趙志斌 董 睿 李偉紅 張玥琦 鞠申丹*

1.海軍軍醫(yī)大學中醫(yī)系針灸推拿學教研室，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200433；3.上海市黃浦區(qū)外灘街道社區(qū)衛(wèi)生服務中心，上海 200001

針灸治療各類疾病的作用機制一直是學術界討論的熱點。近年來，有越來越多的動物試驗都將瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)作為研究針灸治療作用機制的新靶點。TRP通道是存在于人體組織細胞膜上的一組非選擇性陽離子通道，對鈣離子和其他陽離子都具有通透性，但絕大部分還是鈣離子[1]。根據(jù)同源性分類它包括TRPC、TRPV、TRPML、TRPP、TRPA、TRPM及TRPN等7個亞家族。其中又由于瞬時受體電位香草酸亞家族(transient receptor potential vanilloid，TRPV)通道中的TRPV1、TRPV2、TRPV4等在炎性疼痛、內(nèi)臟痛以及痛覺敏化中發(fā)揮著重要作用而被研究者采納并進行廣泛研究。目前認為，TRPV亞家族中的成員可以被辣椒素、4α-PDD和花生四烯酸代謝產(chǎn)物、熱以及機械刺激所激活，并參與到機體的抗炎反應中去[2]。這也被認為是闡釋針灸作用機制的一種途徑。廣義的針灸療法包括針刺(電針、皮膚針、頭針、腕踝針、火針等)、拔罐刮痧(刺絡放血)、艾灸(溫和灸、雀啄灸、熱敏灸)、敷貼療法(臍療)等多種治療方法，所以有不少動物實驗進行了各種針灸療法對于TRPV亞家族的調(diào)節(jié)來研究針灸的作用機制，其中尤以疼痛模型的研究較多。本文對該種療法治療不同疼痛模型動物試驗中TRPV亞家族蛋白表達量的影響進行系統(tǒng)評價，旨在拓展針灸療法治療各類疾病機制的證據(jù)，為后期研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 檢索策略 兩名研究人員通過計算機檢索PubMed、Embase、Web of Science、CNKI、Wanfang數(shù)據(jù)庫并且進行手工檢索圖書館管目錄，查找電針、灸法、貼敷相關療法影響TRPV表達量的相關動物實驗。中文檢索式為(針刺or電針or艾灸or針灸)and TRPV and動物；英文檢索式為(acupuncture or moxibustion or massage)and TRPV and animal。見框1。

1.2 納入標準與排除標準

1.2.1 研究對象 不同疼痛類型的動物模型鼠(大鼠、小鼠)。

1.2.2 結局指標 不同組織中TRPV家族各成員的表達量。

框1 pubmed主題詞檢索策略

1.2.3 納入標準 ①與針刺、艾灸、針灸相關以及與TRPV相關的研究；②設置干預組和對照組；③有相關表達量數(shù)據(jù)。

1.2.4 排除標準 ①不相關文獻；②相關的綜述類文獻；③未設置對照組；④無相關表達量數(shù)據(jù)。

1.3 文獻納入篩選 由兩位獨立研究者嚴格按照納入和排除標準對文獻進行篩選并提取資料，通過文獻管理軟件Endnote7進行文獻導入，通過標題的瀏覽初步篩除綜述、明顯不符合納入標準的文獻；隨后閱讀摘要剔除文獻中的隨機或者對照組設置不符合納入標準的文獻，將剩余文獻下載全文，無法獲取全文的通過郵件與作者聯(lián)系獲取全文，仔細閱讀，比對納入標準，通過篩選確定最后納入文獻。然后兩名研究者交叉核對，如遇到分歧則交由第三方解決，如遇資料缺如則聯(lián)系文獻作者或通訊作者咨詢。

1.4 資料提取 采用Excel表格設計文獻資料的提取。提取的數(shù)據(jù)信息中包括：作者、發(fā)表年份、研究對象、干預措施、檢測方法、指標、試驗組和對照組的樣本量、均值、標準差和其它信息等。

1.5 納入研究的偏移風險評估 SYRCLE動物實驗偏倚風險評估工具是目前唯一專門用于評估動物實驗固有真實性的工具，它避免了在評估偏差風險時系統(tǒng)評估動物干預所產(chǎn)生的差異。評估由兩名研究人員獨立進行，然后進行檢查。如有異議，可與第三方進行討論或協(xié)商。評估的結果以“是(Y)”“否(N)”以及“不確定(U)”來代表低風險偏倚、高風險偏倚以及不確定風險偏倚。

1.6 統(tǒng)計分析 采用Revman 5.0軟件進行Meta分析。采用表達倍數(shù)和樣本量計算效應量，采用Z檢驗分析研究結果間的異質性，當I2<50%時，異質性較小，當I2>50%時，異質性較大，采用隨機效應模型進行合并分析，并采用亞組分析解釋異質性來源。采用Begg’s漏斗圖檢驗發(fā)表偏倚。Meta分析的檢驗水準為α=0.05。

2 結果與分析

2.1文獻檢索結果 一共檢索到了121篇中文文獻和55篇英文文獻，根據(jù)標題和摘要初篩剔除后還有28篇文獻，通過全文瀏覽最后是納入18項[3-20]研究。文獻篩選流程和結果圖如圖1所示。

圖1 文獻篩選流程及結果圖

2.2 納入研究的基本特征 本研究共納入18篇文獻；納入研究的動物模型主要以炎性疼痛、神經(jīng)病理性痛癥為主，干預措施包括針刺(手針和電針)、艾灸(隔藥灸、溫和灸)等針灸相關治療方法。納入研究的基本特征見表1。

表1 納入研究的基本特征表

2.3 納入研究的偏倚風險評估 偏倚評估說明：SYRCLE動物偏見風險評估工具由10個項目組成，如果沒有在研究中提到，所有這些項目都被評為不確定偏倚風險。其中，一般資料的基線水平根據(jù)動物鼠的性別、年齡、飼養(yǎng)環(huán)境3個方面進行評估，如果有1項信息缺失則評委“不確定”。詳見表2。

表2 文獻偏倚評估表

2.4 Meta分析

2.4.1 TRPV的整體表達量 干預組相較于對照組TRPV的表達量下降(SMD=-2.28，95%CI=-2.95～-1.61，P<0.01；異質性χ2=404.04，I2=90%，隨機效應模型)。如圖2所示。

2.4.2 TRPV1的表達量 TRPV1干預組相較于對照組TRPV1的表達量下降(17篇文獻)(SMD=-1.77，95%CI=-2.53～-1.01，P<0.01；異質性χ2=230.63，I2=89%，隨機效應模型)。如圖3所示。

2.4.3 TRPV2的表達量 TRPV2干預組相較于對照組TRPV2的表達量下降(2篇文獻)(SMD=-13.50，95%CI=-24.72～-2.29，P<0.00001；異質性χ2=32.33，I2=94%，隨機效應模型)。如圖4所示。

圖4 TRPV2的表達量圖

2.4.4 TRPV4的表達量 TRPV4干預組相較于對照組TRPV4的表達量下降(6篇文獻)。(SMD=-2.68，95%CI=-4.03～-1.33，P<0.01；異質性χ2=97.28，I2=89%，隨機效應模型)。如圖5所示。

圖5 TRPV4的表達量圖

2.4.5 亞組分析 所有數(shù)據(jù)合并后顯示異質性較大，故須探究異質性來源，根據(jù)可能的因素，產(chǎn)生異質性的原因包括不同的檢測方法、不同的動物模型、不同的干預措施，故根據(jù)以上因素進行亞組分析。

2.4.5.1 不同檢測方法 采用western blot檢測法進行檢測，結果：SMD=-2.72，95%CI=-3.85～-1.59，P<0.01；異質性χ2=127.44，I2=88%，隨機效應模型，采用PT-PCR檢測法進行檢測，結果SMD=-1.63，95%CI=-2.47～-0.79，P<0.00001；異質性χ2=28.84，I2=76%，隨機效應模型，采用免疫組化檢測法，結果：SMD=-2.46，95%CI=-3.71～-1.21，P<0.01；異質性χ2=245.32，I2=93%，隨機效應模型。三組亞組分析顯示，無論何種檢測方法都顯示針灸治療能夠降低TRPV的表達。三組亞組異質性檢驗(test for subgroup differences：Chi2=2.66df=2(P=0.26)，I2=24.9%)

2.4.5.2 不同干預方法 電針治療法結果：SMD=-1.93，95%CI=-2.54～-1.32，P<0.01；異質性χ2=150.09，I2=83%，隨機效應模型，間接灸法進行干預，結果：SMD=-3.63，95%CI=-5.42～-1.84，P<0.01；異質性χ2==101.38，I2=91%，隨機效應模型，隔物灸進行干預，結果：SMD=-370，95%CI=-7.11～-0.30，P<0.01；異質性χ2==114.91，I2=96%，隨機效應模型，三組亞組異質性檢驗[Test for subgroup differences：Chi2=3.93，df=2(P=0.14)，I2=49.1%]。

2.4.5.3 不同動物模型 在神經(jīng)病理性疼痛模型中，結果SMD=-1.33，95%CI=-2.16～-0.50，P<0.01；異質性χ2=152.86，I2=87%，隨機效應模型；在癌性疼痛模型中，結果SMD=-5.87，95%CI=-17.51～-5.77，P>0.01；異質性χ2==21.61，I2=95%，隨機效應模型；在炎癥疼痛模型中，結果SMD=-3.44，95%CI=-4.55～-2.32，P<0.01；異質性χ2==219.60，I2=91%，隨機效應模型；三組亞組異質性檢驗[Test for subgroup differences：Chi2=9.21，df=2(P=0.77)，I2=78.3%]。

2.5 發(fā)表偏倚 漏斗圖分析顯示，研究存在發(fā)表偏倚。如圖6所示。

圖6 漏斗圖

3 討論

針灸在臨床上運用廣泛，尤其是在治療各種類型的疼痛疾病中效果突出，如腰突癥、急性胃痛、偏頭痛等。針灸在鎮(zhèn)痛方面是確實有效的，但是針灸鎮(zhèn)痛的機制仍然不是十分明確。

通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)，針灸能夠調(diào)節(jié)TRPV的通道的活性，可能是針灸鎮(zhèn)痛的機制之一。目前研究[21]表明TRPV通道亞家族成員均能響應各種理化刺激，作為感受器參與各種傷害后的反應，因此，TRPV通道被認為是參與疼痛反應中的重要環(huán)節(jié)之一，也是近年來的研究熱點。TRPV家族是哺乳動物溫度感受密切相關的離子通道，其中TRPV1通道參與溫度感受、鈣穩(wěn)態(tài)、細胞增殖、分化和凋亡等過程。TRPV1通道響應多種傷害性刺激而參與痛覺感知。TRPV4能夠介導多種原因導致的機械痛和熱敏痛；而溫度和電刺激能夠直接調(diào)節(jié)TRPV1通道與TRPV4通道的活性。電針或者艾灸能夠通過溫熱效應或者電刺激降低TRPV通道的活性提高痛閾而具有預防多種疼痛的效應。為了證實針灸對于TRPV通道的調(diào)控，筆者進行文獻篩選，納入符合標準的文獻進行Meta分析，來進一步研究針灸與TRPV亞家族的關系，為針灸鎮(zhèn)痛的機制提供循證醫(yī)學證據(jù)。

3.1 針灸能夠降低疼痛疾病中的TRPV通道活性 本次共納入文獻的18篇，包括4篇英文文獻，14篇中文文獻，都采取了隨機對照實驗，都未提及盲法的使用，18篇文獻分別測量了TRPV家族不同蛋白的表達。筆者將18篇文獻數(shù)據(jù)提取出來，通過Meta分析發(fā)現(xiàn)，針灸療法對于TRPV家族的表達下降，有統(tǒng)計學意義(SMD=-2.28，95%CI=-2.95～-1.61)，并且針灸治療方法降低包括TRPV1通道(SMD=-1.22，95%CI=-1.46～-0.98，P<0.01)、TRPV4通道(SMD=-1.34，95%CI=-1.74～-0.93，P<0.01)和TRPV2通道(SMD=-6.13，95%CI=-7.75～-4.50，P<0.00001)的活性亦有統(tǒng)計學意義。

針灸鎮(zhèn)痛的可能機制包括減少致痛物質的表達[22]，而TRPV是重要的致痛物質之一，本研究也證實了針灸，無論電針亦或者是艾灸(溫和灸、隔物灸)均能夠降低TRPV家族痛的活性，這也在動物實驗方面提供了針灸通過降低TRPV痛的活性而改善疼痛效應的證據(jù)。尤其是研究較多的TRPV1和TRPV4。

3.2 TRPV通道與多種疾病相關 TRPV1與心血管疾病、高血壓、癌癥、消化系統(tǒng)疾病息息相關[23]；TRPV2在維持心臟的結構與功能中意義重大，TRPV2基因敲除小鼠會出現(xiàn)心力衰竭[24-25]，TRPV3與皮膚的生理病理密切相關，介導皮膚疼痛、瘙癢等感覺的信號傳導，影響角質細胞的增殖分化和毛囊發(fā)育的生理過程[26-28]；TRPV4參與骨骼生長過程中的機械傳導、血管舒張和血壓調(diào)節(jié)過程。TRPV亞家族與人體諸多疾病相關，而各種疾病的病理改變皆會引起不同程度的疼痛，如胃痛、偏頭痛、骨骼肌肉疼痛。所以針灸鎮(zhèn)痛作用與調(diào)節(jié)TRPV亞家族的通道的活性存在相關性。本研究發(fā)現(xiàn)，針灸治療能夠降低TRPV亞家族TRPV4、TRPV1和TRPV2的活性，而TRPV亞家族蛋白可能作為致痛因素的一個重要環(huán)節(jié)成為針灸鎮(zhèn)痛的靶點之一。

3.3 針灸治療急性疼痛效果較好 針灸療法在癌痛的Meta分析顯示，SMD=-5.87，95%CI=-17.51～-5.77，P>0.01，通過兩篇文獻的Meta分析，筆者發(fā)現(xiàn)針灸治療在癌痛的緩解上，TRPV的降低，無統(tǒng)計學意義，說明針灸在癌痛的治療上未能降低TRPV通道的活性。臨床上也發(fā)現(xiàn)，針灸對于如炎性疼痛或者神經(jīng)病理性疼痛的急性疼痛效果較好，而癌痛為慢性疼痛，針灸效果不明顯。對于長時間的疼痛，在TRPV通道的調(diào)節(jié)上，針灸存在一定的局限性，這也提示針灸具有耐受性，對于初次接受針灸鎮(zhèn)痛效果較好。

3.4 異質性來源 可能18篇文獻的異質性較高(χ2=404.04，I2=90%)，為了探究異質性來源，筆者進行了進一步的數(shù)據(jù)分析，根據(jù)可能的異質性來源，進行了亞組分析，來挖掘原因。

根據(jù)不同的檢測方法，分為3個亞組，通過亞組分析，筆者發(fā)現(xiàn)，無論何種檢測方法下，針灸對于TRPV的表達下降都有統(tǒng)計學意義，并且組間異質性降低[(Test for subgroup differences：Chi2=2.66df=2(P=0.26)，I2=24.9%]。而據(jù)不同的干預方式，分為3個亞組，分別為電針組、間接灸組和隔物灸治療組，3種干預方式法對于TRPV的表達下降具有統(tǒng)計學意義。并且在亞組間的異質性檢驗中，3組之間的異質性出現(xiàn)降低[Chi2=3.93，df=2(P=0.14)，I2=49.1%]。根據(jù)不同的動物模型分組，無論是炎性疼痛還是神經(jīng)病理性疼痛，TRPV的表達下降都具有統(tǒng)計學意義，而癌性疼痛亞組中，針灸對于TRPV表達無統(tǒng)計學意義。3組間的組間異質性較大[Chi2=9.21，df=2(P=0.77)，I2=78.3%]。從亞組分析，不同的檢測方法能夠消除組間異質性，故認為異質性來源可能是檢測方式的不同，導致最后得出的數(shù)據(jù)出現(xiàn)了異質性。

從目前的證據(jù)分析來看，針灸療法中溫針、電針、艾灸療法能夠降低動物模型中的TRPV1、TRPV4的表達，而TRPV2、TRPV3的表達研究文獻比較少，還不能夠支持針灸治療能夠有效降低這兩種蛋白的表達的說法；而根據(jù)敏感性分析，TRPV3的文獻僅有一篇，而本文獻對于Meta分析的結果沒有影響，說明針灸療法的能夠降低TRPV家族的活性。從文獻搜索來看，TRPV1和TRPV4是目前疼痛疾病研究的靶點之一。也是研究熱點，而針灸療法目前在臨床上較多用于鎮(zhèn)痛的治療，TRPV家族離子通道的活性影響致痛物質的釋放，而針灸治療能夠調(diào)節(jié)TRPV的活性，從而起到鎮(zhèn)痛的作用。在文獻篩選的過程中，筆者發(fā)現(xiàn)有文獻研究灸法治療肛門瘙癢小鼠的模型，檢測TPRV1的表達，而TRPV3與皮膚生理病理密切相關，并且介導瘙癢感覺信號的傳導，故考慮文獻測量指標出現(xiàn)偏差故未納入，根據(jù)亞組分析的異質性檢驗，考慮異質性可能來源于針灸療法中不同的檢測和不同的動物模型之間的差異。

3.5 針灸對TRPV1、TRPV4調(diào)節(jié)影響較大 本次研究中所述的TRPV家族于1997年首次被報道[29]。TRPV家族中被研究較多的TRPV1和TRPV4通道，兩者都與鈣離子內(nèi)流有關。關于針灸對于TRPV的動物實驗研究，也證實了TRPV1的研究最多，其次是TRPV4。通過Meta分析結果，也發(fā)現(xiàn)兩者的研究結果數(shù)據(jù)中的可信區(qū)間范圍較TRPV2小，所以針灸對TRPV1和TRPV4的調(diào)節(jié)占主要作用，而TPRV2的研究較少，并且可信區(qū)間范圍較大，從而說明針灸對于TRPV2的調(diào)節(jié)可能不是主要作用。TRPV1通道激活后，鈣離子大量內(nèi)流，引起一系列細胞內(nèi)信號通路被激活，TRPV4也可直接介導細胞鈣離子的內(nèi)流，通過影響膜電位和鈣離子內(nèi)向驅動力等間接參與鈣離子的內(nèi)流[30]，這兩種蛋白在疼痛的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用[31]。炎癥反應過程中產(chǎn)生的蛋白酶、5-羥色胺、組胺、TNF-α、IL-17等可以通過促進TRPV4向質膜轉移、磷酸化以及產(chǎn)生內(nèi)源性TRPV4激動劑等方式使免疫細胞上TRPV4表達增加或功能增強[32]。細菌表面的脂多糖(LPS)也被證實可直接激活TRPV4[33]。所以針灸鎮(zhèn)痛機制主要與TRPV1和TRPV4通道調(diào)節(jié)相關。

4 研究展望

所納入文獻動物模型可以分為炎性疼痛的模型(大多數(shù)與腸道疾病有關)，以及神經(jīng)病理性疼痛(與脊柱骨關節(jié)相關)，針灸鎮(zhèn)痛的靶點也主要與TRPV1和TRPV4的調(diào)節(jié)相關。而TRPV1廣泛分布于三叉神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)等神經(jīng)組織中以及腸胃、骨骼肌肉中；TPRV4也在皮膚、腎臟、肺、脾臟多個組織器官中表達，這也與疼痛產(chǎn)生的位置相同。通過不同TPRV亞家族的分析，筆者發(fā)現(xiàn)針灸主要影響TRPV1和TRPV4通道。TRPV1通道一直是開發(fā)治療疼痛新藥物的主要TRP通道。很多前期臨床研究[34]表明，不同類別的TRPV1通道拮抗劑如AMG-517、AZD1386，均會使體溫升高，而這種不良反應是阻礙其臨床發(fā)展的最主要原因[34]。而針灸沒有此副作用，所以可以替代藥物作為TRPV1鎮(zhèn)痛的方法之一。

綜上，通過大量搜索針灸療法在動物實驗中的研究，在各類疾病中與研究中，針灸鎮(zhèn)痛的效果較好，而Meta分析結果顯示針灸能夠降低TRPV亞家族的活性，給針灸療法鎮(zhèn)痛機制提供新的依據(jù)，并且其中占主要影響的是TRPV1和TRPV4通道；同時發(fā)現(xiàn)針灸也可用于其他疾病的治療例如瘙癢以及血脂的調(diào)節(jié)[35-36]，但是研究的靶點可能出現(xiàn)異質性。所以，可以通過另外的研究分析給針灸治療疾病提供更多思路，并且可以找尋新的TRPV1和TRPV4上下游信號通路來進一步研究針灸鎮(zhèn)痛和治療疾病的機制。

由于本次納入的文獻都是動物實驗，尚不能評價針灸治療疼痛的真正機制，但是給未來的研究指明了一種可能性，由于各研究間干預方式不同，檢驗方法不同以及疼痛模型種類的差異，合并結果存在較高的異質性風險，通過敏感性分析和亞組分析，異質性未完全解決。并且在Meta分析過程中，不可回避的一個問題是發(fā)表偏移。本研究存在發(fā)表偏移，在動物實驗的過程中，實驗員盡可能會尋找陽性的結果，并且可能由于一些陰性結果沒有發(fā)表，或者在處理過程中忽略的陰性結果導致發(fā)表偏移，但是針灸療法鎮(zhèn)痛也是有大量的臨床數(shù)據(jù)得到支持的。