李文莉 朱 凱 趙 瑩 王永春 李軍鴿

長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117

加味葛根顆粒原方經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿科多年臨床應(yīng)用，療效確切，安全性高。方劑由葛根、麻黃、桂枝等九味藥組成，有解表升津、舒筋解肌之功效，主治頸椎病、項痹、筋傷[1-2]。

加味葛根顆粒原處方在臨床上主要以湯劑為主，湯劑存在攜帶不便、貯藏困難等缺點，顆粒劑具有起效迅速，攜帶、服用、貯藏均較方便，并能克服湯劑的缺點[3-6]。在保留其制備方法及藥效物質(zhì)的基礎(chǔ)上現(xiàn)進(jìn)行院內(nèi)制劑開發(fā)研究。本研究采用傳統(tǒng)的水煎煮提取方法，以出膏量和葛根素含量共同作為考察指標(biāo)，采用權(quán)法確定綜合評分，根據(jù)正交試驗，優(yōu)選出最佳的提取過程，以求結(jié)果穩(wěn)定可靠。通過觀察顆粒成型狀態(tài)、溶化性等指標(biāo)，對輔料種類及用量、潤濕劑濃度等條件進(jìn)行成型工藝考察，確定加味葛根顆粒最佳制備工藝，也為后期其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究與制劑生產(chǎn)開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC2030(日本島津公司)高效液相色譜儀；ME204E分析天平、XS105DU分析天平(METLER)；BPZ-6123LC真空干燥盒(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥與藥材 葛根素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110752-201816，純度：95.6%)，甲醇(色譜純，美國Fisher公司)，其他試劑均為分析純；經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)唐秋竹教授鑒定檢驗，葛根、麻黃、桂枝、生姜、炙甘草、芍藥、大棗、木瓜、牛膝九味中藥飲片全部合格，由吉林北藥藥材加工有限公司購進(jìn)；可溶性淀粉(安徽山河藥用輔料股份有限公司，200908)。

2 方法與結(jié)果

2.1 葛根素含量測定方法的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 取葛根素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含葛根素0.4 mg的溶液，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 樣品適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

a

a b c

2.1.3 陰性對照溶液的制備 取不含葛根的處方水提液干燥樣品，按“2.1.2”制備陰性對照溶液。

2.1.4 色譜條件 TechMate C18-ST色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相是甲醇-水(24∶76)；檢測波長為250 nm；柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL/min。

2.1.5 方法學(xué)驗證

2.1.5.1 專屬性試驗 取葛根素對照品，供試品溶液及陰性對照溶液，按2.1.4色譜條件試驗，記錄色譜圖，如圖1所示。結(jié)果，陰性無干擾。

一般地，設(shè)X0∈＜a，b＞，X∈＜c，d＞，且X0∈X，則點x關(guān)于區(qū)間X0和X組成的區(qū)間套的位置規(guī)定為:

2.1.5.2 線性考察 取葛根素對照品溶液(濃度0.0093 mg/mL、0.0186 mg/mL、0.0247 mg/mL、0.0371 mg/mL、0.0445 mg/mL、0.0928 mg/mL)各5 μL，分別注入液相色譜儀。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葛根素線性方程為：Y=0.0000002X+0.0041(r=0.9992)，表明葛根素在該范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5.3 重復(fù)性試驗 取同一供試品，按“2.1.2”制備6份供試品溶液并進(jìn)行測定，葛根素平均含量為2.59mg/g，RSD為2.26%，說明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.1.5.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1.2”項下制備供試品溶液，按“2.1.4”色譜條件，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h進(jìn)行測定，結(jié)果，葛根素含量的平均值為2.50 mg/g，RSD為1.08%，24 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.2 出膏量測定 精密量取25 mL的水提液，置一恒重蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，置干燥器中30 min放涼，計算出膏量。

2.3 提取工藝研究

2.3.1 浸泡時間及藥材吸水率考察 按處方比例取藥材3份，分別加5倍量水浸泡至透心，每隔30 min測量一次，直至藥材全部浸透，濾出全部未被吸收的水液，得藥材的吸水率，結(jié)果見表1。當(dāng)飲片浸泡1 h后，吸水量基本不變，藥材基本浸透，平均吸水量為286 mL，平均吸水率為101.42%(約飲片干重的1倍量)。由此確定，第一次煎煮需多加1倍的水，浸泡1 h后再第一次加熱提取。

表1 藥材吸水率考察結(jié)果

表2 加水量考察結(jié)果

2.3.3 提取時間的考察 稱取處方藥材282 g，4份，分別加7倍量水，第一次煎煮追加1倍量水，浸泡1 h，分別提取1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，提取2次，濾過，合并濾液，按“2.2”方法測定出膏量，取干膏粉，按“2.1”方法測定葛根素含量。結(jié)果見表3，隨著提取時間的延長，出膏量和葛根素含量呈增加趨勢，當(dāng)提取時間延長至2.5 h時，出膏量和葛根素含量與2 h相差不多，結(jié)合生產(chǎn)實際節(jié)約資源，可選擇1 h、1.5 h、2 h為正交試驗提取時間考察水平。

表3 提取時間考察結(jié)果

2.4 正交實驗設(shè)計 加水量選擇5倍藥材量、7倍藥材量、9倍藥材量三水平；煎煮時間選取1 h、1.5 h、2 h三水平；煎煮次數(shù)選擇1次、2次、3次，對三因素三水平進(jìn)行整理，見表4，以出膏量、葛根素含量為考查指標(biāo)，利用正交L9(34)設(shè)計正交實驗。按方劑配比稱取藥材282 g，共9份，第一次加水量追加1倍量，并在首次加熱提取之浸泡1 h。按照L9(34)正交表進(jìn)行水煎煮提取試驗，按“2.2”方法測定出膏量，取干膏粉，按“2.1”方法測定葛根素含量。

表4 正交試驗因素水平表

按上述公式計算出膏量(Y1)、葛根素含量(Y2)兩項指標(biāo)組合權(quán)重系數(shù)分別為0.373、0.627。綜合評分=(Y1/Y1max×0.373+Y2/Y2max×0.627)×100%。將綜合評分導(dǎo)入正交表，結(jié)果正交試驗分析結(jié)果見表5。方差分析見表6。

表5 正交實驗結(jié)果

表6 方差分析

表5分析可知，因素A(加水量)的結(jié)果為A3>A2>A1，因素B(煎煮時間)的結(jié)果為B2>B3>B1，因素C(煎煮次數(shù))的結(jié)果為C3>C2>C1；表6分析可知，A因素(加水量)和B因素(煎煮時間)沒有顯著影響，因素水平可選A3和B2，C因素水平對試驗結(jié)果有顯著的影響，C3>C2，但選C3提取周期較長，提取液過多，濃縮耗能較大，故從節(jié)能降耗方面綜合考察，對A3B2C2與A3B2C3進(jìn)行比較試驗，A3B2C2方案出膏量為73.23 g，葛根素含量為187.26 mg，A3B2C3方案出膏量為74.33 g，葛根素含量為188.54 mg。A3B2C2方案的出膏比A3B2C3方案少1.095 g，葛根素含量無明顯變化?？紤]生產(chǎn)實際情況，可以選擇C2水平，故最后選擇A3B2C2為加味葛根顆粒最佳提取工藝，即每味藥材按處方比例取藥，第一次加10倍量的水，浸泡1 h，煎煮1.5 h，濾過，第二次加9倍量水，煎煮1.5 h，濾過，濾液合并。

2.5 提取驗證工藝 取處方藥材3份，每份282 g，按確定的最佳提取工藝條件進(jìn)行提取，濃縮，干燥，考察出膏量和葛根素含量。結(jié)果見表7。三份樣品的出膏量、葛根素含量的RSD分別為1.77%、2.22%，綜合評分均較高，重現(xiàn)性良好。故確定A3B2C2為最佳提取工藝。

表7 水煎煮工藝驗證性試驗結(jié)果

2.6 成型工藝研究

2.6.1 干膏的制備 稱取處方藥材，第一次加10倍量的水，浸泡1 h，煎煮1.5 h，濾過，第二次加9倍量的水，煎煮1.5 h，濾過，合并濾液，藥液濃縮至相對密度為1.18～1.25(65 ℃)的稠膏，60 ℃減壓干燥，得干膏。

2.6.2 輔料的選擇及藥輔比的考察 制顆粒常用輔料有蔗糖、乳糖、糊精、可溶性淀粉等多種[8]，當(dāng)干膏粉分別與蔗糖和乳糖制軟材時，軟材粘性較大，不容易過篩，且不易烘干，色澤不均勻，整粒后顆粒成型性不好；干膏粉分別與糊精和可溶性淀粉制粒軟才時，軟材適中，顆粒成型性好，溶化性符合規(guī)定[9]。糊精和可溶性淀粉具有無毒、水溶性較好、成型率較高、成本較低等特點，適用人群范圍大[10]，對于加味葛根顆粒而言，可二選其一，本研究以可溶性淀粉作為加味葛根顆粒輔料。

取干膏粉3份，每份100 g，分別加入可溶性淀粉50 g、100 g、150 g，適量70%的乙醇，混勻制軟材，干燥，整粒，制粒結(jié)果如圖2，見表8，干膏粉∶可溶性淀粉為1∶1軟材適中，過篩容易，顆粒成型性好，不易結(jié)塊，色澤均一，溶化性符合要求，因此確定可溶性淀粉加入量約為干膏粉的1倍。

表8 干膏粉加可溶性淀粉制顆粒結(jié)果

2.6.3 過篩目數(shù)的考察 稱取處方藥材，按照 “2.6.1”項下的方法制備干膏，取干膏粉4份，分別加1倍可溶性淀粉，再加入70%乙醇作為潤濕劑，分別用10目、14目、18目篩制粒，干燥，整粒，記錄制粒情況及顆粒外觀。結(jié)果14目篩時，顆粒的外觀、粒徑較均勻，故選擇加味葛根顆粒過篩目數(shù)為14目。

2.6.4 潤濕劑濃度的考察 稱取處方藥材，按照“2.6.1”項下方法制備干膏，取干膏粉3份，分別加1倍可溶性淀粉，再分別加入70%、75%、80%乙醇作為潤濕劑，14目篩制粒，60 ℃鼓風(fēng)干燥，整粒，記錄制粒情況及顆粒外觀。結(jié)果各濃度乙醇潤濕劑對制顆粒影響不大，故選擇濃度較低，制粒容易、顆粒成型較好的乙醇潤濕劑濃度，根據(jù)試驗結(jié)果決定采用70%乙醇作為加味葛根顆粒的潤濕劑。

2.6.5 濕顆粒干燥溫度的確定 濕顆粒制成后應(yīng)迅速干燥，放置過久濕粒易結(jié)塊，考察80 ℃、70 ℃、60 ℃干燥溫度，結(jié)果80 ℃干燥顆粒較硬，易結(jié)塊，70 ℃和60 ℃顆粒干燥效果較好，故濕顆粒干燥溫度應(yīng)控制在60～70 ℃干燥即可。

2.7 成型工藝驗證 取處方藥材3份，按“2.5”最佳提取工藝提取，藥液濃縮至相對密度為1.18～1.25(65 ℃)稠膏，60 ℃減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，加1倍量可溶性淀粉、70%乙醇適量，混勻，14目篩制顆粒，60～70 ℃干燥，即得。成型工藝驗證結(jié)果見表9。

表9 成型工藝驗證結(jié)果

3 討論

3.1 劑型的選擇 中藥院內(nèi)制劑大多是有著多年臨床經(jīng)驗的名老中醫(yī)，經(jīng)過多年實踐總結(jié)出的療效確切的驗方[11]，還有一些是流傳幾千年的經(jīng)典名方[12]。中藥院內(nèi)制劑的研究能極大地推動我國的中醫(yī)藥事業(yè)向前發(fā)展[13-16]。加味葛根顆粒原湯劑經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院多年臨床應(yīng)用，反復(fù)實踐、對比研究，結(jié)果表明，選擇顆粒劑，既能保留原湯劑的功效，又便于患者的攜帶、服用、儲藏等。

3.2 含量測定指標(biāo)的選擇 加味葛根顆粒由九味藥材組成，處方中各藥材所含有效成分各不相同，含量指標(biāo)的選擇，應(yīng)從質(zhì)量控制的可測性和整體性考慮，從處方配伍看，首選君藥葛根，在《中國藥典》(2020年版)含量測定中測葛根素，葛根素具有抗骨質(zhì)疏松[17]、解熱鎮(zhèn)痛作用[18]、降血糖[19]、抗炎[20]等作用，故參考藥典方法測定處方中葛根素含量，結(jié)果方法簡單、可靠、易行，所得圖譜峰型好，陰性無干擾，小試試驗計算葛根素轉(zhuǎn)移率較高為30%，故將葛根素確定為有效成分的評價指標(biāo)。

3.3 提取工藝的選擇 本方原劑型為湯劑，為了最大限度地保留其功效，因此選擇傳統(tǒng)的水煎煮工藝對其進(jìn)行提取，以加水倍數(shù)、提取時間、提取次數(shù)作為考察因素，以出膏率和葛根素含量作為提取工藝的評價指標(biāo)，為了使結(jié)果穩(wěn)定，可靠，采用熵權(quán)法確定綜合評分，并根據(jù)正交試驗優(yōu)選出最佳提取工藝。正交試驗的優(yōu)點是科學(xué)性高、效果顯著、操作簡便等，廣泛應(yīng)用于中藥提取工藝的研究中[21]，根據(jù)試驗結(jié)果表明，提取次數(shù)對綜合評分影響最大，其次是加水倍數(shù)、提取時間。因此優(yōu)選出的最佳提取工藝為加9倍量水，提取兩次，每次1.5 h。

3.4 成型工藝的選擇 通過觀察顆粒成型性狀態(tài)、溶化性、休止角等指標(biāo)，對輔料種類及用量、潤濕劑濃度、過篩目數(shù)、干燥溫度等條件進(jìn)行成型工藝考察。臨床常用的輔料種類很多，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，加味葛根顆粒適宜的輔料為可溶性淀粉和糊精，對于本研究而言，選用溶解性更好的可溶性淀粉。通過試驗考察，最佳配比為干膏粉：可溶性淀粉=1∶1。

本研究為保證加味葛根顆粒提取和輔料添加的客觀準(zhǔn)確性，選用多個指標(biāo)綜合測評。優(yōu)選出最佳制備工藝為第一次加10倍量水(第一次煎煮追加1倍量水，煎煮前浸泡1 h)，第二次加9倍量水，每次1.5 h，濾過，合并煎液，濾液濃縮至相對密度為1.18～1.25(65 ℃)稠膏，60 ℃減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，加1倍量可溶性淀粉，加70%的乙醇適量，過14目篩制成顆粒，60～70 ℃干燥，整粒，即得。通過本研究優(yōu)選出的加味葛根顆粒最佳制備工藝合理、可行、穩(wěn)定，為后期顆粒的制備和生產(chǎn)提供理論依據(jù)。