羅祥敏 許成艷 雷 芳 何 珺*

(1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)時(shí)珍學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;2. 貴州大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025)

銀杏葉提取物(Ginkgobilobaextract, GBE)為銀杏科植物銀杏的干燥葉經(jīng)過(guò)醇提取[1]、柱層析分離純化得到的提取物,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品和化妝品等領(lǐng)域,是現(xiàn)代植物藥(中成藥)開(kāi)發(fā)應(yīng)用最成功的案例之一[2]。黃酮和萜內(nèi)酯類化合物被視為銀杏葉提取物中的主要活性成分[3-9],具有抗氧化、抗炎、抗應(yīng)激、保肝和免疫調(diào)節(jié)等多種有益功能[10]。銀杏葉提取物亦常作為神經(jīng)系統(tǒng)藥物使用,廣泛應(yīng)用于治療心腦血管疾病[11],被認(rèn)為是治療心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的雙跨性藥物[12-14],并具有緩解老年人群認(rèn)知障礙[15]、延緩腎間質(zhì)纖維化[16]的作用。在畜禽養(yǎng)殖中,GBE作為飼料添加劑已被廣泛報(bào)道[17-18]。

舒血寧注射液是銀杏葉提取物制成的滅菌水溶液。藥理學(xué)研究表明舒血寧注射劑具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)的作用[19],同時(shí)具有抗腦血管痙攣、抗氧化、抗血栓、降低血黏度、提高免疫力等作用[20]。杜賢蘭等[21]、吳俊蘭等[22]研究發(fā)現(xiàn)舒血寧注射劑對(duì)心腦血管疾病當(dāng)中的腦梗死具有療效,周宜強(qiáng)[23]、張琳鈞等[24]研究發(fā)現(xiàn)舒血寧注射劑對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變患者具有較好的療效?！?009—2011年全國(guó)城鎮(zhèn)基本醫(yī)療保險(xiǎn)參保住院患者中藥利用情況分析》報(bào)告顯示,舒血寧注射液在內(nèi)科用藥中排位第一,費(fèi)用高達(dá)24.93億元,可見(jiàn)舒血寧注射劑的臨床需求大,確保舒血寧注射劑的安全性和有效性顯得尤為重要。

中藥組成成分復(fù)雜,只用單一活性成分來(lái)闡述中藥質(zhì)量不夠全面。中藥指紋圖譜技術(shù)是中藥實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化、國(guó)際化的關(guān)鍵,成為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的核心技術(shù)[25]。它從整體上體現(xiàn)中藥中成分的種類和數(shù)量,反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量[25]。2020版藥典要求銀杏葉提取物在檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm條件下有17個(gè)特征峰[26]。舒血寧是一個(gè)以注射用銀杏葉提取物為藥理作用物質(zhì)的多成分中藥注射劑,黃酮醇苷類和萜內(nèi)酯類被視為舒血寧注射劑的主要活性物質(zhì),但中藥提取物是一個(gè)復(fù)雜的體系,藥理作用不僅僅是單一物質(zhì)的作用,而且是多種物質(zhì)共同產(chǎn)生的藥理作用,課題組前期通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了銀杏葉提取物中活性成分,本研究對(duì)舒血寧注射劑組成成分進(jìn)行驗(yàn)證及含量測(cè)定,同時(shí)對(duì)舒血寧注射劑的指紋圖譜進(jìn)行了完善和優(yōu)化,對(duì)舒血寧注射劑的質(zhì)量安全及功效穩(wěn)定性研究具有一定意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

實(shí)驗(yàn)設(shè)備,所用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照表及測(cè)試樣品分別如表1、表2、表3所示。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及其來(lái)源Tab. 1 Equipment and its source

表2 對(duì)照品及其來(lái)源Tab. 2 Reference substance and its source

表3 供試品及其來(lái)源Tab. 3 Test products and their sources

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

依據(jù)藥典及文獻(xiàn)結(jié)果,各可能存在活性成分及對(duì)應(yīng)的測(cè)定色譜條件如表4所示。

表4 活性成分及其色譜條件Tab. 4 Active ingredients and their chromatographic conditions

指紋圖譜色譜條件[26]:柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)360、234、250、280、324 nm;C18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm),流速為1.0 mL·min-1;流動(dòng)相:乙腈(A)、0.4%磷酸水(B)[26]按表5梯度進(jìn)行洗脫。

表5 舒血寧注射劑的指紋圖譜梯度洗脫Tab. 5 Gradientelution of fingerprint of shuxuening injection

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

(1) 精密稱取槲皮素、山柰素、異鼠李素適量置于100 mL容量瓶中,加甲醇將其配制成每1 mL含槲皮素30 μg、山柰素30 μg、異鼠李素20 μg的混合溶液[27],過(guò)0.45 μm濾膜,備用。

(2) 精密稱取銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B標(biāo)準(zhǔn)品適量放置于100 mL容量瓶中,加50%甲醇溶液,配制成每1 mL含銀杏內(nèi)酯C 0.10 mg、白果內(nèi)酯0.20 mg、銀杏內(nèi)酯A 0.18 mg、銀杏內(nèi)酯B 0.08 mg的混合溶液[27],用0.45 μm濾膜過(guò)濾。

(3) 分別精密稱取綠原酸、莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品適量置100 mL容量瓶中,加10%甲醇配制成0.315 mg·mL-1綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和0.220 mg·mL-1莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液[27]。

(4) 精密稱取兒茶素、表兒茶素、葛根素、圣草酚、木犀草素、香葉木素、大麥芽堿、芫花素、β-谷甾醇、芝麻素標(biāo)準(zhǔn)品適量于具塞10 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,得到濃度為0.234、0.246、0.154、 0.502、0.500、0.238、0.194、0.129、0.245、0.217 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

(1) 精密稱取不同來(lái)源的銀杏葉提取物適量,用55%甲醇溶液定容至10 mL,超聲溶解,過(guò)0.45 μm膜。

(2) 測(cè)木犀草素供試品溶液的制備:精密稱取銀杏葉提取物35 mg,加入10 mL固體水解液(甲醇∶純水∶濃鹽酸=7∶2∶1),置于68 ℃水浴鍋中水解3 h[28],取出冷卻至室溫,0.45 μm膜過(guò)濾即得。

(3) 注射用銀杏葉提取物供試品的制備:精密稱取注射用銀杏葉提取物35 mg,加10 mL 15%乙腈溶液,超聲1 min,搖勻,經(jīng)0.45 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾,即得注射用銀杏葉提取物供試品[28]。

(4) 舒血寧注射劑供試品的制備:取1支舒血寧注射劑,打破外玻璃容器,取出內(nèi)容物,經(jīng)0.45 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾,即得舒血寧注射劑供試品。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

將銀杏葉提取物對(duì)照品、銀杏葉提取物供試品等色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度計(jì)算軟件,進(jìn)行主峰匹配。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度

精密稱取1.2.2中銀杏內(nèi)酯A、槲皮素、兒茶素各1個(gè)對(duì)照品溶液,按1.2.1節(jié)的色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè)6次,根據(jù)峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。銀杏內(nèi)酯A的RSD為0.85%,槲皮素的RSD為0.77%,兒茶素的RSD為0.69%,表明該測(cè)定方法精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性

精密稱取1.2.3的注射用銀杏葉提取物供試品溶液,分別在室溫條件下放置4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h,按1.2.1的色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè),總黃酮RSD為0.98%,總萜內(nèi)酯RSD為1.02%,莽草酸RSD為1.11%,綠原酸RSD為0.89%,兒茶素RSD為0.96%,表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.3 重復(fù)性

精密稱取1.2.3的注射用銀杏葉提取物4份,按供試品制備方法分別制備成供試品溶液,分別按1.2.1的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),記錄峰面積,計(jì)算RSD均小于1.4%,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2 舒血寧注射劑用銀杏葉提取物中活性成分含量測(cè)定結(jié)果

將對(duì)照品和供試品按1.2.1色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表6～表8。

表7 注射用銀杏葉提取物中活性化合物含量測(cè)定結(jié)果(2)Tab. 7 Validation results of active compounds in ginkgo biloba extract for injection (2)

表8 注射用銀杏葉提取物中活性化合物含量測(cè)定結(jié)果(3)Tab. 8 Validation results of active compounds in ginkgo biloba extract for injection (3)

6批次注射用銀杏葉提取物中結(jié)構(gòu)明確的活性化合物含量之和為60.52%～67.33%,均大于總固體量的60%。6批次注射用銀杏葉提取物均不含芫花素、芝麻素及β-谷甾醇。不同廠家的注射用銀杏葉提取物中總黃酮、總內(nèi)酯、兒茶素、表兒茶素、葛根素、圣草酚及綠原酸含量不一樣,這可能與生產(chǎn)過(guò)程中的工藝參數(shù)和操作不同有關(guān)。供試品中莽草酸、香葉木素色譜圖參見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 供試品中莽草酸色譜分析圖Fig. 1 Chromatographic analysis of shikimic acid in tested products

圖2 供試品中香葉木素色譜分析圖Fig. 2 Chromatographic analysis of diosmetin in tested products

2.3 舒血寧注射劑指紋圖譜完善結(jié)果

將樣品按表2中兒茶素測(cè)試的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,然后把色譜圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度計(jì)算軟件,與對(duì)照銀杏葉提取物進(jìn)行主峰匹配如圖3所示,結(jié)果顯示檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,兒茶素在指紋圖譜中定位T=8.146 min出峰。同樣方法可得檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,表兒茶素在指紋圖譜中定位T=11.594 min出峰;檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm,葛根素在指紋圖譜中定位T=8.814 min出峰;檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm,香葉木素在指紋圖譜中定位T=73.202 min出峰;檢測(cè)波長(zhǎng)為324 nm,綠原酸在指紋圖譜中定位T=7.707 min出峰;檢測(cè)波長(zhǎng)為234 nm,莽草酸在指紋圖譜中定位T=2.601 min出峰。其中兒茶素指紋圖譜比對(duì)如圖3所示,其余各物質(zhì)比對(duì)方法相同不再贅述。

圖3 兒茶素在銀杏葉提取物指紋圖譜中的定位(λ=280 nm)Fig. 3 Localization of catechin in fingerprint of ginkgo biloba extract (λ=280 nm)

在2020年版藥典測(cè)定銀杏葉提取物指紋圖譜方法基礎(chǔ)上,在舒血寧注射劑指紋圖譜中定位到6個(gè)新化合物,分別是兒茶素、表兒茶素、葛根素、香葉木素、綠原酸、莽草酸。

3 結(jié)論

采用HPLC法對(duì)注射用銀杏葉提取物中的總黃酮、總萜內(nèi)酯、兒茶素、表兒茶素、葛根素、圣草酚、香葉木素、大麥芽堿、芫花素、芝麻素、β-谷甾醇、綠原酸、莽草酸、木犀草素等具體活性化合物進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果顯示,6批次注射用銀杏葉提取物中結(jié)構(gòu)明確的活性化合物含量之和均大于總固體量的60%,均不含芫花素、芝麻素及β谷甾醇。在2020年版藥典測(cè)定銀杏葉提取物指紋圖譜方法基礎(chǔ)上,對(duì)舒血寧注射劑指紋圖譜進(jìn)行了優(yōu)化,在舒血寧注射劑指紋圖譜中定位到了6個(gè)新化合物,分別是兒茶素、表兒茶素、葛根素、香葉木素、綠原酸及莽草酸,豐富了舒血寧注射劑的指紋圖譜。本研究驗(yàn)證了舒血寧注射劑的組成成分非常復(fù)雜,其擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)等藥理作用應(yīng)是這些活性成分共同作用的結(jié)果。