20]。

2.5 揮發(fā)性成分的主成分分析

乳酸菌發(fā)酵寬皮柑桔全果漿中揮發(fā)性成分的主成分分析如圖4所示。PC1和PC2貢獻率分別為49.9%和27.5%,累積貢獻率達77.4%,基本上可反映全部信息;PC1反映醇類化合物、酯類化合物、有機酸類等指標(biāo),PC2反映烯類化合物、醛類化合物和其他類揮發(fā)性成分等指標(biāo)。根據(jù)距離的遠近,寬皮柑桔全果漿與發(fā)酵產(chǎn)物相比,揮發(fā)性成分變化存在顯著差異;La-14發(fā)酵5 d和發(fā)酵10 d的全果漿揮發(fā)性成分變化較為顯著,Lp-115和Lpc-37發(fā)酵5 d和10 d的全果漿揮發(fā)性成分存在一定差異。該結(jié)果說明寬皮柑桔全果漿的揮發(fā)性成分受乳酸菌種類和發(fā)酵時間影響,其中La-14的影響最大,意味著柑橘特性風(fēng)味向乳酸菌發(fā)酵風(fēng)味的轉(zhuǎn)變。

圖4 寬皮柑桔全果漿及發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性成分的主成分析Fig.4 PCA for unfermented and fermented C.reticulate Blanco pulps注:UF代表未發(fā)酵寬皮柑桔全果漿;Lp-115(5)和Lp-115(10) 代表植物乳桿菌Lp-115發(fā)酵全果漿5 d和10 d;La-14(5)和 La-14(10)代表嗜酸乳桿菌La-14發(fā)酵全果漿5 d和10 d;Lpc-37(5) 和Lpc-37(10)代表副干酪乳桿菌Lpc-37發(fā)酵全果漿5 d和10 d。

3 結(jié)論

本文研究了乳酸菌Lp-115、La-14和Lpc-37發(fā)酵寬皮柑桔全果漿過程中營養(yǎng)品質(zhì)與揮發(fā)性成分的變化規(guī)律。Lp-115對寬皮柑桔全果漿的發(fā)酵能力最強,其發(fā)酵產(chǎn)物中總酚和總黃酮含量高于La-14發(fā)酵產(chǎn)物和Lpc發(fā)酵產(chǎn)物,但3種乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物中維生素C含量均發(fā)生明顯下降;Lp-115和La-14可顯著提升寬皮柑桔全果漿抗氧化活性,但Lpc-37導(dǎo)致抗氧化活性發(fā)生一定程度的下降。采用SPEM-GC-MS法分析全果漿及發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性成分,烯類化合物、醛類化合物和芳樟醇等發(fā)生明顯下降,說明柑橘特有清香風(fēng)味有所下降;酯類化合物(尤其乙酸乙酯)、香芹酮和乙偶姻等有所增加,賦予了產(chǎn)品乳酸菌發(fā)酵風(fēng)味。主成分分析表明寬皮柑桔全果漿揮發(fā)性成分很大程度上受到乳酸菌種類和發(fā)酵時間的影響,尤其La-14;與La-14和Lpc-37相比,Lp-115更適合用于寬皮柑桔全果漿的發(fā)酵生產(chǎn)。