于 輝 孫鵬鵬 田 真 張秀婷

1.山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，山東 威海 264200；2.山東省淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255000；3.齊魯醫(yī)藥學(xué)院，山東 淄博 255300

木芙蓉花為錦葵科、木槿屬植物落葉小喬木或灌木木芙蓉HibiscusmutabilisL.的新鮮或干燥花，又名芙蓉花、木蓮、拒霜花、地芙蓉、華木。木芙蓉花主要采摘于夏、秋兩季剛剛開(kāi)放的花朵，曬干或烘干后入藥[1]。木芙蓉花主產(chǎn)地在中國(guó)山東、河北、安徽等省區(qū)，原產(chǎn)于中國(guó)湖南，為成都市市花，現(xiàn)東南亞各國(guó)和日本也都有栽培[2]?！侗静輬D經(jīng)》和《本草綱目》有明確記載，木芙蓉花“味辛平，無(wú)毒”，主治“一切大小癰疽、腫毒惡瘡”[3]。清熱解毒、涼血止血、消腫排膿為木芙蓉花的主要功效[4]。木芙蓉花的化學(xué)成本一般可以分為黃酮類(lèi)、苷類(lèi)成分、香豆素類(lèi)成分等，其中黃酮類(lèi)含量最高，種類(lèi)也最多，大約有25個(gè)。同時(shí)黃酮類(lèi)成分也是木芙蓉花的主要藥效成分，在抗炎、耐病毒、強(qiáng)心、利膽、止痛和鎮(zhèn)定等方面發(fā)揮重要功能[5]。

通過(guò)對(duì)木芙蓉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)行《中國(guó)藥典》2020年版只對(duì)木芙蓉葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了收載，木芙蓉花僅有衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)(中藥材第一冊(cè))且標(biāo)準(zhǔn)較為粗疏，僅做性狀鑒別[6]，目前對(duì)木芙蓉花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鮮有報(bào)道。中藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系到藥材的采集、炮制、制劑、成分提取等方面，并且對(duì)臨床使用起著重要指導(dǎo)作用。本試驗(yàn)采集10批產(chǎn)地不同的木芙蓉花，考查其顯微特征、薄層色譜特征、水分、水溶性浸出物等方面；此外，木芙蓉花中含有蕓香苷等黃酮類(lèi)化合物[7]，其有較高的藥用價(jià)值，是治療糖尿病、高血壓、心血管疾病等多種疾病的良藥，此外它還有抗菌和抗放射作用[8]。故本研究選擇采用高效液相色譜法測(cè)定蕓香苷含量，為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立和規(guī)范使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料、儀器與試藥

1.1 材料 木芙蓉花10批，分別采購(gòu)自浙江省杭州市、廣東省清遠(yuǎn)市、廣東省深圳市、河北省安國(guó)市、四川省成都市、河南省周口市、云南省昆明市及購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)。經(jīng)鑒定，十批藥材皆為錦葵科植物木芙蓉(HibiscusmutabilisL.)的干燥花。具體信息見(jiàn)表1。

表1 木芙蓉花樣品信息表

表2 水分和水溶性浸出物含量測(cè)定結(jié)果

1.2 儀器設(shè)備 U3000高效液相色譜儀(戴安集團(tuán)公司)、BX-41生物顯微鏡(日本Nikon公司)WFH-204B紫外分析儀紫外燈(杭州齊威儀器公司)、WT-B天平(杭州萬(wàn)特衡器公司)、KQ-300DA超聲波清洗器(深圳市華策技術(shù)公司)、HH-S14A恒溫水浴鍋(鄭州市亞榮儀器設(shè)備公司)；DHG-9070A烘箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.3 試劑與試藥 蕓香苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200707)；甲醇(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)生化藥物試劑股份公司，批號(hào)：20220106)；冰醋酸(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)生化藥物試劑股份公司，批號(hào)：20211206)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)股份公司，批號(hào)：20220120)；4%CH3COOHNa硅膠G薄層板(青島海洋化工廠(chǎng)分廠(chǎng))；乙酸乙酯(國(guó)藥集團(tuán)生化藥物試劑公司，批號(hào)：20220305)；甲酸(國(guó)藥集團(tuán)生化藥物試劑公司，批號(hào)：20211210)；硫酸(國(guó)藥集團(tuán)生化藥物試劑公司，批號(hào)：20200313)；丙酮(國(guó)藥集團(tuán)生化藥物試劑公司，批號(hào)：20210901)；三氯甲烷(國(guó)藥集團(tuán)生化藥物試劑公司，批號(hào)：20211016)。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別 將木芙蓉干燥花置于白色工作臺(tái)上，輕輕將失水皺縮的花瓣展開(kāi)，測(cè)量花瓣的長(zhǎng)和寬，觀(guān)察花瓣正反面顏色、形狀以及表面特征，留意木芙蓉花的氣味；將花瓣摘除，觀(guān)察并測(cè)量花柱和雄蕊的性狀。

2.1.1 性狀特征 如圖1所示，本品多呈皺縮團(tuán)狀或鐘狀，完全展開(kāi)的花瓣呈倒三角型形，長(zhǎng)3.0～5.0 cm，寬1.5～3.0 cm；表面有縱向紋理，呈放射狀，為淺黃色，靠近邊緣處有分叉；花瓣顏色以紫色為主調(diào)，深淺不一，偶見(jiàn)淺黃色，內(nèi)面基部呈黃綠色，花瓣數(shù)15～25瓣；花萼5裂，長(zhǎng)1～1.5 cm，表面被星狀柔毛覆蓋，闊卵形狀裂片；雄蕊多數(shù)，聯(lián)合成管狀，包裹花柱，長(zhǎng)1.0～1.5 cm，花藥柄長(zhǎng)0.3～0.7 cm。柱頭呈黃綠色，柱頭頭狀，子房5室，花柱先端5裂。氣微香，味甘淡。注：木芙蓉花外觀(guān)顏色和形狀與花期和品種有關(guān)。其中花期決定花瓣顏色，開(kāi)花初起為白色或淡黃色，花盛開(kāi)時(shí)顏色變深至紫色，采收受花期影響顏色不一致；而花瓣數(shù)量與品種相關(guān)，藥用一般為重瓣木芙蓉。

圖1 木芙蓉干燥花圖

2.2 顯微鑒別 取少許60目過(guò)篩的木芙蓉花粉末放置于干燥透明的載玻片上，攤平放置，觀(guān)察粉末色澤，再滴入1～2滴水合氯醛試液，置于燃燒著的酒精燈上，加熱使其透化，反復(fù)以上動(dòng)作1～2次，直至透化完全，然后滴入1～2滴稀甘油使其分散，用蓋玻片敷蓋好，最后放置于顯微鏡下，觀(guān)察其粉末顯微特征。結(jié)果如圖2所示。

1.花冠表皮細(xì)胞；2.花粉囊內(nèi)壁細(xì)胞；3.非腺毛；4.薄壁細(xì)胞；5.花絲細(xì)胞；6.花粉粒

粉末顏色呈紫紅或暗紫色，偶見(jiàn)土黃色?；ü谒奖砥ぜ?xì)胞呈長(zhǎng)方形或不規(guī)則狀，垂直周壁呈微波狀扭曲，氣孔為直軸式，邊緣具有許多以4～7個(gè)單細(xì)胞非腺毛組成的放射狀腺毛，其壁平滑。薄壁細(xì)胞呈多邊形或矩形，可見(jiàn)螺紋導(dǎo)管。

花粉粒呈球狀，外壁有大量尖刺突起?；ǚ勰覂?nèi)壁細(xì)胞加厚，呈棱形，外表面為多角形，呈肋條狀壁加厚；花絲細(xì)胞呈長(zhǎng)條形，具螺紋狀導(dǎo)管。

完整的腺毛細(xì)長(zhǎng)呈圓錐形，腺頭略成三角形，2～3細(xì)胞，腺柄7～11個(gè)細(xì)胞，內(nèi)含大量淡黃色分泌物。草酸鈣簇晶較小，呈長(zhǎng)方塊狀、菱形以及多邊形狀，棱角微尖。

2.3 薄層色譜鑒別 黃酮類(lèi)成分是木芙蓉花的主要活性成分，本研究以蕓香苷作為黃酮類(lèi)成分的代表性成分對(duì)木芙蓉花進(jìn)行定性質(zhì)量控制。

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 蕓香苷對(duì)照品10 mg，加15 mL甲醇，放入超聲波清洗儀中輔助溶解，放入20 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即為對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 稱(chēng)取木芙蓉花藥材粉末0.5 g放入100 mL錐形瓶中，加入30 mL甲醇，塞緊，放入超聲波清洗儀中超聲30 min(300 W，40 kHz)，濾過(guò)，蒸干濾液，加水15 mL將殘?jiān)芙?，加?0 mL氯仿，振搖提取，棄去下部氯仿溶液，水液層加入水飽和正丁醇25 mL，振搖提取，棄去下部水溶液，分取上部正丁醇溶液，放在水浴鍋上加熱蒸干，最后加2 mL甲醇溶解殘?jiān)?，即得供試品溶液?/p>

2.3.3 檢測(cè)方法 依次吸取對(duì)照品溶液和10批木芙蓉花供試品溶液 1 μL，點(diǎn)于同一以4%CH3COOHNa為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-丙酮(15∶2∶3∶7)為展開(kāi)劑，直接展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇液，置于提前預(yù)熱好105 ℃的烘箱中加熱至呈現(xiàn)清晰斑點(diǎn)，置紫外燈(365 nm)下檢視。結(jié)果如圖3所示。由圖可知，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的黃綠色熒光斑點(diǎn)。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2.4 水分和水溶性浸出物檢查 根據(jù)2020版《中國(guó)藥典》[9]四部通則0832水分測(cè)定法第二法(烘干法)測(cè)定10批樣品，主要操作如下：取木芙蓉花供試品3 g，取干燥至恒重的扁形稱(chēng)量瓶，將木芙蓉花藥材平鋪于中，供試品厚度要低于5 mm，精密稱(chēng)定，將瓶蓋打開(kāi)，用烘箱烘干干燥5 h，溫度設(shè)為100～105 ℃，蓋好瓶蓋，移放至玻璃干燥器中，放涼冷卻30 min，精密稱(chēng)定，再烘干干燥1 h，溫度依舊為上述溫度，載放入玻璃干燥器中冷卻，稱(chēng)重，當(dāng)連續(xù)兩次稱(chēng)重的差異小于5 mg時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。根據(jù)減失的重量，計(jì)算供試品中含水量(%)。

按2020年版《中國(guó)藥典》方法測(cè)定，10批木芙蓉花中水含量為8.73%～11.80%，平均值為10.10%；水溶性浸出物含量為 33.17%～49.80%，平均值為41.53%。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 色譜條件色譜柱：Diamonsil C18(ODS)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：甲醇-1%冰醋酸溶液(35∶65)；流動(dòng)速率：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：257 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按蕓香苷峰計(jì)算應(yīng)不得低于2000。系統(tǒng)適應(yīng)性色譜圖如圖4所示，橫坐標(biāo)為時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為吸收度值(A)。

A

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 取對(duì)照品蕓香苷(蘆丁)10 mg，精密稱(chēng)定，至100 mL容量瓶，加入適量甲醇，用超聲波清洗儀(功率：300 W，頻率40 kHz)溶解，定容至刻度線(xiàn)，搖勻，即得蕓香苷對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 分別取不同批次的木芙蓉花粉末1 g，精密稱(chēng)定，至100 mL圓底燒瓶，精密加入50%甲醇溶液50 mL，稱(chēng)定其重量，回流提取(30 min)，放涼，稱(chēng)重，補(bǔ)足失重，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2 mL，置于10 mL容量瓶中，50%甲醇定容至刻度線(xiàn)，即得木芙蓉花供試品溶液。

2.5.4 線(xiàn)性關(guān)系考查 精密吸取對(duì)照品溶液 1 mL、1 mL、1 mL、1 mL、2 mL，分別置于 50 mL、25 mL、10 mL、5 mL、5 mL容量瓶中，加乙醇稀釋成不同濃度的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。以蕓香苷(蘆丁)進(jìn)樣量(X)對(duì)峰面積積分值(Y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為Y=2.0×107X-189379(r=0.9996，n=6)。結(jié)果表明，蕓香苷(蘆丁)進(jìn)樣量在0.0188～0.9412 μg 范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 按上述色譜條件對(duì)照品溶液反復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示，蕓香苷峰面積RSD=0.677%(n= 6)，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在上述色譜要求條件下，取同一供試品溶液適量，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得出蕓香苷峰面積積分值的RSD=0.519%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)，其穩(wěn)定性良好。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱(chēng)取同一批木芙蓉花樣品對(duì)其進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)(購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，樣品4號(hào))適量，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件的要求測(cè)定。結(jié)果，RSD= 0.859%(n= 6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的木芙蓉花藥材樣品(蕓香苷含量為0.0373 mg·g-1)適量，共10份，分別精密加入一定量的蕓香苷對(duì)照品，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定蕓香苷含量，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 木芙蓉花中蕓香苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.5.9 樣品含量測(cè)定 取適量各個(gè)批次木芙蓉花樣品，精密稱(chēng)定，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算出每批木芙蓉花藥材中的蕓香苷含量。經(jīng)計(jì)算10批樣品中，蕓香苷(蘆丁)含量最高為38.9 μg·g-1，最低為11.9 μg·g-1，平均值為27.38 μg·g-1。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 木芙蓉花十批樣品中蕓香苷含量結(jié)果

3 討論

3.1 薄層鑒別 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藥材本身色素等成分大極性成分以及其他各種非極性成分會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此需要適當(dāng)對(duì)藥材進(jìn)行進(jìn)一步脫色、分離處理，查閱相關(guān)研究[10]發(fā)現(xiàn)甲醇相比乙醇對(duì)蕓香苷的溶解效果更好，故將提取溶劑換為甲醇。超聲提取和回流提取對(duì)供試品制備基本無(wú)差別，但超聲提取較方便，故選擇超聲提取。

3.2 含量測(cè)定 比較了超聲提取法和熱回流法兩種供試品溶液制備方法，熱回流法效率明顯高于超生提取法，因此選擇回流法作為供試品提取方法。通過(guò)查閱文獻(xiàn)[11-12]，同時(shí)測(cè)定木芙蓉花的蕓香苷含量有多種流動(dòng)相選擇，通過(guò)試驗(yàn)，最終確定了在該條件下測(cè)定二者含量，其分離效果好，基線(xiàn)平穩(wěn)，重復(fù)性好，達(dá)到了含量測(cè)定的目的。本法重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便，可為木芙蓉花質(zhì)量控制提供依據(jù)。

3.3 不同批次木芙蓉花質(zhì)量比較 通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地批次的木芙蓉花的外觀(guān)形狀、顯微、薄層色譜、水分、灰分、蕓香苷(蘆丁)含量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，各產(chǎn)地的木芙蓉花基原一致，定性鑒別、一般雜質(zhì)等質(zhì)量檢查結(jié)果較為統(tǒng)一。但是花作為入藥部分，在外觀(guān)鑒別、含量測(cè)定方面會(huì)出現(xiàn)差異。通過(guò)對(duì)10批次的藥材研究發(fā)現(xiàn)，9號(hào)木芙蓉花的外觀(guān)形狀，顯微粉末特征、蕓香苷(蘆丁)含量均與其他批次有明顯差異，初步分析其原因，主要是該批次花朵顏色整體較淺，查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)木芙蓉花的花期決定其顏色，而顏色深淺恰好與木芙蓉花中的黃酮成分(黃酮醇苷及花色素)含量有關(guān)，因此在對(duì)木芙蓉花采集方面建議在花盛開(kāi)時(shí)采收。

此外，研究木芙蓉花中蕓香苷(蘆丁)含量明顯少于木芙蓉葉中其含量，但是也有文獻(xiàn)表明，木芙蓉花中總黃酮的含量高于葉，因此在木芙蓉花的含量測(cè)定指標(biāo)方面是否需要增加其他的有效成分指標(biāo)，尚需進(jìn)一步研究。