王鳳蓮

天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院 (天津 300000)

GDM指在是指在懷孕期間出現(xiàn)的一種暫時性高血糖狀態(tài)。已有研究的結(jié)果可以證明產(chǎn)婦在妊娠期間發(fā)生腸道菌群的改變是與GDM有關。研究顯示，通過動物實驗，可以觀察到得出研究中被研究人員標記過的的細菌在新生小體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，并推測是由孕鼠的腸道傳遞的，因此，新生兒的腸道菌群的構(gòu)成可能會被產(chǎn)婦妊娠期糖尿病影響到。本研究采用Illumina 高通量測序技術對樣本進行檢測，在采用生物信息學操作使用Usearch 和 QIIME對新生兒的糞便樣本分析，對兩組24小時內(nèi)的糞便樣本均進行測序，近年來，更多的學者開始研究妊娠期糖尿病(GDM)與腸道菌群之間的關系。了解研究組(GDM組)新生兒出生后腸道菌群分布特點以及與對照組(健康組)新生兒菌群相對豐度的差異是該研究領域的重要內(nèi)容之一。腸道菌群是定植在人體腸道內(nèi)的正常微生物，這些微生物與人體代謝有密不可分的關系，因此腸道菌群被認為是一種隱藏在人體的器官。因此研究GDM與腸道菌群的關系對于深入了解GDM的發(fā)病機制和預防治療具有重要意義[1-3]。且腸道菌群多樣性的改變從而引起的腸道菌群失調(diào)和糖尿病有密切聯(lián)系[4,5]。

本研究擬以腸道菌群為研究對象，通過對其進行樣本純化，PCR擴增、樣本定量、文庫構(gòu)建測序。后續(xù)生物信息學操作使用Usearch 和 QIIME5等完成，統(tǒng)計和作圖主要使用R、python和java等來完成。研究結(jié)果顯示，僅有1%～10%的腸道細菌能夠進行培養(yǎng)，這提示我們，僅僅只使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法是無法充分反映腸道菌群的多樣性的，為了解決這個問題，研究人員使用變性梯度凝膠電泳(DGGE)、實時熒光定量PCR等非培養(yǎng)技術對腸道菌群進行研究。這些技術可以檢測出豐度較高或特定微生物的改變，從而更全面地了解腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能。最近的研究中，高通量測序技術增子測序已經(jīng)躍升成為研究環(huán)境微生物群組成和多樣性的常用以及首選方法。運用此方法研究腸道菌群的改變對GDM發(fā)病是否起重要作用，是否會出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局。

1 資料與方法

1.1 研究設計采用 Illumina 高通量測序技術對所有樣本的腸道菌群物種豐度、多樣性和構(gòu)成的變化趨勢進行分析，探討GDM產(chǎn)婦新生兒腸道菌群與不良妊娠結(jié)局試驗結(jié)果。

1.2 納入和排除標準樣本選取自2019年2月至2020年12月在本醫(yī)院定期產(chǎn)檢并分娩的產(chǎn)科、新生兒科的新生兒112例，胎齡≤37周或出生體重≤2500g。排除標準：住院天數(shù)<7的患兒。合并患有嚴重先天性心臟病、嚴重消化道畸形，唐氏綜合征、遺傳代謝病和重度窒息的早產(chǎn)兒。

1.3 GDM產(chǎn)婦新生兒腸道菌群失調(diào)和不良妊娠結(jié)局診斷依據(jù)[5-6]GDM產(chǎn)婦新生兒腸道菌群失調(diào)定義：(1)妊娠期糖尿病產(chǎn)婦腸道的重要益生菌的數(shù)量出現(xiàn)下降，同時高糖狀態(tài)改變了腸道的內(nèi)環(huán)境。(2)腸道內(nèi)PH值和厭氧環(huán)境的改變。在此基礎上腸道菌群的變化會對GDM產(chǎn)婦妊娠結(jié)局產(chǎn)生一定的影響。

1.4 樣本采集本實驗所用標本來源新生兒112例，其中GDM產(chǎn)婦新生兒糞便樣本48例，健康產(chǎn)婦新生兒糞便64例，涉及的所有患者及其家屬全部簽署知情同意書。所用膠回收試劑盒購于ThermoFisher公司；文庫的構(gòu)建系統(tǒng)購于NEW ENGLAND BioLabs公司；測序試劑盒購于Illumina公司 。實驗中對64個健康組和48個GDM組的新生兒新鮮糞便樣本進行初檢，使用特制訂的DNA提取試劑盒進行基因組DNA抽提后，電泳檢測DNA，然后再次進行樣本收集。選擇DNA序列的特定區(qū)域進行測序。Barcode是在測序過程中加入到引物中的一段序列，用于區(qū)分和識別不同的樣品。特異引物是針對特定DNA序列設計的引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)對DNA樣本的特定區(qū)域進行擴增，以增加其數(shù)量。為了增加實驗的可靠性，對每個樣本進行3次獨立的PCR反應，并且在每個PCR反應達到預設的擴增周期時停止。在PCR結(jié)束后，同一樣本的PCR產(chǎn)物收集并混合在一起，然后通過電泳進行檢測，以確認目標DNA片段的擴增情況?；厥誔CR的產(chǎn)物時選擇使用特制的試劑盒，回收目標的DNA片段前，使用TE緩沖液對DNA片段進行洗脫。根據(jù)電泳的初步檢測結(jié)果，對PCR的回收產(chǎn)物進行定量分析(使用Qubit2.0進行)，根據(jù)每個樣本的測序要求，將PCR回收產(chǎn)物按相應比例混合并且構(gòu)建成適用于PE250測序的文庫，進行測序以獲取DNA序列數(shù)據(jù)。然后對數(shù)據(jù)進行分析：(1)對數(shù)據(jù)的序列拼接；(2)根據(jù)Barcode的結(jié)果，辨別劃分樣品。(3)去除結(jié)果中所包含的低質(zhì)量序列。(4)去除數(shù)據(jù)中出現(xiàn)的嵌合體。(5)進行OTU聚類，標準：97%的相似性水平上。(6)從數(shù)據(jù)中挑選出OTU的代表性序列。(7)劃分物種分類信息，具體方法：使用物種分類數(shù)據(jù)庫進行；(8)將代表性序列進行對比并過濾，然后重構(gòu)建進化樹。(9)選擇不需要的OTU數(shù)據(jù)進行過濾，并對剩下的數(shù)據(jù)進行重抽樣；(10)計算各個分類水平上的有關信息，統(tǒng)計并觀察其它物種間的相關性等。

1.5 生物信息學分析將測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接、過濾后，使用生物信息學操作，如Usearch和QIIME5進行后續(xù)處理。在DNA純化、聚類和差異物種分析的基礎上，計算每個樣本在97%相似水平上的(OTU)數(shù)量，用特定的分類單元分別代表特定的物種。根據(jù)樣品測序產(chǎn)生的OTU的結(jié)果，對稀疏曲線進行繪制。并且計算單個樣本的Alpha多樣性(Shannon指數(shù))，所得指數(shù)越大則說明該樣本中的物種越豐富。統(tǒng)計樣本的物種豐度(門和科兩個分類)，并進行并行聚類分析。并對群落功能進行預測。

1.6 統(tǒng)計學分析本研究中所有數(shù)據(jù)均使用 SPSS 20.0 軟件包處理。以n(%)表示計數(shù)資料，比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況生物信息分析顯示：原始序列數(shù)據(jù)顯示堿基讀取錯誤率p越大，測序堿基質(zhì)量值越大。測序質(zhì)量越大(表1)。同時通過OTU聚類分析的樣品，對測序深度多樣性分析有一定影響。

表1 糞便樣本測序序列總結(jié)

2.2 群落組成分析顯示GDM組的樣本中含有門類水平放線菌門(Actinobacteria)高，健康組的樣本中幾乎不含有放線(Actinobacteria)；使用顏色深淺來表征豐度的高低，GDM組的樣本群落組成分析平均豐度(1.0-5.0)，健康組的樣本群落組成平均豐度(0.1-10)；GDM組的樣本門級別上和屬級別上豐度更高；GDM組的樣本水平高豐度類群低，約占有35%，健康組的樣本目級別上、科級別上和屬級別上豐度更高，健康組的樣本水平高豐度類群高，約占70%。同時群落組成的分析可在任一分類水平(包括OTU)進行。對比發(fā)現(xiàn)不同物種，豐度波動不同顏色越深，豐度波動越大。同時變異系數(shù)越大，豐度波動越大。

2.3 物種豐度及多樣性分析通過計算研究樣本的Alpha多樣性指數(shù)，得出腸道中微生物群落的豐度均勻性、多樣性等研究數(shù)據(jù)。研究分析對比2組樣本中腸道菌群的多樣性，可得出GDM組細菌生物群落的豐度及多樣性要小于健康組。具體可以通過Rank-Abundance 曲線(圖1)顯示：物種的豐度越高，則曲線在橫軸上的范圍就越大；曲線平滑程度反映檢測的物種的均度，曲線的變化越平緩，則物種分布越均勻。

圖1 Rank-Abundance 曲線。

各樣本的OUT(運算分類): GDM組新生兒出生后390,健康組新生兒出生后395;各樣本的 Shannon(香農(nóng)維納) 指數(shù): GDM組新生兒出生后3.2，健康組新生兒出生后3.5，均隨日齡增加呈升高趨勢。各樣本Simpson(微生物多樣性)指數(shù)：GDM組0.826534，健康組0.852960。如表2所示。

表2 Alpha多樣性分析

2.4 差異物種分析顯示為了弄清造成Beta多樣性上的差別，所進行差異物種分析。為了展示具有更大的豐度波動的物種，使用變異系數(shù)(CV)來衡量物種豐度的變異程度，分為變異系數(shù)最大的10個屬和最小的10個屬。最大的10個屬為：梭菌綱屬、變形菌門屬、巨單胞菌屬、糞球菌屬、氨基酸球菌屬、嗜黏蛋白阿克曼菌、無芽胞厭氧菌屬、小桿菌屬、考拉桿菌屬、普雷沃菌屬。最小的10個屬為：毛螺旋菌屬 、瘤胃球菌屬、溶血性鏈球菌屬、厚壁菌門屬、普雷沃氏菌屬、毛螺旋菌屬、假單胞菌屬、丁酸弧菌屬、瘤胃菌屬。結(jié)果見圖2：可見在屬的水平上選取總豐度大于0.1%的有。

圖2 異物種分析圖。注：圖中橫坐標為變異系數(shù)，縱坐標為屬，柱子越長，也就是越靠右代表變異系數(shù)越大。展示的是屬水平上變異系數(shù)最大的10個屬和最小的10個屬，用不同的顏色來表示以方便區(qū)分。

3 討 論

高通量測序技術進行測序后可以得出深度極深的測序數(shù)據(jù)，這是它所具有的優(yōu)勢，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法以及與以DNA為基礎的分子生物學方法相比，高通量測序技術具有更高的敏感性和更全面的覆蓋范圍，高通量測序技術可以測出低豐度細菌甚至是未知細菌，提供更加全面和準確的信息。其中，Illumina高通量測序技術是目前研究中，使用于腸道微生物研究中最前沿的監(jiān)測技術的其中之一。該技術能夠通過對腸道微生物群進行深度測序，提供有關菌群結(jié)構(gòu)、豐度、多樣性和功能的信息。通過這種方法，研究人員可以更深入地了解腸道微生物群落的組成和變化，進而揭示腸道微生物與人體健康之間的關聯(lián)。因此，高通量測序技術已成為腸道微生物研究的強大工具，為研究提供更好的工具，提供更加嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)。

既往研究表明，人體腸道內(nèi)有著特殊的微生物群落，它包括各種常見或特殊的細菌病毒等微生物，這些微生物的總量已經(jīng)超過1.5kg，這些微生物的基因組合是100倍的人基因組合。觀察人體腸道內(nèi)有益菌的種類的數(shù)量狀態(tài)等，在一定程度上可以幫助我們觀察機體的健康狀態(tài)。并且研究認為，糖尿病與人體體內(nèi)腸道菌群失調(diào)有一定關聯(lián)。糖尿病患者通常會有嚴重的腸道菌群失調(diào)[6-9]。本次研究顯示：GDM產(chǎn)婦新生兒樣本中腸道菌群數(shù)量、多樣性以及分布狀態(tài)較健康組呈現(xiàn)分散的趨勢，通常表現(xiàn)為GDM產(chǎn)婦新生兒腸道內(nèi)益生菌減少、致病菌增多等現(xiàn)象。

以前的文獻報道顯示[10,11]，腸道菌群的多樣性下降與代謝性疾病的發(fā)生有關，GDM就是一種代謝性疾病。GDM的發(fā)病機制復雜，產(chǎn)婦在妊娠期內(nèi)的垂體泌乳素、孕酮等會發(fā)生改變，這些變化會導致周圍的細胞組織減少對葡萄糖的利用，使血糖升高，進而發(fā)生妊娠期糖代謝異常。腸道菌群的協(xié)助下，人體才能完成對食物中的糖類的吸收和消化。因此，腸道菌群的情況也會對GDM產(chǎn)婦的胰島素也會有間接的影響。此外，腸道菌群進入人體后，某些條件下，致病菌會攜帶產(chǎn)出的脂多糖進入血液，這種脂多糖會增加腸道的通透性，增加產(chǎn)婦血液中的毒性，繼而會導致產(chǎn)婦機體內(nèi)的炎性細胞因子含量增加，間接參與了炎癥反應。這提示我們，腸道菌群會參與人體疾病的發(fā)生、進展[12]。對于GDM產(chǎn)婦而言，腸道菌群可能通過影響胰島素抵抗和炎癥反應來影響妊娠期糖代謝的異常改變。因此，研究腸道菌群在GDM中的作用對于預防和治療GDM具有重要意義[3]。 通過本次研究發(fā)現(xiàn)，GDM產(chǎn)婦新生兒腸道菌群在目級別上、科級別上和屬級別上豐度呈現(xiàn)出不同情況。這可能與GDM產(chǎn)婦新生兒腸道微生態(tài)環(huán)境遭受破壞有關。GDM產(chǎn)婦新生兒腸道菌群多樣性、豐度均要低于于健康產(chǎn)婦新生兒。

深入探究其原因，推測GDM產(chǎn)婦腸道的酸堿度和所產(chǎn)生的厭氧菌的環(huán)境由于產(chǎn)婦代謝產(chǎn)物增加而得到了改善，一些厭氧菌的數(shù)量降低。腸道的寄生菌通過一系列過程，改善胃腸功能。當平衡被打破機體的炎性反應隨之增加，糖代謝進一步加重，因此提示產(chǎn)婦在妊娠期，應該多補充益生菌，以此來減少腸道內(nèi)的毒素，可改善胰島素的抵抗[13,14]。并且發(fā)現(xiàn)GDM產(chǎn)婦新生兒不良菌落高于健康產(chǎn)婦新生兒，有益菌落低于健康產(chǎn)婦新生兒，這表明GDM產(chǎn)婦新生兒的不良妊娠結(jié)局與腸道菌群有緊密相關性。說明含量越低的厭氧菌，會導致增加妊娠不良結(jié)局的可能性[15]。這為臨床GDM產(chǎn)婦及其新生兒的早期預防、治療提供理論參考。

綜上所述，產(chǎn)婦新生兒糞便中富集細菌，GDM不僅對產(chǎn)婦新生兒的健康產(chǎn)生影響，還會影響他們腸道內(nèi)的菌群分布和相對豐度，導致腸道微生物多樣性降低。GDM產(chǎn)婦新生兒的腸道菌群會出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象，這使得他們的腸道菌群定植和演變受到內(nèi)部和外部因素的影響。這些變化顯著降低了腸道菌群的多樣性，影響了正常菌群的定植。為患有糖尿病家族史孕婦的早期篩查、干預提供支持,同時避免新生兒因其母在孕期因妊娠期糖尿病引起腸道菌落失調(diào)而導致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。