李艷秋，陳丹丹，賈 娟

（1.漯河職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品學(xué)院，河南 漯河 462002；2.河南工業(yè)大學(xué)漯河工學(xué)院，河南 漯河 462002；3.河南豫藍(lán)環(huán)?？萍加邢薰?，河南 鄭州 450001）

藍(lán)莓（Vaccinium spp.）屬于杜鵑花科越橘類，顆粒較小，外觀類似于橢圓，果皮上有一層果霜，果肉軟、嫩，酸甜適中，老人、小孩都可以食用，在水果中屬于上品，有很高的營養(yǎng)價(jià)值，因而受到人們的歡迎[1]。藍(lán)莓含有豐富的花青素，是常見果蔬中所含花青素比例最大的[2]。花青素屬于類黃酮類，是一種水溶性天然色素，在植物中比較常見[3]。目前天然存在的花青素中常見的為天竺葵色素、飛燕草色素、錦葵色素、芍藥色素、牽?；ㄉ亍⑹杠嚲丈?。花青素在自然狀態(tài)下主要以糖苷的形式存在，稱為花色苷?；ㄇ嗨鼐哂忻廊輀4]、保護(hù)視力[5-6]、預(yù)防心血管疾病[7-9]、抗癌、抗糖尿病、抗肥胖、抗菌、預(yù)防慢性疾病[10]、抗抑郁、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[11]、降低DNA 損傷、DNA 斷裂和細(xì)胞內(nèi)活性氧種類[12]、對(duì)睪丸有靶向作用[13]等功效，在食品著色、化妝品、染料、醫(yī)藥等方面應(yīng)用廣泛。

花青素的提取方法主要有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、酶輔助提取法等。微波輔助提取法設(shè)備昂貴，在溶劑的選擇上有一定的局限性[14-15]；超聲波輔助提取法對(duì)設(shè)備要求高[16]；酶輔助提取法提取成本較高，對(duì)溫度要求比較嚴(yán)，對(duì)提取技術(shù)要求也很高[17]。溶劑提取法是提取花青素最常見的方法，操作簡便，對(duì)設(shè)備要求不高，但存在安全隱患，有一定的毒副作用，提取時(shí)間長，提取率低，且含有雜質(zhì)，溶劑消耗量大等[18]。本文以藍(lán)莓為研究對(duì)象，利用對(duì)環(huán)境相對(duì)友好的檸檬酸乙醇混合溶液為提取劑，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)從藍(lán)莓中提取花青素并優(yōu)化其提取工藝，為花青素的提取提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮藍(lán)莓，產(chǎn)地云南，放在-4 ℃冰箱里冷藏。

1.1.2 試劑

1.2 儀器與設(shè)備

飛利浦榨汁機(jī)，HR1876，飛利浦電子香港有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，UV-2600，尤尼柯（上海）儀器有限公司；電子分析天平，F(xiàn)A2004 型，上海上平儀器有限公司；離心機(jī)，TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-8，金壇市杰瑞爾電器有限公司；電熱恒溫干燥箱，202 型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將購買的藍(lán)莓洗凈，稱取500 g 打勻成漿，放入冰箱中避光冷藏（-20 ℃），備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（1）0.8%鹽酸-乙醇混合溶液的配制

移取2 mL 濃鹽酸，用無水乙醇定容至250 mL。

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

總之，種子具有有性繁殖特點(diǎn)，基于對(duì)種子形態(tài)特征的分析，研究其與植被恢復(fù)、演替之間的關(guān)系。植被演替也給予種子的生產(chǎn)以及散布而形成，種子形態(tài)對(duì)植被的傳播能力具有重要的影響?；谏飳W(xué)、生態(tài)學(xué)角度分析種子特征對(duì)植被恢復(fù)造成的影響，闡述植被恢復(fù)演替的干擾性因素，對(duì)于促進(jìn)植物學(xué)的發(fā)展具有重要意義。

準(zhǔn)確稱取矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品2.0 mg，置于10 mL 的棕色容量瓶中，用0.8%鹽酸-乙醇混合溶液溶解后定容至刻度。

（3）系列標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的配制

用移液管分別移取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL 棕色容量瓶中，用0.8%鹽酸-乙醇混合溶液溶解后定容至刻度，濃度分別為4、8、16、24、32 μg/mL。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色皿中，以鹽酸-乙醇混合溶液為空白，在520 nm 波長下測定吸光度。以矢車菊-3-O-葡萄糖苷的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.050 5x+0.034 2（R2=0.998 2）。

1.3.3 花青素的提取及提取量的計(jì)算

稱取2 g（精確至0.000 1 g）的藍(lán)莓果漿于錐形瓶中，按照設(shè)定的溫度、提取劑的體積比、提取時(shí)間和料液比進(jìn)行提取。提取結(jié)束后，用離心機(jī)進(jìn)行離心取濾液，即為藍(lán)莓花青素提取液。取適量上清液于比色皿中，以乙醇-檸檬酸混合溶液作為空白，在520 nm 波長下測定其吸光度。花青素提取量按照公式（1）計(jì)算。

式中，c 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的吸光度下對(duì)應(yīng)的花青素濃度，μg/mL；V 為樣品和提取劑的總體積，mL；m 為所取藍(lán)莓果漿的質(zhì)量，g。

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)條件設(shè)為乙醇和檸檬酸的體積比6∶4，提取溫度40 ℃，料液比為1∶20（g/mL），提取時(shí)間為90 min。提取溫度設(shè)置為30、40、50、60、70 ℃，乙醇和檸檬酸體積比設(shè)置為3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3，提取時(shí)間設(shè)置為60、90、120、150、180 min，料液比設(shè)置為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），以花青素的提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，選取對(duì)藍(lán)莓花青素含量影響顯著的主要因素，即提取溫度、乙醇和檸檬酸的體積比、提取時(shí)間、料液比，按照四因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以藍(lán)莓中花青素的提取量為指標(biāo)，優(yōu)化藍(lán)莓花青素的提取工藝參數(shù)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取溫度對(duì)藍(lán)莓花青素提取量的影響

由圖1 可知，當(dāng)其他條件不變時(shí)，隨著提取溫度的升高，藍(lán)莓花青素的提取量逐漸增加。當(dāng)提取溫度升高到40 ℃時(shí)，藍(lán)莓花青素的提取量達(dá)到最大。而當(dāng)提取溫度繼續(xù)升高時(shí)，藍(lán)莓花青素的提取量開始降低。造成這一現(xiàn)象的原因可能是花青素對(duì)溫度敏感，當(dāng)溫度升高時(shí)花青素不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致花青素分解，最終使花青素的提取量降低。因此最佳提取溫度為40 ℃。

圖1 提取溫度對(duì)花青素提取量的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of anthocyanin

2.1.2 乙醇和檸檬酸體積比對(duì)花青素提取量的影響

由圖2 可知，當(dāng)其他條件不變時(shí)，隨著乙醇占比的升高，藍(lán)莓花青素的提取量逐漸增加。當(dāng)乙醇和檸檬酸的體積比為4∶6 時(shí)，藍(lán)莓花青素的提取量達(dá)到最大。當(dāng)乙醇占比繼續(xù)升高時(shí)，藍(lán)莓花青素的提取量開始降低。造成這一現(xiàn)象的原因可能是隨著乙醇濃度的升高，溶劑的極性增大，當(dāng)花青素與溶劑極性相近時(shí)，其花青素的提取量達(dá)到最大值，然后隨著乙醇的濃度增加，其極性與花青素極性發(fā)生偏移，導(dǎo)致花青素的提取量降低，因此，最佳乙醇和檸檬酸的體積比為4∶6。

圖2 乙醇和檸檬酸體積比對(duì)花青素提取量的影響Fig.2 Effect of volume ratio of ethanol and citric acid on the yield of anthocyanin

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓花青素提取量的影響

由圖3 可知，當(dāng)其他條件不變時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，藍(lán)莓花青素的提取量逐漸增加。當(dāng)提取時(shí)間延長到150 min，此時(shí)藍(lán)莓花青素的提取量達(dá)到最大。當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長時(shí)，藍(lán)莓花青素的提取量開始降低。造成這一現(xiàn)象的原因可能是花青素被分解，最終導(dǎo)致花青素提取量降低。因此，最佳提取時(shí)間為150 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)花青素提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of anthocyanin

2.1.4 料液比對(duì)藍(lán)莓花青素提取量的影響

由圖4 可知，當(dāng)料液比增加到1∶20（g/mL），此時(shí)藍(lán)莓花青素的提取量達(dá)到最大。當(dāng)料液比繼續(xù)增加時(shí)，藍(lán)莓花青素的提取量開始降低?？赡苁且?yàn)椋S著提取劑的體積增大，與藍(lán)莓接觸面積增大，更易于花青素的提取，但是，當(dāng)料液達(dá)到飽和狀態(tài)后，提取劑的增加會(huì)在一定程度上增大其他雜質(zhì)的溶出，從而對(duì)花青素的提取效果造成影響，最終導(dǎo)致花青素提取量降低。因此，最佳料液比為1∶20（g/mL）。

圖4 料液比對(duì)花青素提取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of anthocyanin

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表2 可知，影響藍(lán)莓花青素提取量的主次順序?yàn)锳（提取溫度）＞C（提取時(shí)間）＞B（乙醇和檸檬酸體積比）＞D（料液比）。最優(yōu)組合為A1B1C3D2，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)該組合花青素的提取量為63.128 μg/g，均高于其他試驗(yàn)組。方差分析結(jié)果見表3。由表可以看出，提取溫度（A）、乙醇和檸檬酸體積比（B）、提取時(shí)間（C）、料液比（D）這四個(gè)因素都影響藍(lán)莓花青素提取量且影響都極顯著。

表3 方差分析表Table 3 Table of variance analysis

3 結(jié)論

采用溶劑提取法，以乙醇檸檬酸混合溶液為提取劑，提取藍(lán)莓中的花青素。試驗(yàn)得出最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度30 ℃，乙醇和檸檬酸的體積比3∶7，提取時(shí)間180 min，料液比1∶20（g/mL）。此時(shí)花青素的提取量為63.128 μg/g，溶劑提取法操作簡便，雖然提取時(shí)間較長，溶劑消耗量較大，但是所選用的乙醇和檸檬酸溶液不會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，與其它有機(jī)溶劑相比對(duì)環(huán)境友好，綠色環(huán)保。藍(lán)莓花青素作為一種安全無毒的天然色素，在食品和化妝品方面應(yīng)用前景廣泛。相信隨著提取方法的不斷發(fā)展，藍(lán)莓花青素在食品、化妝品等方面的應(yīng)用會(huì)更加廣泛。