仇婭琪 尹海娜 王生月 臧長江* 余英英 李云夢 劉 拓 南冰禹 楊開倫 譚世新 米熱古麗·依馬木

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院 新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)重點實驗室,烏魯木齊 830052;2.莎車縣科學技術(shù)局,莎車 844700;3.新疆天山畜牧生物工程股份有限公司,昌吉 831100)

乳房炎即乳腺組織的炎癥,是由于物理損傷、化學刺激或某些病原體感染引起的乳腺組織炎癥[1],它是奶牛場中危害最大、投入最多、且難防治的疾病。其復雜的病因和多因素的性質(zhì)使其難以控制,最常見的因素是病原體感染,其中大腸桿菌、鏈球菌和金黃葡萄球菌是最常見的感染細菌,它們可以引發(fā)免疫反應或者生理損傷[2]。褪黑素(melatonin,MT)是由松果體以及其他組織器官分泌合成的一種吲哚胺雜環(huán)類化合物[3],具有抗炎[4]、抗氧化[5]、調(diào)節(jié)免疫[6]和抗凋亡[7]等多種生物學功能。研究發(fā)現(xiàn),脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是大腸桿菌等革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分,乳導管單獨灌注LPS能夠誘導乳腺炎的發(fā)生[8]。研究證明,MT可以提高LPS誘導小鼠的肝臟和脾臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽氧化物酶(GSH-Px)活性,并降低丙二醛(MDA)含量[9]。也有研究表明,MT可以對腹腔注射LPS誘導的小鼠神經(jīng)管缺損以及新生大鼠的腦損傷有保護作用[10-11],并且MT可以抑制LPS誘導巨噬細胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)和白細胞介素-6(IL-6)[12]。因此,利用MT的抗炎及抗氧化效應來緩解機體炎癥反應成為研究熱點。相對于奶牛,小鼠具有體積小、易操控、差異低等特點。前人通過建立小鼠乳腺炎模型,探究了蒲公英提取物[13]、丹參多糖[14]、膽酸[15]等對小鼠乳腺炎的減輕作用。因此,本試驗在灌胃MT的同時通過乳腺導管注射LPS構(gòu)建小鼠乳腺炎模型,檢測小鼠血清中炎性因子及抗氧化指標的變化,旨在探究MT在體內(nèi)對乳腺炎小鼠的防治作用,為MT防治奶牛乳腺炎提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇體重為30 g左右、6～8周齡的無特定病原體(SPF)雌、雄ICR系小鼠(購自新疆醫(yī)科大學動物中心)為試驗動物。適應性飼喂7 d之后,將雄、雌鼠按照1∶2的比例進行合籠,自然交配懷孕后,單籠進行飼養(yǎng)。

1.2 試驗材料

LPS(來源于大腸桿菌055∶B5,L2880)購自美國Sigma公司;MT(分析純,純度≥98%,E120134)購自上海安耐吉化學有限公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、白細胞介素-10(IL-10)、SOD、GSH-Px、過氧化氫酶(CAT)、MDA檢測試劑盒均購自北京華英生物技術(shù)研究所;微型注射針(32G,4 mm)購自衢州舒克特醫(yī)療器械有限公司;眼科顯微鑷子、顯微剪刀、小鼠灌胃針(12號,55 mm)均購自中科生命生物科技(北京)有限公司;其他常規(guī)試劑均為國藥產(chǎn)品分析純。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 小鼠乳房炎模型的建立

選取14只健康的產(chǎn)后7～14 d的母鼠,隨機分為對照組和LPS組,每組7只。母鼠腹腔注射4%水合氯醛溶液進行麻醉,完全麻醉后,使用眼科手術(shù)鑷夾住乳頭,并用眼科手術(shù)剪剪去第4對乳腺的乳尖1 mm左右,從而暴露出乳腺導管。用微型注射器吸取50 μL濃度為0.2 mg/mL的LPS溶液,分別注入兩側(cè)的乳腺導管,注入時針頭插入深度為3～4 mm[10]。LPS誘導24 h后,先采用眼球摘除法取血,然后使用斷頸法致小鼠死亡,采集第4對乳腺組織于4%多聚甲醛中保存,用于制作病理組織學切片。

1.3.2 MT對小鼠乳腺炎的防治作用

選取56只健康的產(chǎn)后3～5 d母鼠,隨機分為4組,每組14只?？瞻讓φ战M和模型組每日灌胃0.2 mL生理鹽水,MT低、高劑量組每日分別按照1、2 mg/kg BW的劑量灌胃MT(溶于0.2 mL生理鹽水)。共灌胃14 d,分別于第7、14天灌胃4 h后,從模型組與MT低、高劑量組各挑選7只小鼠采用1.3.1中方法構(gòu)建乳腺炎模型,LPS誘導24 h處死并采取血液及乳腺組織樣品。

1.4 乳腺組織切片制作

首先將在4%多聚甲醛中保存的乳腺組織取出,然后依次進行沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋,隨后切成4～5 μm的切片,平鋪于干凈的載玻片上,45 ℃烘4～5 h,最后進行蘇木精-伊紅(HE)染色,中性樹脂封片,顯微鏡下觀察乳腺組織病理變化。

1.5 小鼠血清及乳腺組織中炎性細胞因子含量、抗氧化指標的測定

將采取的血液放入離心管中,靜置4 h后離心收集血清;在乳腺組織中加入磷酸鹽緩沖液進行研磨,離心取上清。樣品處理后,用試劑盒測定炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)的含量與抗氧化指標(SOD、GSH-Px、CAT、MDA)的活性或含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2021進行初步整理,然后用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。對小鼠乳腺炎模型建立中血清、乳腺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗;對MT對小鼠乳腺炎的防治作用中相關(guān)指標數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,并采用Duncan氏法進行多重比較。結(jié)果以平均值±標準差表示。以P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,P>0.05表示差異不顯著。用GraphPad Prism 9.0軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠乳腺炎模型的建立

2.1.1 LPS誘導后小鼠乳腺組織眼觀病理結(jié)果

如圖1所示,小鼠的乳腺經(jīng)過LPS刺激后,有明顯的發(fā)紅、出血的癥狀。

圖1 肉眼觀察剖檢后的乳腺組織變化Fig.1 Changes of mammary tissue after autopsy by naked eye

2.1.2 LPS誘導后小鼠乳腺組織病理組織學變化

如圖2所示,對照組乳腺腺泡分布均勻,形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,無炎性細胞浸潤;LPS組乳腺腺泡分布不均勻,腺泡遭到破壞,腺泡壁有明顯的水腫、增厚等變化,泡腔中產(chǎn)生了大量的嗜中性粒細胞、炎性細胞。

圖2 乳腺組織病理組織學變化Fig.2 Histopathological changes of mammary tissue (100×)

2.1.3 LPS誘導對小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響

如圖3所示,與對照組相比,LPS組小鼠血清中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均極顯著升高(P<0.01)。

LPS組數(shù)據(jù)柱標注##表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。圖4同。Date column of LPS group with ## represents extremely significant difference compared with control group (P<0.01). The same as Fig.4.圖3 LPS對小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響Fig.3 Effects of LPS on TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in serum of mice (n=7)

2.1.4 LPS誘導對小鼠乳腺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響

如圖4所示,與對照組相比,LPS組小鼠乳腺組織中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均極顯著升高(P<0.01)。

圖4 LPS對小鼠乳腺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響Fig.4 Effects of LPS on TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in mammary tissue of mice (n=7)

2.2 MT對LPS誘導的小鼠乳腺組織病理組織學變化的影響

MT對LPS誘導的小鼠乳腺組織病理組織學變化的影響見圖5。試驗第7和14天,空白對照組小鼠乳腺腺泡分布均勻,形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,無炎性細胞(圖5-A、圖5-E);而模型組小鼠乳腺腺泡分布不均勻,并且腺泡遭到了破壞,腺泡壁有明顯水腫、增厚等變化,同時泡腔中浸潤了大量的嗜中性粒細胞、炎性細胞(圖5-B、圖5-F)。灌胃MT 7 d后,小鼠乳腺組織腺泡中的嗜中性粒細胞、炎性細胞數(shù)量減少,但是不明顯,MT高劑量組的效果略大于MT低劑量組(圖5-C、圖5-D)。灌胃MT 14 d后,乳腺組織細胞壁結(jié)構(gòu)逐漸恢復完整,炎性癥狀得到緩解,嗜中性粒細胞、炎性細胞大大減少(圖5-G、圖5-H),MT高劑量組的效果略大于MT低劑量組。

2.3 MT對LPS誘導的小鼠血清中炎性細胞因子含量的影響

如圖6所示,試驗第7和14天,經(jīng)過LPS誘導后,模型組小鼠血清中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量與空白對照組相比均極顯著升高(P<0.01),而抗炎細胞因子IL-10的含量則極顯著降低(P<0.01)。灌胃MT 7 d后,與模型組相比,MT低、高劑量組小鼠血清中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量極顯著降低(P<0.01),而抗炎細胞因子IL-10的含量極顯著升高(P<0.01),且MT高劑量組的變化幅度略大于MT低劑量組,但差異不顯著(P>0.05);灌胃MT 14 d后,小鼠血清中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抗炎細胞因子IL-10含量的變化趨勢與灌胃MT 7 d后相同。

Con:空白對照組;LPS:模型組;MT1:MT低劑量組;MT2:MT高劑量組。模型組數(shù)據(jù)柱標注##表示與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)。MT低或高劑量組標注**表示與模型組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。Con: blank control group; LPS: model group; MT1: low-dose MT group; MT2: high-dose MT group. Date column of model group with ## represents extremely significant difference compared with blank control group (P<0.01). Date column of low-dose or high-dose MT group with ** represents extremely significant difference compared with model group (P<0.01). The same as below.圖6 MT對LPS誘導的小鼠血清中炎性細胞因子含量的影響Fig.6 Effects of MT on serum inflammatory cytokine contents of mice induced by LPS (n=7)

2.4 MT對LPS誘導的小鼠血清中抗氧化指標的影響

如圖7所示,試驗第7和14天,經(jīng)過LPS誘導后,與空白對照組相比,模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px與CAT活性極顯著降低(P<0.01),MDA含量極顯著升高(P<0.01)。無論是灌胃MT 7 d后還是14 d后,與模型組相比,MT低、高劑量組小鼠均表現(xiàn)為血清中SOD、GSH-Px與CAT活性極顯著增強(P<0.01),MDA含量極顯著降低(P<0.01),且MT高劑量組的變化幅度略大于MT低劑量組,但差異不顯著(P>0.05)。

圖7 MT對LPS誘導的小鼠血清中抗氧化指標的影響Fig.7 Effects of MT on serum antioxidant indexes of mice induced by LPS (n=7)

3 討 論

3.1 小鼠乳腺炎模型的建立

乳腺炎是奶牛養(yǎng)殖場中高發(fā)的傳染病,該疾病不僅會導致乳產(chǎn)量及乳品質(zhì)的下降,而且會提高飼養(yǎng)成本,對養(yǎng)殖者的經(jīng)濟效益產(chǎn)生不利影響。由于小鼠和奶牛乳腺組織之間的相似性,作為一種替代方法,Chandler[16]在1970年成功建立了小鼠乳腺炎模型,為解決奶牛乳腺炎問題提供了良好的平臺。

革蘭氏陰性菌是引起奶牛乳腺炎的常見病原體[17],LPS是大腸桿菌等革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分,當機體受到LPS刺激時,細胞會產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎介質(zhì),誘導嗜中性粒細胞和淋巴細胞的產(chǎn)生,從而介導炎癥反應[18]。張弛[19]、許店文[20]在小鼠第4對乳腺每側(cè)灌注50 μL濃度為0.2 mg/mL的LPS構(gòu)建小鼠乳腺炎模型,通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定乳腺組織和血清中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β的含量,結(jié)果顯示構(gòu)建乳腺炎模型小鼠上述促炎細胞因子的含量極顯著升高;此外,由于促炎細胞因子的作用,大量的嗜中性粒細胞和炎性細胞聚集在乳腺腺泡泡腔中,同時腺泡壁有明顯的水腫、增厚等變化。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相同。這是由于當機體乳腺組織發(fā)生明顯的炎性反應時,大量的嗜中性粒細胞從血管中滲出,并向發(fā)生炎癥的組織移動聚集[21]。

因此,結(jié)合本試驗中小鼠乳腺組織病理學變化結(jié)果以及血清和乳腺組織中促炎細胞因子含量的變化,證實在第4對乳腺每側(cè)灌注50 μL濃度為0.2 mg/mL的LPS即可成功構(gòu)建小鼠乳腺炎模型。

3.2 MT對LPS誘導的小鼠乳腺炎的防治作用

研究發(fā)現(xiàn),LPS可以與細胞膜上的Toll樣受體4(TLR4)相結(jié)合,從而激活核因子-κB(NF-κB)信號通路,被激活的NF-κB轉(zhuǎn)位進入細胞核后,會產(chǎn)生大量的促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β與IL-6,這些促炎細胞因子可以刺激免疫細胞、內(nèi)皮細胞和其他細胞產(chǎn)生更多的活性氧(ROS)、NO、過氧化氫(H2O2)等自由基的生成,持續(xù)激活炎癥信號通路,并進一步引發(fā)炎癥反應和氧化應激,導致細胞損傷,甚至細胞凋亡和死亡[22]。

MT是一種脂溶性物質(zhì),可以穿過細胞膜作用于各種細胞器,具有抗應激、抗炎、促進睡眠、改善情緒、調(diào)節(jié)生殖和增強免疫等多種生理學功能[23-24]。此外,MT本身及其代謝物也是有效的抗氧化劑和自由基清除劑,可以通過自身吲哚環(huán)上的5-甲氧基吸收ROS,將其轉(zhuǎn)變?yōu)榉茄趸镔|(zhì),MT變成低毒的中間產(chǎn)物N1-乙酰-N2-甲酰-5-甲氧犬尿酞胺,成為比自身抗氧化能力更強的物質(zhì),清除更多的ROS[25]。MT主要在肝臟中代謝,經(jīng)腎臟排出[26],其代謝物可通過電子轉(zhuǎn)移、金屬螯合等機制的方式,修復生物靶點,發(fā)揮聯(lián)合抗氧化作用[27]。此外,MT還可以通過核受體抑制NF-κB的表達和激活,阻止其轉(zhuǎn)移到細胞核并與DNA結(jié)合,并激活DNA修復機制,減少炎癥介質(zhì)的合成,調(diào)節(jié)炎癥因子的表達,從而減輕炎癥反應的程度[28]。

研究表明,炎癥反應過程中,TNF-α、IL-1β以及IL-6都是非常重要的細胞因子,在體內(nèi)引發(fā)和擴大炎癥反應中具有重要的信息傳遞作用[29]。當血管內(nèi)皮細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細胞因子含量升高后,會使白細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞上,導致血管壁通透性增強,嗜中性粒細胞從血管中滲出,從而啟動炎癥級聯(lián)反應,造成乳腺組織炎性病理損傷[30]。IL-10是一種重要的抗炎細胞因子,主要由T輔助細胞產(chǎn)生,通過下調(diào)細胞因子受體及其下游信號通路的表達來抑制促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等的過度表達,從而減緩炎癥反應過程[31]。李洪洋等[32]研究表明,使用濃度為10 μg/mL的LPS刺激奶牛乳腺上皮細胞12 h,再經(jīng)不同劑量(1、5、10、50、100 μmol/L)的MT處理48 h后發(fā)現(xiàn),注射不同劑量的MT均能夠顯著抑制LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的升高。本試驗測定了LPS誘導的小鼠血清中炎性細胞因子的含量,結(jié)果表明,MT可以極顯著抑制LPS誘導的小鼠血清中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量的升高和抗炎細胞因子IL-10含量的降低,從而緩解LPS誘導的乳腺炎癥反應。與本試驗結(jié)果相似,有研究發(fā)現(xiàn),在小鼠乳腺導管灌注50 μL濃度為0.2 mg/mL的LPS溶液1 h后,再靜脈注射不同濃度(5、10、20 mg/kg)的MT,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的MT均可以減輕LPS誘導的乳腺損傷,抑制LPS誘導的小鼠乳腺組織和乳腺上皮細胞中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的產(chǎn)生[33],表明MT對LPS誘導的小鼠乳腺炎癥有緩解作用。

氧化還原平衡是維持機體正常生命活動的必要條件之一,當細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS時,會直接攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸,導致脂質(zhì)過氧化反應的發(fā)生,從而破壞細胞膜的完整性和穩(wěn)定性。與此同時,ROS的大量產(chǎn)生還會降低細胞內(nèi)抗氧化酶的活性,從而加劇氧化應激反應,當抗氧化酶無法有效清除自由基時,自由基堆積將導致細胞膜和其他生物大分子的氧化損傷,嚴重時會導致細胞損傷和死亡[34]。有研究表明,MT對大鼠腦高壓氧誘導的氧化應激有保護作用,可以增強抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性[35]。也有研究表明,飼喂外源MT可以增強大鼠部分內(nèi)臟及腦中SOD和GSH-Px等抗氧化酶的活性,減少NO、ROS等自由基的生成,從而抑制脂質(zhì)過氧化反應,降低LPS對機體的氧化損傷[36-37]。在本試驗中,灌胃MT可極顯著提高LPS誘導的小鼠血清中SOD、GSH-Px和CAT活性,并極顯著降低MDA含量。

綜上所述,LPS誘導小鼠乳腺炎的炎癥過程會伴隨著機體氧化應激反應的發(fā)生,產(chǎn)生大量的ROS,導致促炎細胞因子的釋放,通過破壞細胞膜造成乳腺組織損傷。而MT可以緩解LPS造成的小鼠乳腺組織損傷,其除了通過本身所具有的抗氧化特性直接消除有毒的氧衍生物外,還可以通過增強抗氧化酶的活性間接起到抗氧化劑的作用,從而抑制炎癥反應,緩解氧化應激[38]。

4 結(jié) 論

① 在小鼠第4對乳腺兩側(cè)的乳腺導管各灌注50 μL濃度為0.2 mg/mL的LPS可以成功構(gòu)建小鼠乳腺炎模型。

② MT可以抑制促炎細胞因子的分泌,促進抗炎細胞因子的分泌,同時增強抗氧化酶活性,抑制氧化應激反應,從而改善LPS造成的小鼠乳腺組織病理損傷。