施 樹(shù)，羅 章

（1.重慶旅游職業(yè)學(xué)院，重慶 409000；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000）

傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜的制作已有數(shù)千年的歷史[1]，是我國(guó)勞動(dòng)人民為了延長(zhǎng)蔬菜貯藏期，不斷在實(shí)踐中摸索出的制作加工技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)的結(jié)晶。發(fā)酵蔬菜所用的原料和發(fā)酵方法各地略有不同，但其制作的原理都是利用微生物的發(fā)酵作用，使蔬菜得以貯藏的同時(shí)，也賦予其脆嫩酸爽的口感和風(fēng)味。

1 傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜的制作方法

傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜的制作方法大致可以分為固態(tài)發(fā)酵法和液態(tài)發(fā)酵法。固態(tài)發(fā)酵一般的做法是：以廣口的缸作為器具，剔除菜根、損傷、腐爛、萎蔫、有病蟲(chóng)害的部分，將蔬菜清洗干凈，分切或不分切，放入清洗干凈的缸中，每放一層蔬菜，在其表面均勻撒適量的鹽，最后用石頭將蔬菜壓緊，用塑料膜封住缸口發(fā)酵。例如，北方酸菜、酸豇豆等。液態(tài)發(fā)酵即泡制法，用專(zhuān)門(mén)的泡菜壇子作為器具，將蔬菜沒(méi)入其中浸泡發(fā)酵?？膳葜频氖卟酥T多，如芹菜、蘿卜、豇豆、辣椒、黃瓜等。一般的做法是：剔除菜根部、損傷、腐爛、萎蔫、有病蟲(chóng)害的部分，清洗干凈，分切或不分切。泡菜壇子清洗干凈，倒入含一定濃度食鹽的涼開(kāi)水，將蔬菜浸泡其中。也可往其中加入適量老泡菜水和一些辣椒、姜、蒜、花椒、白酒、白砂糖等輔料。蓋上蓋子，壇口邊緣撒鹽，水封發(fā)酵，如四川湖南等地的泡菜。

2 傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜中的微生物

傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜是混菌發(fā)酵的產(chǎn)物，其中的微生物種類(lèi)繁多。張璐璐[2]分析采集于廣西、四川和貴州的酸菜中的微生物顯示，主要有乳桿菌屬（Lactobacillus），片球菌屬（Pediococcus），明串珠菌屬（Leuconostoc）、魏斯氏菌屬（Weissella） 和乳球菌屬（Lactococcus），優(yōu)勢(shì)菌種為耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）。孟霞等人[3]對(duì)發(fā)酵過(guò)程中青菜泡菜樣品中真菌的多樣性進(jìn)行研究表明，發(fā)酵中期優(yōu)勢(shì)菌是德巴利酵母屬（Debaryomyces），在發(fā)酵第15 天畢赤酵母屬（Pichia） 為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，發(fā)酵第81 天奧默兒玉氏酵母（Kodamaea ohmeri） 為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。Zhou Q 等人[4]研究了東北酸菜中細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化：乳酸桿菌、明串珠菌屬和腸桿菌是自然發(fā)酵酸菜不同發(fā)酵期的主要微生物。Xiao Y S 等人[5]分析泡菜發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性，共鑒定出90 種細(xì)菌和135 種真菌，發(fā)酵起始主要是環(huán)境微生物（如微球菌科），然后是以明串珠菌科為主的異型乳酸發(fā)酵階段，最后是以乳酸桿菌科為主的同型乳酸發(fā)酵階段。朱琳等人[6]對(duì)蘿卜泡菜發(fā)酵液中細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究顯示，優(yōu)勢(shì)菌屬依次分別是明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella） 和片球菌屬（Pediococcus） 等。韓俊燕等人[7]對(duì)發(fā)酵辣椒中的微生物分析顯示，剁辣椒中主要的菌屬是魏斯氏菌、明串珠菌和乳桿菌，乳桿菌（61.5%） 和片球菌（28.6%） 是酸辣椒中主要的細(xì)菌，腌辣椒中乳桿菌的豐度達(dá)到79.4%，辣椒醬中主要的微生物魏斯氏菌（40.7%） 和乳桿菌（11%）。劉長(zhǎng)根[8]對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的乳酸菌多樣性進(jìn)行分析顯示，泡菜中乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬及片球菌屬是主要菌屬，植物乳桿菌和短乳桿菌是主要菌種，北方酸菜中主要菌屬是乳酸桿菌屬、片球菌屬及魏斯氏菌屬，主要菌種是植物乳桿菌、短乳桿菌、棒狀亞乳桿菌及小片球菌，辣白菜中乳酸菌屬主要為乳酸菌桿菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬及魏斯氏菌屬，主要乳酸菌種為植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、清酒乳桿菌、短乳桿菌、彎曲乳桿菌及乳酸桿菌亞種。顏娜等人[9]對(duì)恩施地區(qū)酸蘿卜中細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus），平均相對(duì)含量是55.76%。向凡舒等人[10]對(duì)建始地區(qū)泡酸豇豆水中細(xì)菌多樣性研究發(fā)現(xiàn)，主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus） 及明串珠菌屬（Leuconostoc），乳酸桿菌是泡酸豇豆水中的優(yōu)勢(shì)菌，主要以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） 為主。郭倩倩等人[11]對(duì)晴隆酸菜中微生物進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，總發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌屬為5 個(gè)細(xì)菌屬，9 個(gè)真菌屬，發(fā)酵末期主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬依次分別是魏斯氏菌屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）。Yang X Z 等人[12]對(duì)取自3 個(gè)不同家庭自然發(fā)酵的東北酸菜分析表明，厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)是優(yōu)勢(shì)門(mén)，魏斯氏菌屬是所有樣本中最豐富的屬，1 號(hào)酸菜中發(fā)現(xiàn)較多的梭狀芽胞桿菌，2 號(hào)酸菜中發(fā)現(xiàn)較多的梭菌和腸桿菌，3 號(hào)酸菜中乳酸桿菌的相對(duì)豐度較高。任亭等人[13]研究了涪陵泡青菜頭細(xì)菌的多樣性顯示，在發(fā)酵的前期有假單胞菌（Pseudomonadaceae）、腸桿菌（Enterobacteriaceae） 及歐文氏菌（Erwinia） 等變形菌門(mén)菌群存在，后期優(yōu)勢(shì)菌屬是片球菌屬（Pediococcus）。

3 益生菌及篩選

聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織與世衛(wèi)組織（FAO/WHO） 聯(lián)合工作組定義益生菌為“當(dāng)給予合適數(shù)量的活的菌時(shí)，會(huì)給宿主帶來(lái)健康益處”[14]。由此可以看出，作為益生菌應(yīng)滿(mǎn)足5 個(gè)條件：①活的菌；②合適的數(shù)量；③對(duì)人體是安全的；④在人體內(nèi)能夠存活并定殖；⑤對(duì)人體健康具有一定的功效。目前，已研究的具有益生功能的菌主要是一些乳酸菌、非乳酸菌類(lèi)的細(xì)菌和酵母[15]。乳酸菌不是一個(gè)系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)上的概念，是指發(fā)酵糖類(lèi)物質(zhì)主要生成的產(chǎn)物是乳酸的一類(lèi)細(xì)菌的總稱(chēng)[16]。

可用于保健食品中的益生菌見(jiàn)表1[17]。

表1 可用于保健食品中的益生菌

傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜制品中主要優(yōu)勢(shì)菌群是乳酸菌，是經(jīng)過(guò)人們長(zhǎng)期食用歷史所驗(yàn)證安全的。以此為來(lái)源，分離篩選具有益生功能的乳酸菌、研制有益于人體健康的益生菌制品是研究的熱點(diǎn)之一。

一般采用改良后的MRS 培養(yǎng)基來(lái)分離乳酸菌，在MRS 瓊脂培養(yǎng)基中加入2%左右的碳酸鈣[18-20]，或者添加一定量的溴甲酚綠[21]，然后采用平板劃線法純化。對(duì)純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，保留革蘭氏陽(yáng)性菌再對(duì)其做過(guò)氧化氫試驗(yàn)，篩選過(guò)氧化氫試驗(yàn)陰性的菌株初步判定為乳酸菌，對(duì)其進(jìn)行純化后保存?zhèn)溆肹25]。益生性乳酸菌的篩選主要是考慮其安全性、耐酸、耐膽汁、黏附能力、對(duì)條件致病菌的拮抗活性、發(fā)酵能力和益生功能[23]。

4 傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜源益生菌的抗氧化性能

活性氧（Reactive oxygen species，ROS） 和活性氮（Reactive nitrogen species，RNS） 是好氧生物正常的代謝產(chǎn)物[24]。適當(dāng)水平的ROS/RNS 對(duì)于入侵微生物的免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊起著關(guān)鍵作用[25]。機(jī)體在正常情況下，氧化物水平是處于動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)促氧化成分與機(jī)體內(nèi)抗氧化成分之間的平衡被打破，向著有利于氧化物積累的方向轉(zhuǎn)變被稱(chēng)為“氧化應(yīng)激”[26]。此時(shí)，過(guò)量的氧化物會(huì)與體內(nèi)的酶、蛋白質(zhì)及核酸等物質(zhì)發(fā)生一系列反應(yīng)，導(dǎo)致如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、缺血、溢血、糖尿病、急性呼吸窘迫綜合征、病理性肺纖維化、慢性阻塞性肺病、哮喘、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥等疾病的發(fā)生[27]，有必要通過(guò)攝入外源抗氧化劑來(lái)減少氧化應(yīng)激。益生菌被確立為膳食輔助劑，具有多種有益特性，似乎部分與其抗氧化特性有關(guān)。找到潛在的具有抗氧化特性及對(duì)人體健康有益的益生菌菌株，已經(jīng)成為人們研究的興趣所在。體外和體內(nèi)研究表明，益生菌表現(xiàn)出抗氧化潛力。單獨(dú)食用益生菌或補(bǔ)充益生菌的食物可以減少氧化損傷[28]。益生菌抗氧化活性的潛在機(jī)制可能是通過(guò)清除ROS、螯合金屬離子、增加抗氧化酶水平和調(diào)節(jié)微生物群來(lái)發(fā)揮抗氧化作用[29]。

白明等人[30]比較乳桿菌、乳酸乳球菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的抗氧化活性顯示，乳酸乳球菌清除自由基的能力最強(qiáng)，嗜熱鏈球菌次之，而乳桿菌和雙歧桿菌對(duì)自由基的清除能力最弱，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD） 對(duì)益生菌的抗氧化起主要作用，谷胱甘肽（Glutathione，GSH） 的存在因種屬和菌株的不同而差別較大，總巰基化合物（Total thiol groups，TTG） 對(duì)益生菌的抗氧化起了積極作用。Amaretti A 等人[31]對(duì)34 株乳酸菌（7 株雙歧桿菌、11 株乳酸桿菌、6 株乳球菌和10 株嗜熱鏈球菌） 進(jìn)行體外抗氧化活性測(cè)定表明，當(dāng)劑量至少為108CFU/d 時(shí)，抗氧化劑混合物有效地減少了阿霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，這些益生菌菌株可能有助于預(yù)防和控制與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病。Paulina K 等人[32]研究了益生菌干酪乳桿菌與益生菊粉對(duì)人體血漿的抗氧化能力，結(jié)果顯示，含有干酪乳桿菌（4×108CFU）與益生菊粉（400 mg） 可對(duì)人血漿抗氧化能力和所選抗氧化酶的活性產(chǎn)生積極影響。Jang H J 等人[33]研究表明，從泡菜中分離出活的或熱殺死的植物乳桿菌Ln1 可能作為有用的抗氧化劑益生菌。Javad H 等人[34]對(duì)醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)分析，表明益生菌和合生素補(bǔ)充可以提高抗氧化能力，增加體內(nèi)抗氧化酶的數(shù)量。盧佳音[35]從東北傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸菜篩選出5 株乳酸菌，具有不同的抗氧化能力，完整細(xì)胞懸液的羥自由基清除能力、DPPH（1,1- 二苯基-2- 三硝基苯肼） 自由基清除能力、還原力均高于無(wú)細(xì)胞提取物。Yang S J 等人[36]評(píng)估了從泡菜中分離的植物乳桿菌200655 的抗氧化作用，其在DPPH 和ABTS（2,2,-聯(lián)氮- 雙-3- 乙基苯并噻唑啉-6- 磺酸） 自由基清除和β - 胡蘿卜素漂白試驗(yàn)中顯示出最高的抗氧化效果。王晶晶[37]對(duì)傳統(tǒng)自然發(fā)酵剁椒抗氧化規(guī)律進(jìn)行了研究，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，剁辣椒呈現(xiàn)出較佳的抗氧化能力，發(fā)酵前9 d 其對(duì)DPPH 自由基清除的能力呈增強(qiáng)的趨勢(shì)最為明顯，發(fā)酵第9 天后上升趨勢(shì)趨于平緩。羅瀟[38]研究顯示，傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的抗氧化能力隨著發(fā)酵時(shí)間逐步增強(qiáng)，SOD 活性、還原力、DPPH 自由基清除率均在第7 天達(dá)到最大值。夏海燕等人[39]從酢辣椒篩選出短乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力較強(qiáng)。黃承敏[40]從自然發(fā)酵剁辣椒中分離得到植物乳桿菌Y-20，研究其所產(chǎn)胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS） 的體外抗氧化活性，結(jié)果表明EPS 對(duì)DPPH、羥基自由基、超氧陰離子均具有清除功能。Zer C 等人[41]研究了韓國(guó)泡菜（Kimchi，KM）、德國(guó)酸菜（Sauerkraut，SK） 和酸大白菜（Pickled cabbage，PC） 的抗氧化性能，KM、SK 和PC 的80%乙醇提取物具有較高的DPPH 清除活性。孫寧等人[42]從自然發(fā)酵酸筍中篩選出4 株短乳桿菌和2 株消化乳桿菌，對(duì)DPPH 自由基清除率、ABTS 自由基清除率、還原能力均比較強(qiáng)，這6 株乳酸菌具備優(yōu)良的益生性能和體外抗氧化活性。Kim K T 等人[43]研究評(píng)估乳酸菌菌株的益生菌特性和抗氧化活性，從泡菜中分離的短乳桿菌KU15147 的抗氧化活性高于其他測(cè)試菌株，其誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和腫瘤壞死因子- α 的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度高于其他菌株，表明該菌株可以作為一種新型益生菌菌株應(yīng)用于保健食品或制藥行業(yè)。解文利[44]對(duì)從貴州、吉林兩地具有代表性的發(fā)酵蔬菜中分離到的乳酸菌菌株進(jìn)行體外抗氧化活性評(píng)估，貴州組乳酸菌對(duì)ABTS 自由基清除、DPPH 自由基清除、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力整體高于吉林組。胡蝶等人[45]從泡菜汁中分離得到清酒乳桿菌、腸膜明串珠菌和彎曲乳桿菌，彎曲乳桿菌的還原能力都優(yōu)于另外兩株菌，腸膜明串珠菌的DPPH清除能力最強(qiáng)。解文利等人[46]從泡菜中分離出的6 株植物乳桿菌，對(duì)其體外抗氧化活性研究表明，在6 株植物乳桿菌對(duì)ABTS 和DPPH 自由基清除作用中，發(fā)酵上清液組的清除率均高于完整細(xì)胞組和無(wú)細(xì)胞提取物組。Kim S 等人[47]研究了來(lái)自15 種食品中細(xì)菌菌株的無(wú)細(xì)胞上清液（Cell-free supernatant，CFS）的抗氧化活性，結(jié)果表明乳酸菌通過(guò)清除DPPH 和ABTS 自由基來(lái)緩解氧化應(yīng)激，抑制了NO 的產(chǎn)生，并降低了脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS） 活化RAW264.7 細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS） 和環(huán)氧化酶（Cyclooxygenase 2，COX-2） 的水平，試驗(yàn)菌具有被用作益生菌和抗氧化功能食品的強(qiáng)大潛力。

5 結(jié)語(yǔ)

諸多研究顯示益生菌具有抗氧化特性，對(duì)改善氧化應(yīng)激、減少機(jī)體被氧化、防止疾病和延緩衰老、保持機(jī)體健康具有重要意義。傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜制品已經(jīng)被人們長(zhǎng)期食用，安全性得以保證。這些發(fā)酵制品中含有大量的各種潛在的益生功能微生物。從中篩選具有發(fā)酵能力強(qiáng)，適應(yīng)胃腸道環(huán)境，能在腸道中定殖，具有良好益生功能和抗氧化特性的微生物作為益生菌，開(kāi)發(fā)對(duì)健康有益的益生菌食品或者藥品，改善人體健康具有重要意義。