袁 昕 焦小雨 唐春雷

(江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院,江蘇 無錫 214122)

波尼替尼(Poziotinib,1),化學(xué)名1-(4-(4-(3,4-二氯-2-氟苯胺)-7-甲氧基喹唑啉-6-氧基)-1-哌啶基)丙-2-烯-1-酮(圖1),是由韓國首爾醫(yī)科大學(xué)于2008年研發(fā)的一種泛人表皮生長因子受體2(EGFR2)酪氨酸激酶抑制劑[1],主要靶向EGFR野生型、EGFRT790M/L858R、HER2和HER4,對(duì)應(yīng)的IC50分別為3.2、2.2、5.3和23.5 nmol·L-1[2]。據(jù)數(shù)據(jù)顯示,目前非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者中90%的HER2突變是20號(hào)外顯子突變,4%的患者中存在EGFR和HER2的20號(hào)外顯子雙突變[3]。然而由于20號(hào)外顯子的突變改變了藥物結(jié)合口袋的大小、限制了大的剛性抑制劑的結(jié)合,目前已有的許多酪氨酸激酶抑制劑,如阿法替尼[4]、達(dá)克米替尼、來那替尼[5]等,對(duì)EGFR和HER2的20號(hào)外顯子突變抑制效果不佳。因此針對(duì)EGFR和HER2的20號(hào)外顯子雙突變的NSCLC患者依舊缺乏有效的治療方法。而Poziotinib由于結(jié)構(gòu)較小、存在可靈活旋轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),可以規(guī)避空間位阻變化[3],給患者帶來良好的治療效果。根據(jù)最新的Ⅱ臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)(NCT03066206),Poziotinib在EGFR和HER2的20號(hào)外顯子突變的NSCLC中獲得了30%的客觀緩解率[6],有望成為具有良好治療效果的酪氨酸激酶抑制劑。作者對(duì)Poziotinib的合成方法進(jìn)行了研究,以期為該化合物的合成以及結(jié)構(gòu)類似物的研究提供理論參考。

1圖1 Poziotinib的結(jié)構(gòu)Fig. 1 The structure of Poziotinib

1 合成路線

目前原研公司報(bào)道的Poziotinib(1)的合成路線如圖2所示[7,8],以2-氨基-4,5-二甲氧基苯甲酸(2)為原料在210 ℃下與鹽酸甲脒反應(yīng)得到6,7-二甲氧基喹唑啉-4(3H)-酮(3)?；衔?在甲磺酸中與甲硫氨酸反應(yīng)得到6-羥基-7-甲氧基喹唑啉-4(3H)-酮(4)?；衔?在吡啶和無水乙酸中乙?；申P(guān)鍵中間體3,4-二氫-7-甲氧基-4-氧代喹唑啉-6-醇乙酸酯(5)?；衔?與三氯氧磷在甲苯中經(jīng)氯化得到4-氯-7-甲氧基喹唑啉-6-乙酸酯(6)?；衔?在含氨水的甲醇溶液中去乙?；玫?-氯-7-甲氧基喹唑啉-6-醇(7)。化合物7與4-(甲苯-4-磺酰氧)哌啶-1-羧酸叔丁酯(11)經(jīng)Mitsunobu反應(yīng)得到4-((4-氯-7-甲氧基喹唑啉-6-基)氧基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(8)?；衔?在乙腈溶液中與3,4-二氯-2-氟苯胺(12)經(jīng)取代反應(yīng)得到4-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)氧基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(9)?；衔?以丙酮作為溶劑通過鹽酸脫去叔丁基羰基(Boc)的保護(hù)得到N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基-6-(哌啶-4-氧基)喹唑啉-4-胺(10)。化合物10在碳酸氫鈉的四氫呋喃和水的混合溶液中與丙烯酰氯經(jīng)酰化反應(yīng)得到Poziotinib (1),總收率12.7%(以2計(jì),以5計(jì)收率為32.0%)。該路線操作復(fù)雜、反應(yīng)耗時(shí)長、副產(chǎn)物多、成本較高,不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

圖2 化合物1的原研合成路線Fig. 2 Original synthetic route of compound 1 in Literature

原研專利合成路線共有9步,經(jīng)成本核算,其中經(jīng)1～3步得到化合物5所需成本高于直接商業(yè)化獲得化合物5的價(jià)格?；衔?至化合物4的制備步驟危險(xiǎn)性較大。這幾步反應(yīng)均在無溶劑且高溫的情況下進(jìn)行,反應(yīng)可能不均勻,且氯代后的產(chǎn)物6往往結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,暴露在空氣中容易與空氣中的水發(fā)生取代反應(yīng)變回氯取代前的原料。故改進(jìn)工藝路線(如圖3所示)中6優(yōu)先與3,4-二氯-2-氟苯胺(12)進(jìn)行親核取代反應(yīng),有效解決了化合物穩(wěn)定性低的問題,相比原研路線,收率也得到了保證。改進(jìn)后的工藝路線以廉價(jià)易得的7-甲氧基-4-氧代喹唑啉-6-醇乙酸酯(5)為起始原料,經(jīng)6步反應(yīng)得到Poziotinb,且收率由原來的12.7%提高至42.3%(以5計(jì))。另外,改進(jìn)路線在關(guān)鍵中間體9和Poziotinib(1)粗品的純化上采用重結(jié)晶的方式,節(jié)約了時(shí)間和溶劑成本。優(yōu)化后的工藝路線在提高總收率的前提下,降低了生產(chǎn)成本和能耗,反應(yīng)條件相對(duì)溫和,后處理操作簡便,適合工業(yè)化大量制備。

圖3 化合物1的改進(jìn)合成路線Fig. 3 Improved synthetic route of compound 1

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 主要儀器與試劑

7-甲氧基-4-氧代喹唑啉-6-醇乙酸酯(5),97%;4-(甲苯-4-磺酰氧)哌啶-1-羧酸叔丁酯(11),98%;3,4-二氯-2-氟苯胺(12),98%。以上試劑均購于上海畢得醫(yī)藥有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為市售分析純或化學(xué)純,未經(jīng)進(jìn)一步純化處理。TLC展開劑和溶劑比例均為體積比。

液相-質(zhì)譜儀,LC-MS-80,Waters公司,ESI離子源,正離子MS模式,離子源溫度120 ℃,錐孔電壓40 V,碰撞能量20 eV,全掃描質(zhì)荷比為50～1 500 Da,掃描時(shí)間為0.5 s。液相色譜儀,LC1260,安捷倫科技有限公司。核磁共振儀,Bruker AVII-400 MHz,德國Bruker公司,TMS為內(nèi)標(biāo)。

2.2 合成步驟

2.2.1 4-氯-7-甲氧基喹唑啉-6-乙酸酯(6)

將7-甲氧基-4-氧代喹唑啉-6-醇乙酸酯(5)(30.0 g,128.1 mmol)和氯化亞砜(300 mL)置于1 000 mL反應(yīng)瓶中,隨后加入催化量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF,0.15 g),80 ℃攪拌反應(yīng)2 h,TLC檢測(cè)反應(yīng)(展開劑:石油醚-乙酸乙酯,體積比1∶1),減壓蒸除溶劑后,冰浴下向殘留物中緩慢滴加飽和碳酸氫鈉水溶液,調(diào)pH值至8～9,用二氯甲烷(3×500 mL)萃取,合并有機(jī)相,有機(jī)相水洗(3×300 mL),飽和氯化鈉溶液(3×300 mL)洗滌,無水硫酸鈉干燥,抽濾,濾液減壓濃縮得到得灰色固體粉末(6)(30.6 g,收率95%)。ESI-HRMS(m/z): 253.05 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.97 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 4.05 (s, 3H), 2.42 (s, 3H)。

2.2.2 4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-羧酸酯(13)

將中間體6(30.0 g,75.9 mmol)和乙腈(300 mL)置于1 000 mL反應(yīng)瓶中,再加入(14.9 g,83.4 mmol)的3,4-二氯-2-氟苯胺(12),室溫下攪拌4 h。TLC檢測(cè)反應(yīng)完全(展開劑:二氯甲烷-甲醇,體積比20∶1),反應(yīng)結(jié)束后,有固體析出。抽濾,用乙腈(60 mL)洗滌濾餅。濾餅經(jīng)真空干燥(45 ℃,24 h)后得白色粉末狀關(guān)鍵中間體13,不經(jīng)純化直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。ESI-HRMS(m/z): 395.971 6 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.51(s, 1H), 8.87(s, 1H), 8.60(s, 1H), 7.67(dd,J=8.8, 1.7 Hz, 1H), 7.62～7.58(m, 1H), 7.49(s, 1H), 4.02(s, 3H), 2.39(s, 3H)。

2.2.3 4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-醇(14)

將中間體13(25.0 g,63.3 mmol)和甲醇(250 mL)置于1 000 mL反應(yīng)瓶中,加入無水碳酸鉀(26.2 g,189.9 mmol),室溫下攪拌2 h,TLC檢測(cè)反應(yīng)完全(展開劑:二氯甲烷-甲醇,體積比10∶1),減壓蒸除溶劑,將殘留物倒入水(300 mL)中,抽濾,用水洗滌濾餅,濾餅經(jīng)干燥后得到黃色固體(14)(21.5 g,兩步收率96%)。ESI-HRMS(m/z): 354.053 2[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ:8.28(s,1H),7.61～7.54(m,2H),7.50(d,J=9.0 Hz,1H),7.14(s,1H),3.92(s,3H)。

2.2.4 4-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)氧基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(9)

將中間體14(20.0 g,56.7 mmol)和DMF(200 mL)置于1 000 mL反應(yīng)瓶中,加入4-(甲苯-4-磺酰氧)哌啶-1-羧酸叔丁酯(化合物11,24.1 g,68.0 mmol)、無水碳酸鉀(23.5 g,170.0 mmol),室溫反應(yīng)過夜,TLC檢測(cè)反應(yīng)完全(展開劑:二氯甲烷-甲醇,體積比10∶1),將混合物減壓蒸除溶劑,得到黃色固體(9),加入二氯甲烷(30 mL)和甲醇(30 mL)的混合溶劑重結(jié)晶,得到化合物(9)純品(20.1 g,收率66%)。ESI-HRMS(m/z): 537.146 8[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ:9.63(s,1H),8.39(s,1H),7.87(s,1H),7.60(d,J=5.9 Hz,2H),7.24(s,1H),3.94(s,3H),3.69(d,J=13.3 Hz,2H),1.64(d,J=11.9 Hz,2H),1.42(s,9H),1.26～1.22(m,3H),0.84(d,J=7.3 Hz,1H)。

2.2.5 N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基-6-(哌啶-4-氧基)喹唑啉-4-胺(10)

將中間體9 (11.0 g,20.5 mmol)置于500 mL反應(yīng)瓶中,滴加二氯甲烷(DCM)和三氟乙酸(體積比4∶1)的混合溶液(110 mL),室溫反應(yīng)4 h,TLC檢測(cè)反應(yīng)完全(展開劑:二氯甲烷-甲醇,體積比10∶1)。減壓蒸除溶劑,所得殘留物殘?jiān)诒∠碌渭语柡吞妓釟溻c水溶液(100 mL)調(diào)pH值至8.0～9.0,隨后用二氯甲烷進(jìn)行萃取(3×150 mL),合并有機(jī)層,用無水硫酸鈉干燥,減壓蒸除溶劑得到黃色固體(10)(7.7 g,收率86%)。ESI-HRMS(m/z):437.094 6[M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:9.73(s,1H),8.38(s,1H),7.86(s,1H),7.59(d,J=5.2 Hz,2H),7.23(s,1H),4.64(tt,J=8.5,3.8 Hz,1H),3.95(s,2H),3.18(s,1H),3.06(dt,J=12.5,4.6 Hz,2H),2.75～2.68(m,2H),2.05(td,J=8.0,3.8 Hz,2H),1.66～1.56(m,2H) 。

2.2.6 Poziotinib(1)

在250 mL三頸瓶中將中間體10(4.7 g,10.8 mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(50 mL),在0 ℃和氮?dú)獗Ｗo(hù)下,并依次緩慢滴加三乙胺(3.5 g,21.6 mmol)、丙烯酰氯(1.9 g,21.3 mmol)的二氯甲烷(20 mL)溶液,室溫下攪拌進(jìn)行反應(yīng)12 h,TLC檢測(cè)反應(yīng)完全(展開劑:二氯甲烷-甲醇,體積比10∶1)。將反應(yīng)液滴進(jìn)水(200 mL)中,固體析出,抽濾,濾餅用水(100 mL)洗滌,真空干燥(45 ℃,12 h)得到灰白色固體(4.9 g)。常溫下用二氯甲烷(6 mL)和甲醇(4 mL)溶解粗品,再滴加乙酸乙酯(12 mL)攪拌8 h,析出固體。抽濾,用乙酸乙酯(10 mL)洗滌,真空干燥(45 ℃,24 h)得到黃色固體(1)(4.4 g,收率84%),HPLC純度為99.46%(HPLC面積歸一化法),色譜柱:Ultimate C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相A:0.1%(體積比)的三氟乙酸水溶液;流動(dòng)相B:乙腈;等度洗脫(B 70%)15 min;檢測(cè)波長:254 nm;流速:0.8 mL·min-1;柱溫:40 ℃。樣品用乙腈溶解配置成濃度為100 μg·mL-1的溶液1 mL,進(jìn)樣量為10 μL。ESI-HRMS(m/z): 490.097 5[M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.71(s,1H),8.40(s,1H),7.90(s,1H),7.60(d,J=5.5 Hz,2H),7.25(s,1H),6.85(d,J=6.1 Hz,1H),6.14～6.10(m,1H),5.71～5.67(m,1H),4.80～4.76(m,1H),3.95(s,3H),3.89(d,J=3.7 Hz,2H),3.54～3.46(m,2H),2.02(d,J=11.7 Hz,2H),1.73～1.66(m,2H)。

3 結(jié)果與討論

3.1 起始原料的替換

本研究對(duì)工藝路線的起始物料進(jìn)行重新核算,發(fā)現(xiàn)以5為起始原料更合適,使得反應(yīng)路線由原文獻(xiàn)的9步縮短為6步,減少了制備步驟,節(jié)約了制備成本,也大大提高了收率(表1)。

表1 路線收率Tab. 1 The yield of each routes

3.2 合成方法優(yōu)化

3.2.1 化合物6的合成方法優(yōu)化

合成化合物6時(shí),原研路線選擇三氯氧磷為氧化劑,甲苯作為溶劑,甲苯作為易制毒、易制爆試劑,在工業(yè)生成中可能無法大量使用,故優(yōu)化路線后選擇中等毒性的氯化亞砜作為氯化試劑和反應(yīng)的溶劑。

3.2.2 脫乙?；椒▋?yōu)化

合成中間體7時(shí),原研路線選擇以甲醇作為溶劑,氨水作為堿解試劑,但氨水在使用過程中,易揮發(fā)且有強(qiáng)烈的刺鼻氣味,不適合工業(yè)大規(guī)模使用。本研究采用無水碳酸鉀進(jìn)行堿解,室溫反應(yīng)2 h后直接抽濾并用甲醇洗滌濾餅,濾液經(jīng)濃縮、干燥后得到化合物14,收率可達(dá)95.7%。采用碳酸鉀對(duì)乙?；M(jìn)行堿解,操作更為簡單,更為安全,符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。兩種方法對(duì)比如表2所示。

表2 不同試劑的脫乙酰條件和產(chǎn)率Tab. 2 Deacetylation conditions and yields of different reagents

3.2.3 中間體10的方法優(yōu)化

合成中間體10時(shí),原研路線脫除Boc保護(hù)基時(shí),以丙酮作為溶劑。本研究采用三氟乙酸和二氯甲烷體系進(jìn)行Boc脫除,在不降低收率的同時(shí),提高了反應(yīng)的安全性。丙酮作為易制毒試劑,成本較高,據(jù)核算,噸位級(jí)丙酮價(jià)格約為二氯甲烷的1.5倍,且在研發(fā)和生產(chǎn)中使用頗為不便。本研究的方法可為相關(guān)化合物的脫保護(hù)提供一種參考方案。

3.2.4 中間體9和終產(chǎn)物純化方法優(yōu)化

在純化中間體9和終產(chǎn)物時(shí),本工藝路線經(jīng)實(shí)驗(yàn)摸索出合適的重結(jié)晶純化方法,對(duì)得到的化合物進(jìn)行重結(jié)晶純化,避免了使用柱層析等純化方法,且所選擇的重結(jié)晶溶劑為工業(yè)常用品且價(jià)格低廉,更適用于工業(yè)放大生產(chǎn)。

4 結(jié)論

作者改進(jìn)了Poziotinib的合成路線,以價(jià)格便宜的化合物5為起始原料,用氯化亞砜作為氯化原料代替三氯氧磷和甲苯,更符合工業(yè)生產(chǎn)要求。中間體13經(jīng)過取代后以無水碳酸鉀代替氨水作為酯水解反應(yīng)試劑,得到中間體14,收率得到了提高。中間體14與4-(甲苯-4-磺酰氧)哌啶-1-羧酸叔丁酯(11)酯化、脫保護(hù)基得中間體9,再與丙烯酰氯經(jīng)?；磻?yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物Poziotinib(1),改進(jìn)后路線總收率為43.2%,該方法合成步驟短、后處理簡單,無需復(fù)雜的純化即可進(jìn)行下一步反應(yīng),且使用的試劑更適合工業(yè)放大生產(chǎn),可為Pozionitib及其衍生物的合成提供參考。