李錦弘,鄭慧珍,4,陳慧,4,劉書來(lái),4,顧賽麒,4,王芮,4,相興偉,4*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州,310014) 2(浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州,310014) 3(國(guó)家遠(yuǎn)洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心,浙江 杭州,310014) 4(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,大連工業(yè)大學(xué),遼寧 大連,116034)

巨噬細(xì)胞主要出現(xiàn)在淋巴組織中,在血管中多為單核細(xì)胞,在周圍淋巴組織中因吞噬多種異物成為巨噬細(xì)胞,其通過(guò)積極參與機(jī)體的先天性免疫和特異性免疫反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用,并形成免疫防御的第一道防線[1-2]。在先天性免疫反應(yīng)中,激活后的巨噬細(xì)胞對(duì)外來(lái)病菌、凋亡細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞具有極強(qiáng)的吞噬消化作用,并能通過(guò)分泌相關(guān)酶和介質(zhì)消滅機(jī)體內(nèi)多種致病菌和有害微生物[3]。在特異性免疫過(guò)程中,巨噬細(xì)胞對(duì)內(nèi)源或外源性抗原進(jìn)行識(shí)別,遞呈給抗原特異性細(xì)胞激活特異性免疫應(yīng)答[4]。食源性生物活性肽以其較高的消化性、營(yíng)養(yǎng)性和生理效果,逐漸受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[5]。

食源性生物活性肽具有抗氧化、降血壓、降血脂、護(hù)肝和增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等優(yōu)良的生物學(xué)功能[6-9]。食源性生物活性肽由于來(lái)源廣泛、成本低,在功能保健食品的開(kāi)發(fā)與研究方面具有廣闊的市場(chǎng)前景和應(yīng)用空間,是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱門課題之一。牡蠣營(yíng)養(yǎng)極為豐富,富含微量元素、蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素和?；撬岬葼I(yíng)養(yǎng)成分,自古以來(lái)就為功能保健食品,被冠以“海底牛奶”的稱號(hào)[10]。牡蠣也是我國(guó)衛(wèi)生部門首次批準(zhǔn)的藥食同源海洋源產(chǎn)品,具有很高的藥用價(jià)值[11]。據(jù)《本草綱目》所述,牡蠣肉具有治虛損、解丹毒、化痰清熱、除濕痢下和恢復(fù)氣血的療效。眾所周知的中藥方劑“牡蠣散”對(duì)諸虛不足、津液不固、心忪驚惕等癥狀有顯著療效。據(jù)研究表明,牡蠣擁有許多生物活性與保健功能,尤其是其經(jīng)過(guò)蛋白酶水解制備的牡蠣肽具有提高免疫力[12]、抗病毒[13]、抗腫瘤[14]、抗氧化[15]、抗疲勞[16]、降血壓[17]和生殖保健[18]等,然而關(guān)于牡蠣肽體外免疫保護(hù)活性的研究報(bào)告較少。

因此,本試驗(yàn)通過(guò)采用脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)處理并活化RAW264.7巨噬細(xì)胞,探討牡蠣肽對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞免疫活性的影響,評(píng)估牡蠣肽的體外免疫保護(hù)活性,并為牡蠣肽在免疫功能調(diào)節(jié)方面的研究利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)購(gòu)自浙江杭州海鮮市場(chǎng)。牡蠣肽(oyster peptide, OP)根據(jù)之前的相關(guān)報(bào)道進(jìn)行提取制備[9],純度大于95%,分子質(zhì)量小于1 000 Da。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞由浙江省立同德醫(yī)院提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

LPS、中性紅染色劑,美國(guó)Sigma公司;CCK8(cell counting kit-8,CCK8)試劑盒,Biomiky公司;NO檢測(cè)試劑盒,南京建成生物工程研究所;胎牛血清、DMEM(dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)高糖培養(yǎng)基、胰酶、雙抗,美國(guó)Gibco公司;總RNA提取試劑TRIzol Reagent,美國(guó)Invitrogen公司;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)試劑盒、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)試劑盒,武漢博士徳生物工程有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus),Takara公司;RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、苯甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)膜,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;SDS-PAGE 4×蛋白上樣緩沖液,北京Solarbio科技有限公司;鼠單克隆抗體p-IκBα,美國(guó)Novus Biologicals公司;兔單克隆抗體IκBa,美國(guó)Abcam公司;兔單克隆抗體p-p65、鼠單克隆抗體p65、兔單克隆抗體 β-actin,美國(guó)Cell Signaling公司;山羊抗兔IgG(HRP)、山羊抗鼠IgG(HRP),南京諾唯贊生物科技有限公司;PVDF轉(zhuǎn)印膜,Millipore公司;其余實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純級(jí)別。

1.2 儀器與設(shè)備

902型80 ℃超低溫冰箱、3111 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,賽默飛世爾科技有限公司;5415D低溫高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf;SJ-CJ-2D超凈工作臺(tái),上海尚凈公司;倒置顯微鏡,德國(guó)Leica Microsystems;BP211D電子天平,美國(guó)Sartorius;HH-4型恒溫水浴鍋,國(guó)華電器有限公司;Tecan Infinite F200多功能酶標(biāo)儀,瑞士TECAN 集團(tuán)公司;ABI ViiATM7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,美國(guó)Applied Biosystems;Alpha FluorChem FC3凝膠成像系統(tǒng),美國(guó)ProteinSimple;9556A水平脫色搖床,國(guó)產(chǎn)華利達(dá)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)

使用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和質(zhì)量濃度100 μg/mL鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件設(shè)置為:溫度37 ℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO2。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到80%～90%的密度后進(jìn)行下一步傳代和種板。首先,將細(xì)胞培養(yǎng)瓶里過(guò)期的細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉,用適量預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)溶液洗滌細(xì)胞3次。然后用移液槍吹落瓶底和瓶壁上附著的細(xì)胞,混勻,收集細(xì)胞懸液。對(duì)細(xì)胞懸液適當(dāng)稀釋,在顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求取相應(yīng)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行種板。

1.3.2 CCK8法檢測(cè)巨噬細(xì)胞增殖率

采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞按1×104/孔的密度接種至96孔板中,過(guò)夜孵育24 h后,倒掉上清液。空白組每孔加入200 μL完全培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組則根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)置,每孔分別加入200 μL牡蠣肽稀釋培養(yǎng)液(質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為:100、200、300、400、600、700、800、900、1 000 μg/mL),每組實(shí)驗(yàn)復(fù)孔數(shù)設(shè)置為6個(gè)。在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h,用預(yù)熱的PBS洗3次,加入質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL CCK8的培養(yǎng)液100 μL于每孔中,在37 ℃條件下孵育4 h至出現(xiàn)藍(lán)紫色沉淀。避光取出96孔板并在酶標(biāo)儀中振蕩3 min。最終,在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值。細(xì)胞增殖率計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.3.3 中性紅法檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬能力

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞按1×104/孔密度接種至96孔板,過(guò)夜培養(yǎng)后棄上清液,按如下實(shí)驗(yàn)分組分別進(jìn)行不同實(shí)驗(yàn)處理,并根據(jù)中性紅法測(cè)定巨噬細(xì)胞吞噬能力。實(shí)驗(yàn)分組:空白組、模型組(LPS終質(zhì)量濃度為2 μg/mL)和不同濃度的牡蠣肽處理組。細(xì)胞孵育24 h后,棄上清液,每孔加入200 μL含有濃度為0.075%的中性紅生理鹽水,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用預(yù)熱PBS溶液洗滌細(xì)胞3遍,每孔加入200 μL酸乙醇(包括50%乙醇,1%乙酸和49%超純水,體積分?jǐn)?shù))。置于4 ℃條件下靜置過(guò)夜,通過(guò)酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)量溶液吸光度值,并根據(jù)公式(2)計(jì)算中性紅吞噬率:

(2)

1.3.4 一氧化氮分泌水平測(cè)定

將RAW264.7細(xì)胞按3×105/孔數(shù)量接種至6孔板,過(guò)夜培養(yǎng)后棄上清液。根據(jù)如下分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理:(1)空白組:只加入DMEM完全培養(yǎng)基;(2)模型組:加入含有LPS質(zhì)量濃度為2 μg/mL的完全培養(yǎng)液;(3)牡蠣肽低劑量組:加入含有OP質(zhì)量濃度為100 μg/mL的完全培養(yǎng)液;(4)牡蠣肽中劑量組:加入含有OP質(zhì)量濃度為200 μg/mL的完全培養(yǎng)液;(5)牡蠣肽高劑量組:加入含有OP質(zhì)量濃度為400 μg/mL的完全培養(yǎng)液。根據(jù)試驗(yàn)分組孵育細(xì)胞24 h,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。然后在1 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min并取上清液,采用一氧化氮試劑盒檢測(cè)巨噬細(xì)胞NO分泌水平[19]。

1.3.5 細(xì)胞因子分泌水平測(cè)定

實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理方法同1.3.4節(jié)。實(shí)驗(yàn)處理24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液,在1 500 r/min條件下離心5 min收集上清液。使用ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子IL-6、IL-10以及TNF-α的含量。

1.3.6 巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平測(cè)定

將RAW264.7細(xì)胞按3×105/孔數(shù)量接種至6孔板并過(guò)夜培養(yǎng),棄去上清液。根據(jù)1.3.4節(jié)進(jìn)行相同細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組和處理,孵育24 h后使用胰酶消化并收集細(xì)胞。使用PBS溶液漂洗細(xì)胞3次,隨后轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的滅菌EP管中。每管分別加入1 mL預(yù)冷TRIzol試劑,反復(fù)吹打充分裂解細(xì)胞,凍存在-80 ℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)GeneBank查找本實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕虻囊阎暾蛄?通過(guò)Primer Premier 6.22設(shè)計(jì)并獲得相應(yīng)特異性上游和下游引物,最后委托上海生物工程公司進(jìn)行合成。具體目的基因序列如表1所示。將凍存于-80 ℃ 環(huán)境的細(xì)胞裂解液取出,置于冰上溶解,細(xì)胞總RNA的提取采用TRIzol抽提法。分別通過(guò)蛋白核酸定量?jī)x測(cè)定并記錄ODA260/A280、ODA260/A230以及提取RNA濃度,并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取RNA質(zhì)量。隨后,已檢驗(yàn)純度并合格的RNA通過(guò)采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并合成cDNA。根據(jù)熒光定量試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系的總體積是20 μL:含有10 μL SYBR Green混合液,0.4 μL ROX II,2.0 μL cDNA樣品,6.8 μL Rnase-Free ddH2O,上游引物和下游引物各0.4 μL。按以下程序擴(kuò)增上述反應(yīng)體系:在95 ℃溫度下預(yù)變性30 s;接著進(jìn)行PCR反應(yīng)(變性溫度為95 ℃,5 s;退火溫度為60 ℃,34 s),循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后,進(jìn)行定量分析。目的基因相對(duì)mRNA表達(dá)水平根據(jù)2-ΔΔCt公式計(jì)算,以 β-actin作為內(nèi)參基因,每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)引物序列Table 1 Real-time quantitative PCR primer sequences

1.3.7 牡蠣肽對(duì)巨噬細(xì)胞NF-κB通路的影響

將細(xì)胞按2×106/孔數(shù)量接種到6孔板并過(guò)夜培養(yǎng)。然后將細(xì)胞與不同濃度牡蠣肽以及質(zhì)量濃度為2 μg/mL的LPS溶液孵育24 h。孵育結(jié)束后,用預(yù)熱PBS溶液漂洗3次,并收集各組巨噬細(xì)胞置于離心管中,以1 500 r/min轉(zhuǎn)速離心2 min。棄上清液后,將細(xì)胞沉淀置于冰上,使用Western-blot檢測(cè)NF-κB通路蛋白表達(dá)量。

a)總蛋白樣品制備和定量:使用前,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書配制裂解液,并進(jìn)行總蛋白的提取。每管取4 μL蛋白提取液,采用BCA法進(jìn)行總蛋白濃度的定量。其余總蛋白提取液分別按比例加入蛋白上樣緩沖液,混勻并煮沸,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

b)SDS-PAGE電泳分析及轉(zhuǎn)膜:配制濃縮膠和分離膠。每個(gè)上樣孔加入60 μg蛋白樣品,并加入上樣緩沖液補(bǔ)體積。先后在60 V和80 V恒壓下跑膠。電泳結(jié)束后,根據(jù)靶蛋白分子質(zhì)量以及對(duì)應(yīng)的蛋白條帶,切取分離膠。將PVDF膜置于甲醇中浸泡,然后轉(zhuǎn)移到Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡;SDS-PAGE凝膠在Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液平衡;安裝轉(zhuǎn)膜夾,排氣泡后壓緊置于轉(zhuǎn)膜液中,以100 V恒壓全濕轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜正面朝上放于封閉盒中,用含5% BSA的 TBST(tris buffered saline with Tween-20,TBST)溶液封閉。封閉結(jié)束,用TBST溶液洗滌。

c)抗體孵育:將一抗以適當(dāng)比例溶于TBST溶液(含3% BSA),并和PVDF膜在4 ℃孵育過(guò)夜,使用TBST溶液洗滌。將二抗以適當(dāng)比例溶于TBST溶液(含3% BSA),和PVDF膜在室溫下振蕩孵育1 h;使用TBST溶液洗滌。

d)化學(xué)發(fā)光,顯影和灰度值測(cè)定:臨用前,根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明書,按比例將A液和B液混勻,制備顯影液。將PVDF轉(zhuǎn)印膜浸于顯影液中室溫孵育1 min后吸盡余液體,使用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影并觀察拍照。最后采用Image J軟件計(jì)算分析各蛋白條帶的灰度值,重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。不同組間釆用LSD法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn),P<0.05代表數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響

采用CCK8法測(cè)定牡蠣肽對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖能力的影響。除去空白組,在96孔板中分別加入質(zhì)量濃度100、200、300、400、600、700、800、900、1 000 μg/mL牡蠣肽培養(yǎng)液并孵育24 h,并根據(jù)增殖率計(jì)算公式得到RAW264.7巨噬細(xì)胞的相對(duì)增殖率。結(jié)果如圖1所示,與空白組相比,質(zhì)量濃度范圍在100～900 μg/mL的牡蠣肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖率沒(méi)有顯著性影響(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在一定范圍內(nèi),牡蠣肽對(duì)巨噬細(xì)胞增殖沒(méi)有毒性影響,可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同質(zhì)量濃度牡蠣肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of OP on the index of RAW264.7 cells proliferation注:圖中不同字母代表顯著性差異(P<0.05)(下同)。

2.2 牡蠣肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬作用的影響

不同質(zhì)量濃度牡蠣肽對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能影響如圖2所示。吞噬作用是吞噬細(xì)胞如RAW264.7細(xì)胞消滅外源性致病菌和內(nèi)源性凋亡細(xì)胞的有效方法。LPS通過(guò)激活巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化成熟,增強(qiáng)單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞的吞噬作用,但也可能使吞噬功能性細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)度活化,導(dǎo)致炎癥發(fā)生。中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,使用2 μg/mL的LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后,可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用(P<0.05)。與空白組比較,加入質(zhì)量濃度為100、200、300、400、600、700、800、900 μg/mL的牡蠣肽,可顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力(P<0.05),并在一定范圍內(nèi)(100～600 μg/mL)呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。但其對(duì)細(xì)胞吞噬的刺激效果低于單獨(dú)給予LPS造模組。

圖2 不同質(zhì)量濃度牡蠣肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響Fig.2 Effect of different concentrations of OP on the phagocytosis of RAW264.7 cells

2.3 牡蠣肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌水平的影響

NO的釋放量是反應(yīng)巨噬細(xì)胞抗炎活性的常見(jiàn)指標(biāo),抑制NO的過(guò)量產(chǎn)生可以治療并緩解某些炎癥性疾病。不同濃度牡蠣肽對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞NO分泌水平結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示,與空白組比較,單獨(dú)給予LPS造模組NO的分泌水平顯著提高(P<0.05),說(shuō)明LPS導(dǎo)致RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生了炎癥反應(yīng)。與LPS模型組比較,不同濃度牡蠣肽的處理使巨噬細(xì)胞的NO分泌水平顯著降低(P<0.05),并且具有一定劑量依賴性。

圖3 不同質(zhì)量濃度牡蠣肽對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞NO 分泌水平的影響Fig.3 Effect of different concentrations of OP on the NO secretion of RAW264.7 cells

2.4 牡蠣肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌水平的影響

巨噬細(xì)胞常見(jiàn)炎癥指標(biāo)主要有TNF-α、IL-6和IL-10,不同濃度牡蠣肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌水平的影響見(jiàn)圖4。如圖4-A和圖4-C所示,牡蠣肽處理RAW264.7細(xì)胞24 h后,與空白組比較,僅用LPS處理的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6和TNF-α含量顯著升高,提示RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)。與單獨(dú)給予LPS處理組相比,加入質(zhì)量濃度為100、200、400 μg/mL的牡蠣肽使RAW264.7細(xì)胞IL-6和TNF-α分泌水平全部顯著降低(P<0.05),具有濃度依賴效應(yīng)。圖4-B結(jié)果表明,與空白組相比,LPS模型組RAW264.7細(xì)胞的IL-10分泌水平顯著上升(P<0.05)。使用牡蠣肽處理炎癥RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后,質(zhì)量濃度為100 μg/mL的牡蠣肽使RAW264.7細(xì)胞IL-10分泌水平下降,但沒(méi)有顯著性影響(P>0.05)。然而牡蠣肽質(zhì)量濃度分別為200、400 μg/mL時(shí),RAW264.7細(xì)胞的IL-10分泌水平顯著降低(P<0.05),且具有劑量依賴性。

A-IL-6;B-IL-10;C-TNF-α圖4 不同質(zhì)量濃度牡蠣肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL-6,IL-10和TNF-α分泌水平的影響Fig.4 Effects of different concentrations of OP on secretion levels of IL-6, IL-10 and TNF-α in RAW264.7 cells

2.5 牡蠣肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

為了進(jìn)一步探討牡蠣肽對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用,使用RT-PCR法測(cè)定了一氧化氮合酶和炎癥相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平,結(jié)果如圖5所示。與空白組相比,LPS處理組的RAW264.7細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、iNOS以及TLR4的mRNA表達(dá)量都顯著增加(P<0.05)。分別用質(zhì)量濃度為100、200、400 μg/mL的牡蠣肽處理LPS造模后的RAW264.7細(xì)胞。給藥24 h后,與LPS組相比,RAW264.7細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、iNOS以及TLR4 mRNA表達(dá)水平都顯著下降(P<0.05),且呈劑量依賴性關(guān)系。其中,高濃度的牡蠣肽使巨噬細(xì)胞中TLR4、IL-6、IL-1β和IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著下降(P<0.05),其分泌水平與空白組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

A-IL-1β;B-TNF-α;C-IL-6;D-IL-10;E-TLR4;F-iNOS圖5 不同質(zhì)量濃度牡蠣肽對(duì)RAW264.7 細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、TLR4和iNOS mRNA表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of different concentrations of OP on the mRNA expression levels of IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10, TLR4 and iNOS in RAW264.7 cells

2.6 牡蠣肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響

為了探究牡蠣肽對(duì)巨噬細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的作用,通過(guò)Western-blot法測(cè)定巨噬細(xì)胞IκBα和p65的蛋白磷酸化水平。結(jié)果如圖6所示,與空白組比較,LPS和牡蠣肽均能促進(jìn)p65和IκBα發(fā)生磷酸化。LPS處理巨噬細(xì)胞24 h后,RAW264.7細(xì)胞中p-p65/p65和p-IκBα/IκBα比值顯著升高(P<0.05)。牡蠣肽處理巨噬細(xì)胞24 h后,與LPS模型組比較,p65和IκBα蛋白磷酸化水平隨著牡蠣肽濃度的增加而降低,具有劑量依賴性。其中,濃度為400 μg/mL的牡蠣肽處理組顯著降低了p-p65/p65和p-IκBα/IκBα比值(P<0.05),但都略高于空白組。結(jié)果提示,牡蠣肽對(duì)巨噬細(xì)胞起的免疫保護(hù)作用可能通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

A-p-p65/p65的相對(duì)表達(dá)水平;B-p-IκBα/IκBα的相對(duì)表達(dá)水平圖6 不同質(zhì)量濃度牡蠣肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的影響Fig.6 Effects of different concentrations of OP on protein expression levels of NF-κB signaling pathway in RAW264.7 cells

3 討論

巨噬細(xì)胞在許多疾病中發(fā)揮重要作用,也是機(jī)體先天免疫應(yīng)答的主要參與者。巨噬細(xì)胞可以有效抵御細(xì)菌及病毒的感染,在自身免疫性疾病、細(xì)菌感染和炎癥反應(yīng)中起著決定性的關(guān)鍵作用[19]。病原微生物侵入機(jī)體時(shí),通過(guò)識(shí)別抗原表面的受體來(lái)激活自身,并分泌促炎因子和抗炎因子來(lái)清除病原體,控制疾病進(jìn)程[20]。在本試驗(yàn)中,CCK8試驗(yàn)和中性紅試驗(yàn)結(jié)果顯示,牡蠣肽質(zhì)量濃度為100～900 μg/mL時(shí),對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖率沒(méi)有顯著影響,并且可以提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力。猴頭菇多糖在質(zhì)量濃度為100～1 000 μg/mL時(shí),也可以顯著增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞吞噬作用[21]。在體外試驗(yàn)中,通常使用特定濃度LPS建立炎癥巨噬細(xì)胞模型。LPS可以通過(guò)TLR4途徑促使巨噬細(xì)胞活化,并刺激巨噬細(xì)胞分泌各種炎癥因子和炎癥介質(zhì)[22]。NO是巨噬細(xì)胞分泌的主要炎癥介質(zhì)之一,也是細(xì)胞毒性效應(yīng)物。NO可以參與調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞的各項(xiàng)功能,主要通過(guò)1-精氨酸催化后由iNOS合成。NO不僅參與巨噬細(xì)胞殺傷外來(lái)病毒以及寄生蟲等過(guò)程,而且還參與細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié),特別是與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子,是巨噬細(xì)胞發(fā)揮其免疫功效的前提條件[23]。因此,NO的分泌水平是觀察巨噬細(xì)胞免疫活性的常見(jiàn)指標(biāo)。

巨噬細(xì)胞根據(jù)其功能特點(diǎn)和誘導(dǎo)的Th1或Th2免疫反應(yīng)類型可分為M1和M2型。其中,TNF-α和IL-1β是M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子,可直接殺傷腫瘤細(xì)胞。IL-6和IL-10是M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子。炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-10是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞因子,這些細(xì)胞因子的表達(dá)和調(diào)控是相互作用、相互協(xié)調(diào)的[24]。TNF-α是非常典型的促炎細(xì)胞因子,通過(guò)刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞從而直接介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng),并可促進(jìn)其他炎癥因子的分泌,有助于刺激機(jī)體的正常免疫功能,抵抗感染[25]。然而,TNF-α的過(guò)量產(chǎn)生會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生負(fù)面影響,造成不同程度的損傷。IL-6不僅起促炎作用,還具有一定的抗炎作用[25]。IL-10在體內(nèi)主要起抗炎作用,控制炎癥反應(yīng)程度[26]。本研究中,LPS處理RAW264.7細(xì)胞后,OP干預(yù)顯著降低了NO、IL-6、TNF-α和IL-10的分泌水平。同時(shí),隨著OP劑量的增加(100、200、400 μg/mL),RAW264.7細(xì)胞分泌產(chǎn)生的NO以及炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-10含量逐漸下降,提示OP有助于緩解LPS刺激RAW264.7細(xì)胞所引起的炎癥反應(yīng),其效果呈劑量依賴性。此外,在分子水平上檢測(cè)到的細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平與ELISA結(jié)果一致,進(jìn)一步證明OP通過(guò)調(diào)節(jié)炎性基因表達(dá)來(lái)調(diào)控相應(yīng)細(xì)胞因子的分泌水平,從而對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞發(fā)揮一定的保護(hù)作用。

HWANG等[27]發(fā)現(xiàn)牡蠣水解到的牡蠣肽可能通過(guò)NF-κB通路對(duì)由LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥有抗炎作用。LI等[28]發(fā)現(xiàn)青蛤蛋白肽通過(guò)激活NF-κB通來(lái)增強(qiáng)RAW 264.7細(xì)胞巨噬細(xì)胞吞噬功能。為進(jìn)一步探討牡蠣肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,研究采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路主要蛋白的表達(dá)情況。研究表明,TLR4能夠識(shí)別外來(lái)入侵物質(zhì),并通過(guò)下游信號(hào)分子MyD88轉(zhuǎn)導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào),MyD88通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路,在宿主先天免疫應(yīng)答中釋放TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子[29]。NF-κB信號(hào)通路是調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞生物學(xué)、黏膜炎癥和感染的重要轉(zhuǎn)錄系統(tǒng),是調(diào)節(jié)促炎酶和細(xì)胞因子基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[30]。它可以介導(dǎo)參與細(xì)胞代謝和免疫應(yīng)答的特定基因的表達(dá),調(diào)控NF-κB的表達(dá)活化也是治療多種炎癥相關(guān)疾病的有效方法。NF-κB的活化途徑最終是通過(guò)降解磷酸化IκBα蛋白,并解除NF-κB的抑制狀態(tài)來(lái)完成的。在細(xì)胞受到外界各種因素(如LPS和細(xì)胞因子)刺激后,IκBα激酶在激活后參與p65的磷酸化反應(yīng),并激活NF-κB信號(hào)通路[31]。隨后,IL-6、TNF-α和IL-10等與免疫應(yīng)答相關(guān)的基因得到表達(dá)。本研究結(jié)果表明,采用高劑量OP處理不僅顯著降低了RAW264.7細(xì)胞中p-p65/p65比值,而且降低了p-IκBα/IκBα比值。OP通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路,降低RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng),具體表現(xiàn)在抑制TNF-α、IL-6和IL-10的分泌,以及TNF-α、IL-6和IL-10的下游mRNA表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)論與HWANG等[27]之前報(bào)道的牡蠣肽可以緩解RAW264.7細(xì)胞炎癥的結(jié)果一致。

綜上所述,牡蠣活性肽可以提高RAW264.7巨噬細(xì)胞的吞噬能力,并提高了巨噬細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-10分泌水平以及相應(yīng)的mRNA表達(dá)量。提示OP可恢復(fù)巨噬細(xì)胞Th1/Th2免疫平衡,起到一定的免疫保護(hù)作用,并且其影響機(jī)制可能與NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)。