曾升友 梁子聰 陸瑞娜 劉 琦 張樂少雄

1.貴州省羅甸縣中醫(yī)醫(yī)院，貴州 羅甸 550100；2.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州 都勻 558000；3.黔南州人民醫(yī)院，貴州 都勻 558000

隨著國家人口的老齡化和工業(yè)交通運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展，臨床上骨折的發(fā)病率越來越高[1]。豐富的血液供應(yīng)是骨折愈合的基礎(chǔ)，而VEGF是促進(jìn)血管新生的關(guān)鍵因子[2]。南燭根是杜鵑花科植物烏飯樹VacciniumbracteatumThunb.的根[3]，水族民間常將其用于治療骨折，但其促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)制至今尚未明確。本課題建立脛骨骨折大鼠模型，觀察水族藥南燭根對(duì)骨折大鼠的血管生成作用，探討其對(duì)骨折的治療作用，為揭示其作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠(清潔級(jí))60只，體重200～220g，雄性。每組分籠適應(yīng)飼養(yǎng)1周，期間飲水、喂食正常進(jìn)行，購于湖南長沙天勤生物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0014]。

1.2 藥材與試劑 水藥南燭根中藥飲片采自貴州三都水族自治縣內(nèi)，經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院民族醫(yī)學(xué)科教授胡建山鑒定為杜鵑花科植物烏飯樹VacciniumbracteatumThunb.的根。蘇木精伊紅液、Masson染液(上海碧云天公司)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管內(nèi)皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2)免疫組化抗體試劑盒(北京中杉金橋公司)。接骨七厘片(國藥準(zhǔn)字Z20003140，湖南金沙藥業(yè)有限公司)，其他均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 南燭根水提液制備 將南燭根碾碎，以10倍超純水浸泡0.5 h，煎鍋煎煮1.5 h，重復(fù)提取2次，混合藥液旋蒸儀濃縮至濃度1.5 g/mL，存放 4 ℃ 冰箱備用。

2.2 模型建立及分組 采用鋸開法建立大鼠脛骨干骨折模型。所有SD大鼠均以2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，以平臥位固定于造模臺(tái)。碘伏消毒左足至左大腿上段，于脛骨結(jié)節(jié)下方2 mm沿脛骨脊作1.5 cm縱向切口，剝離外皮，繼續(xù)沿脛骨脊外側(cè)0.5 mm位置將淺筋膜與深筋膜層縱向切開，游離脛骨前肌群，暴露脛骨外骨面。采用5 mL注射器針頭于脛骨髕韌帶開口，插入克氏針沿髓腔達(dá)脛骨粗隆間，于脛骨中段前方最高點(diǎn)鋸開約3 mm左右缺損，缺損達(dá)骨髓腔，形成脛骨中段橫行骨折。繼續(xù)插入克氏針穿過骨折位置貫穿整個(gè)脛骨髓腔，固定骨折，剪除多余克氏針，將其遠(yuǎn)端埋于骨皮質(zhì)下。以0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后逐層縫合切口，涂抹適量紅霉素軟膏，連續(xù)3 d每天注射8萬U青霉素以預(yù)防感染。成功建立大鼠脛骨骨折模型后，將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型對(duì)照組，陽性對(duì)照組(接骨七厘片 20 mg/kg)、南燭根水提液高、中、低劑量組(400 mg/kg，200 mg/kg，100 mg/kg)，每組10只。建模后第2天起，各給藥組按照相應(yīng)劑量配置溶液灌胃，每天2次。假手術(shù)組和模型對(duì)照組不給予藥物，正常飲食。連續(xù)2周。

2.3 鏡下病理及血管新生情況觀察 處死大鼠后，以骨折位置作為中心，上下各取5 mm×5 mm骨痂組織標(biāo)本，以4%多聚甲醛固定24 h，組織塊常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，制作成厚度5 μm的切片，脫蠟后Masson染色，光鏡下拍照，采用Image ProPlus Software 6.0 IPP軟件測(cè)定新生血管面積百分比(血管面積/截圖面積)，在骨痂愈合平面單位視野內(nèi)隨機(jī)選取10個(gè)不相鄰視野，計(jì)算每個(gè)視野平均值。

2.4 免疫組化法檢測(cè)骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)量 切片常規(guī)脫蠟復(fù)水后，微波修復(fù)，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化酶，BSA封閉滴加一抗(VEGF 1∶400，VEGFR-2 1∶400)4 ℃過夜，次日37 ℃復(fù)溫漂洗后二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，經(jīng)脫水透明后封片，應(yīng)用image pro圖像軟件測(cè)定骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本資料組間比較采用單因素方差分析及重復(fù)測(cè)量方差分析，經(jīng)Levene檢驗(yàn)滿足方差齊性者，采用單因素方差分析，以最小顯著性差異LSD-t檢驗(yàn)行兩兩比較；方差不齊者，采用Welch檢驗(yàn)，再以Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠骨痂鏡下病理觀察和血管面積測(cè)定結(jié)果的比較 假手術(shù)組大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)見骨小梁大小、粗細(xì)、間隔均勻一致，骨小梁間隔中可見散在血管穿過。與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組大鼠脛骨骨痂內(nèi)可見大量的成熟軟骨細(xì)胞，有豐富的新生微血管，骨小梁較粗、大小不均。與模型對(duì)照組比較，南燭根水提液低劑量組、中劑量組鏡下表現(xiàn)相似，而陽性對(duì)照組和南燭根水提液高劑量組軟骨細(xì)胞更加成熟，骨小梁粗大、密集，骨小梁間隔可見豐富的血管。如圖1。與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、南燭根水提液低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠骨痂血管面積百分比顯著增高(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組、南燭根水提液高劑量組大鼠骨痂血管面積百分比顯著增高(P<0.05)；與陽性對(duì)照組、南燭根水提液高劑量組比較，南燭根水提液低劑量組、中劑量組骨痂血管面積百分比明顯降低(P<0.05)。詳見表1。

A.假手術(shù)組；B.模型對(duì)照組；C.陽性對(duì)照組；D.南燭根低劑量組；E.南燭根中劑量組；F.南燭根高劑量組

表1 大鼠脛骨骨痂血管面積百分比和VEGF、VEGFR-2免疫組化陽性表達(dá)結(jié)果

3.2 大鼠脛骨骨痂VEGF、VEGFR-2免疫組化陽性表達(dá)結(jié)果的比較 與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、南燭根水提液低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠骨痂VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)顯著增高(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組、南燭根水提液高劑量組大鼠骨痂VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)顯著增高(P<0.05)；與陽性對(duì)照組、南燭根水提液高劑量組比較，南燭根水提液低劑量組、中劑量組骨痂VEGF陽性表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與陽性對(duì)照組比較，南燭根水提液低劑量組、中劑量組、高劑量組骨痂VEGFR-2陽性表達(dá)明顯降低(P<0.05)。如圖1、圖2、圖3所示。

A.假手術(shù)組；B.模型對(duì)照組；C.陽性對(duì)照組；D.南燭根低劑量組；E.南燭根中劑量組；F.南燭根高劑量組

A.假手術(shù)組；B.模型對(duì)照組；C.陽性對(duì)照組；D.南燭根低劑量組；E.南燭根中劑量組；F.南燭根高劑量組

4 討論

骨折是臨床上骨科最常見的疾病之一。骨折愈合的速度決定了患者回歸正常生活的時(shí)間，如何促進(jìn)骨折快速愈合是臨床醫(yī)師共同面對(duì)的難題。骨折愈合是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，骨折的早期階段由間充質(zhì)干細(xì)胞聚集于骨折斷端，然后其可分化為纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及原始軟骨細(xì)胞，是最早骨細(xì)胞的來源，促進(jìn)成骨反應(yīng)[4]。通過成骨細(xì)胞的骨膜成骨和軟骨細(xì)胞的骨化形成原始骨組織，然后產(chǎn)生軟骨基質(zhì)和無機(jī)鹽沉淀礦化成骨[5]。新生血管的形成和豐富的血液供應(yīng)是許多細(xì)胞發(fā)揮其生長和修復(fù)功能的重要因素[6]。研究[7]證明，VEGF可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂，增加血管通透性，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管新生。VEGFR-2是VEGF的特異性抗體，兩者結(jié)合可以誘導(dǎo)新的血管生成。研究顯示，通過拮抗劑競(jìng)爭性與VEGFR結(jié)合，從而抑制了VEGF活性，引起小鼠股骨骨折模型愈合障礙[8]。動(dòng)物骨折模型可以分為開放性和閉合性造模，開放性骨折模型主要是采用切開皮膚及皮下組織后，使用手鋸或者側(cè)刀切斷骨組織造成骨折，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要固定或者不固定骨折處[9]。閉合性模型大部分使用固定裝置固定造模側(cè)肢體，然后利用重物撞擊患肢，使得患肢形成骨折，而不破壞皮膚[10]。實(shí)驗(yàn)主要觀察骨痂處軟骨細(xì)胞生長及組織因子表達(dá)程度，閉合性骨折模型由于動(dòng)物的體位、肢體固定的角度造成重物下墜時(shí)難以控制骨折后形成面積，可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成較大誤差，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了鋸開法制造大鼠脛骨干動(dòng)物模型。

南燭根是杜鵑花科植物烏飯樹的根，主要分布于貴州、湖南、江西等地，歸肝經(jīng)、腎經(jīng)，其主要治療功效為散瘀消腫、強(qiáng)筋止痛。南方民眾早有將南燭葉的浸汁做成烏米飯食用，但南燭根用藥的報(bào)道較少。水族民間常用南燭根熬成藥汁用于治療骨折，療效明顯。研究顯示，南燭根浸出物中富含分槲皮素、山柰酚、芹菜素和木犀草素等活性成分[11]。多個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，槲皮素可通過多條信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs的增殖和成骨細(xì)胞分化，達(dá)到抗骨質(zhì)疏松癥和促進(jìn)骨折愈合的作用[12-14]。本研究結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組、南燭根水提液高劑量組大鼠骨痂血管面積百分比和大鼠骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)顯著增高；鏡下病理結(jié)果顯示，陽性對(duì)照組和南燭根水提液高劑量組軟骨細(xì)胞更加成熟，骨小梁粗大、密集，骨小梁間隔可見豐富的血管。由此說明，南燭根水提液可以通過提高VEGF、VEGFR-2的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增生，增加新生血管的數(shù)量，從而加速骨折端的愈合。實(shí)驗(yàn)中，南燭根水提液低劑量組和中劑量組與模型對(duì)照組在血管面積、骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)等方面未見明顯差異，說明當(dāng)南燭根水提液達(dá)到400 mg/kg可明顯促進(jìn)骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)，從而起到治療作用。

綜上所述，水族民間常用南燭根治療骨折，但由于基礎(chǔ)研究和臨床報(bào)道較少，因此未被廣泛應(yīng)用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，南燭根水提液可明顯促進(jìn)骨痂組織VEGF、VEGFR-2陽性表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞分裂，促進(jìn)血管新生，從而達(dá)到促進(jìn)骨折愈合的作用。本實(shí)驗(yàn)僅揭示了南燭根通過提高VEGF、VEGFR-2表達(dá)的作用，南燭根的其他作用途徑仍需下一部實(shí)驗(yàn)證實(shí)。