李 偉 李 想 葉柏平 阿茹娜 崔曉婧 胡三龍 周治宇 程 陽(yáng) 李冬冬 吳 浩 周振明

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

剩余采食量(residual feed intake,RFI)是動(dòng)物實(shí)際采食量與其基于維持能量需求和生長(zhǎng)速率的預(yù)測(cè)采食量之間的差值,是一個(gè)負(fù)向選擇性狀,且具有較高的遺傳力[1-3],RFI越低,動(dòng)物飼料效率越高[4]。瘦素主要在脂肪細(xì)胞中產(chǎn)生,通過(guò)與下丘腦瘦素受體相互作用,調(diào)節(jié)采食量、體重及能量消耗,且血清瘦素含量與體重、食物攝取量和體脂有關(guān)[5-6]。鑒于瘦素的生物學(xué)特性及其對(duì)干物質(zhì)采食量(dry matter intake,DMI)的調(diào)節(jié)作用以及血漿生物標(biāo)志物的高靈敏度和高特異性,瘦素有可能被用作肉牛采食量、生長(zhǎng)和飼料效率等生產(chǎn)性狀的生物標(biāo)志物。以往研究表明,育肥肉牛的血清瘦素含量與RFI呈正相關(guān)[7-9],低剩余采食量(low residual feed intake,LRFI)內(nèi)洛爾(Nellore)公牛血漿循環(huán)瘦素及其基因表達(dá)量更多[10],LRFI閹牛脂肪組織瘦素mRNA表達(dá)量更高[11]。然而,也有研究認(rèn)為,瘦素和RFI之間沒(méi)有明確相關(guān)性[12]。此外,血清瘦素參與糖和脂代謝、能量消耗及炎癥反應(yīng)等多種生物過(guò)程的調(diào)節(jié)[13]。盡管前人對(duì)瘦素的生理作用進(jìn)行了大量的研究,但對(duì)瘦素與反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)性能或飼料效率和表型的關(guān)系尚無(wú)定論,因此本試驗(yàn)旨在通過(guò)評(píng)估肥育肉牛血清瘦素含量與生長(zhǎng)性能和脂代謝指標(biāo)之間的表型關(guān)系,為后續(xù)血清瘦素作為生物標(biāo)志物在肉牛生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼養(yǎng)管理

選取60頭體況良好、健康的640～720日齡安格斯肥育閹牛[(634.4±53.35) kg],隨機(jī)分配到帶有采食量自動(dòng)記錄系統(tǒng)(上海正宏農(nóng)牧機(jī)械設(shè)備有限公司)的4個(gè)圍欄中進(jìn)行圈養(yǎng)飼養(yǎng),每個(gè)圍欄設(shè)有10個(gè)采食槽,測(cè)定每頭肉牛每日的實(shí)際采食量。預(yù)試期14 d,正試期63 d。試驗(yàn)期間肉牛自由采食,充足飲水。每天08:00和16:00投喂2次,每4周采集1次飼料樣品,60 ℃烘48 h制備風(fēng)干樣,測(cè)定常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量。每7 d采集2次全混合日糧(total mixed ration,TMR)和剩料樣本,105 ℃烘干24 h,用于測(cè)定其干物質(zhì)含量,并計(jì)算肉牛每日DMI。根據(jù)NASEM(2016)[14]生長(zhǎng)肥育牛日營(yíng)養(yǎng)需要量和飼糧評(píng)估肉牛營(yíng)養(yǎng)需要配制試驗(yàn)期飼糧,基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照AOAC(2000)[15],中性洗滌纖維含量的測(cè)定參照Van Soest等[16]的方法。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在正試期的第1、2、31、32、62和63天晨飼前對(duì)肉牛進(jìn)行稱(chēng)重并記錄體重?cái)?shù)據(jù),計(jì)算平均日增重(ADG);根據(jù)采食量自動(dòng)記錄系統(tǒng)采集每頭牛每日的采食量,結(jié)合測(cè)定的飼糧干物質(zhì)含量計(jì)算DMI;利用DMI和ADG計(jì)算增重飼料比(gain to feed ratio,G/F)。通過(guò)對(duì)每頭肉牛的DMI、中期代謝體重(mid-trial metabolic weight,MMW)以及ADG進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析,計(jì)算每頭肉牛預(yù)測(cè)的DMI,再用預(yù)測(cè)的DMI減去實(shí)際的DMI得到每頭肉牛的RFI[17]。根據(jù)RFI的數(shù)值大小將這些肉牛分為高剩余采食量(high residual feed intake,HRFI)(RFI>平均值+0.5標(biāo)準(zhǔn)差)肉牛和LRFI(RFI<平均值-0.5標(biāo)準(zhǔn)差)肉牛,采集上述肉牛的血液和瘤胃液,檢測(cè)血清瘦素含量、脂代謝指標(biāo)、血清生化指標(biāo)及瘤胃發(fā)酵參數(shù),并通過(guò)t檢驗(yàn)和相關(guān)性分析比較HRFI肉牛和LRFI肉牛的生長(zhǎng)性能、血清生化參數(shù)、脂代謝指標(biāo)和瘤胃發(fā)酵參數(shù)的差異以及血清瘦素含量、RFI和脂代謝指標(biāo)之間的關(guān)系。相關(guān)計(jì)算公式如下:

ADG(kg/d)=(終末體重-初始體重)/試驗(yàn)天數(shù);
DMI(kg)=日采食量×飼糧干物質(zhì)含量;
G/F=ADG/DMI;
RFI=β0+β1MMW+β2ADG-DMI;
MMW=MidtestBW0.75。

式中:β0為線(xiàn)性回歸方程截距;β1為試驗(yàn)MMW的回歸系數(shù);β2為ADG的回歸系數(shù);DMI為肉牛實(shí)際DMI;MidtestBW為肉牛試驗(yàn)中期體重。

1.3 樣品及數(shù)據(jù)采集

在飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,第64天,通過(guò)口腔胃管于晨飼前采集待測(cè)動(dòng)物的瘤胃液,舍棄前段瘤胃液,用醫(yī)用紗布過(guò)濾,然后置于螺紋凍存管中,于液氮中儲(chǔ)存。通過(guò)尾根靜脈采集動(dòng)物的血液樣本,靜置30 min后,4 ℃低溫4 000 r/min離心10 min,離心結(jié)束后取血清分裝于0.5 mL的離心管中,-20 ℃冷凍保存,用于測(cè)定血清瘦素含量以及血清生化和抗氧化指標(biāo);在背中線(xiàn)左側(cè)5 cm倒數(shù)第1肋和第2肋之間,通過(guò)超聲診斷儀(ECM ref. 90-1119,Exago)評(píng)估牛背膘厚度和眼肌面積。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 血清瘦素含量及脂肪沉積和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

血清瘦素含量采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法,使用瘦素放射免疫試劑盒(KJHE-000301B,北京康佳宏原生物科技有限公司)通過(guò)Multiskan MK12酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific)測(cè)定;血清游離脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)含量通過(guò)微板法(A042-2-1試劑盒,南京建成生物工程研究所)使用分光光度計(jì)[Unico7200,尤尼柯(上海)儀器有限公司]測(cè)定;血清高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、葡萄糖(glucose,GLU)、總蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、球蛋白(globulin,GLB)和尿素氮(urea nitrogen,UN)含量使用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀(日立7600)檢測(cè)。

1.4.2 血清生化指標(biāo)

血清生化指標(biāo)采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀(日立7600)測(cè)定,測(cè)定指標(biāo)包括血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)活性以及總膽紅素(total bilirubin,TBiL)、肌酐(creatinine,CREA)含量。

1.4.3 血清抗氧化指標(biāo)

血清抗氧化指標(biāo)采用比色法,使用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定,測(cè)定指標(biāo)包括總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)和總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)。

1.4.4 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

采用pH計(jì)(PHS-3C,上海雷磁儀器廠(chǎng))測(cè)定pH;采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定氨態(tài)氮(ammonia nitrogen,NH3-N)含量[18];采用氣相色譜法測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)含量[19];微生物蛋白(microprotein,MCP)含量參考Makkar等[20]的考馬斯亮藍(lán)法,使用酶標(biāo)儀(AW-87,北京科動(dòng)力儀器有限公司)測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理,使用SAS 9.4軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),并使用R語(yǔ)言4.2.3進(jìn)行相關(guān)性分析和熱圖制作。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,0.05≤P<0.10表示差異有顯著趨勢(shì)。

2 結(jié) 果

2.1 RFI對(duì)安格斯肉牛生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知,LRFI肉牛和HRFI肉牛間初始體重、終末體重、MMW和ADG差異不顯著(P>0.05),LRFI肉牛RFI和DMI極顯著低于HRFI肉牛(P<0.01),LRFI肉牛G/F極顯著高于HRFI肉牛(P<0.01)。

表2 RFI對(duì)安格斯肉牛生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of RFI on growth performance of Angus beef cattle

2.2 RFI對(duì)安格斯肉牛血清瘦素含量及脂肪沉積和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

由表3可知,LRFI肉牛血清瘦素含量和眼肌面積顯著高于HRFI肉牛(P<0.05),背膘厚度以及血清LDL和VLDL含量極顯著低于HRFI肉牛(P<0.01),血清HDL、NEFA、TC、TG、GLU、TP、ALB、GLB和UN含量以及白球比(A/G)與HRFI肉牛均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 RFI對(duì)安格斯血清瘦素含量及脂肪沉積和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)的影響Table 3 Effects of RFI on serum leptin content and fat deposition and protein metabolism related indices of Angus beef cattle

2.3 RFI對(duì)安格斯肉牛血清生化和抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知,LRFI肉牛血清ALP活性有低于HRFI肉牛的趨勢(shì)(P=0.074),血清ALT活性有高于HRFI肉牛的趨勢(shì)(P=0.055),其他血清生化和抗氧化指標(biāo)與HRFI肉牛差異均不顯著(P>0.05)。

表4 RFI對(duì)安格斯肉牛血清生化和抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of RFI on serum biochemical and antioxidant indices of Angus beef cattle

2.4 RFI對(duì)安格斯肉牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表5可知,不同RFI肉牛間瘤胃pH以及NH3-N、總揮發(fā)性脂肪酸(total volatile fatty acid,TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。LRFI肉牛瘤胃MCP含量顯著高于HRFI組(P<0.05),瘤胃乙酸(P=0.086)和乙酸/丙酸(A/P)值(P=0.084)有高于HRFI肉牛的趨勢(shì),瘤胃異戊酸(P=0.050)和戊酸(P=0.066)含量有低于HRFI肉牛的趨勢(shì)。

表5 RFI對(duì)安格斯肉牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 5 Effects of RFI on rumen fermentation parameters of Angus beef cattle

2.5 相關(guān)性分析

如圖1所示,RFI與DMI、背膘厚度以及血清LDL和VLDL含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與G/F、血清瘦素含量、眼肌面積、血清ALT活性以及瘤胃MCP含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05);血清瘦素含量與RFI、背膘厚度以及血清VLDL和GLU含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),與G/F和血清CREA含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

RFI:剩余采食量 residual feed intake;ADG:平均日增重 average daily gain;MMW:中期代謝體重 mid-trial metabolic weight;DMI:干物質(zhì)采食量 dry matter intake;G/F:增重飼料比 gain to feed ratio;LEP:瘦素 leptin;BF:背膘厚度 backfat thickness;LM:眼肌面積 loin muscle aera;NEFA:游離脂肪酸 non-esterified fatty acid;HDL:高密度脂蛋白 high-density lipoprotein;LDL:低密度脂蛋白 low-density lipoprotein;VLDL:極低密度脂蛋白 very low-density lipoprotein;TC:總膽固醇 total cholesterol;TG:甘油三酯 triglyceride;GLU:葡萄糖 glucose;UN:尿素氮 urea nitrogen;TP:總蛋白 total protein;ALB:白蛋白albumin;GLB:球蛋白 globulin;A/G:白球比 albumin/globulin;ALT:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 alanine aminotransferase;AST:天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 aspartate aminotransferase;ALP:堿性磷酸酶 alkaline phosphatase;TBiL:總膽紅素 total bilirubin;CREA:肌酐 creatinine;T-SOD:總超氧化物歧化酶 total superoxide dismutase;T-AOC:總抗氧化能力 total antioxidant capacity;NH3-N:氨態(tài)氮 ammonia nitrogen;MCP:微生物蛋白 microprotein;TVFA:總揮發(fā)性脂肪酸 total volatile fatty acid;Acetate:乙酸;Propionate:丙酸;A/P:乙酸/丙酸 acetate/propionate;Isobutyrate:異丁酸;Butyrate:丁酸;Isovalerate異戊酸;Valerate:戊酸。圖1 每個(gè)表型的成對(duì)相關(guān)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)熱圖Fig.1 Heatmap of Pearson’s correlation coefficient of pairwise correlation of each phenotype

3 討 論

3.1 血清瘦素與RFI、生長(zhǎng)性能和脂代謝相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系

血清瘦素是一種由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的激素,其主要功能是通過(guò)調(diào)節(jié)食欲和能量代謝來(lái)維持體重平衡[21],是肉牛DMI的潛在調(diào)控分子,但其與RFI的關(guān)系尚不明確。本研究觀(guān)測(cè)到,與HRFI肉牛相比,LRFI肉牛的RFI和DMI顯著降低,G/F顯著提高,這與前人的試驗(yàn)結(jié)果[22-24]一致。此外,本試驗(yàn)顯示血清瘦素含量與RFI呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,即LRFI肉牛血清瘦素含量更高;而且,血清瘦素含量與G/F呈正相關(guān)關(guān)系,即G/F高的肉牛血清瘦素含量更高。2種飼料效率的衡量指標(biāo)結(jié)果都表明,飼料效率高的肉牛血清瘦素含量更高,這表明血清瘦素含量有作為篩選LRFI或高飼料效率肉牛生物標(biāo)志物的潛力。

LRFI動(dòng)物脂肪沉積更少,血液循環(huán)膽固醇含量降低[25],并且能夠更有效地利用能量[26]和蛋白質(zhì)[27-28]。在Taussat等[29]對(duì)夏洛萊牛的研究中,RFI與肌肉含量呈負(fù)相關(guān),與脂肪含量呈正相關(guān),這與本試驗(yàn)觀(guān)測(cè)到的LRFI肉牛更薄的超聲背膘厚度、更大的超聲眼肌面積以及更高的瘤胃MCP含量和血清TP含量結(jié)果一致。血清VLDL及其脂解轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)DL是與脂質(zhì)代謝相關(guān)的指標(biāo),分別在腸道和肝臟中產(chǎn)生,在血流中運(yùn)輸大部分膽固醇和TG[30]。由相關(guān)性分析得出,血清瘦素含量與RFI、背膘厚度和血清VLDL含量呈顯著負(fù)相關(guān),RFI與DMI、背膘厚度以及血清LDL和VLDL含量呈顯著正相關(guān)。即血清瘦素含量高的肉牛脂肪沉積水平更低(更薄的背膘厚度和更低的血清VLDL含量),膽固醇和TG外周轉(zhuǎn)運(yùn)更少;同時(shí),血清瘦素含量更高的肉牛飼料效率更高,DMI更低,這可能是由于在沒(méi)有瘦素抵抗的情況下,瘦素能夠有效地減少食物攝入并增加能量消耗,從而減少脂質(zhì)積累[31],并促進(jìn)骨骼肌脂質(zhì)代謝的分解代謝調(diào)節(jié)和脂肪酸的利用,以產(chǎn)生能量并減少肌內(nèi)脂質(zhì)積累[32]。這論證了瘦素對(duì)采食量和脂肪沉積的調(diào)控作用[33]。然而,有一些研究認(rèn)為,血清瘦素含量與RFI呈正相關(guān)[7-9],還有研究認(rèn)為瘦素與RFI之間沒(méi)有相關(guān)性[12,34]。這可能與過(guò)度肥胖而產(chǎn)生的瘦素耐受有關(guān),即對(duì)較大比例的身體脂肪,產(chǎn)生的瘦素含量升高也無(wú)法控制饑餓和調(diào)節(jié)身體脂肪[35]。

3.2 RFI與瘤胃發(fā)酵參數(shù)的關(guān)系

瘤胃發(fā)酵參數(shù)與RFI之間存在一定的關(guān)系,但受到多種因素的影響。Guan等[36]報(bào)道稱(chēng),LRFI肉牛瘤胃TVFA含量更高,瘤胃丁酸和戊酸含量也更高;梁玉生[37]研究表明,LRFI育肥湖羊瘤胃丙酸含量較高,且瘤胃A/P值較低,瘤胃發(fā)酵趨于丙酸型發(fā)酵。也有研究表明,瘤胃發(fā)酵參數(shù)與RFI不存在顯著相關(guān)關(guān)系,反而是飼糧組成對(duì)瘤胃細(xì)菌發(fā)酵的影響更加重要[38-39]。本研究表明,不同RFI肉牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)除MCP含量外均無(wú)顯著差異,LRFI肉牛瘤胃乙酸含量和A/P值有高于HRFI肉牛的趨勢(shì),瘤胃異戊酸和戊酸含量有低于HRFI肉牛的趨勢(shì)。針對(duì)這一結(jié)果,筆者認(rèn)為T(mén)VFA和NH3-N結(jié)果的差異可能是由于口腔胃管插入瘤胃位置的不同而導(dǎo)致的,采樣部位可能是造成經(jīng)由口腔胃管獲得的瘤胃液發(fā)酵參數(shù)差異的主要因素。與中央或腹側(cè)瘤胃相比,顱背側(cè)瘤胃的pH及氨和鈉含量顯著提高,乙酸、丙酸和丁酸含量顯著降低[40]。由于口腔胃管無(wú)法精確控制探頭所在的位置,因而得出的TVFA和NH3-N可能無(wú)法在同一水平上反映不同RFI肉牛的瘤胃發(fā)酵差異。具體VFA含量的差異則可能與飼糧類(lèi)型有關(guān)。McGovern等[39]研究發(fā)現(xiàn),在生長(zhǎng)階段采用高精料飼糧育肥時(shí),LRFI肉牛瘤胃丙酸和TVFA含量較低,這與本文結(jié)果一致。而當(dāng)提供青貯飼料作為飼糧時(shí),HRFI和LRFI牛之間沒(méi)有任何代謝物含量的差異,即對(duì)于TVFA含量與RFI之間的關(guān)系,飲食階段、年齡和品種是潛在的混雜因素,而RFI和瘤胃發(fā)酵特征之間的關(guān)聯(lián)并無(wú)顯著相關(guān)性。此外,本研究發(fā)現(xiàn)LRFI肉牛瘤胃MCP含量更高,MCP是反芻動(dòng)物易于消化吸收利用的優(yōu)質(zhì)蛋白,能夠提供肉牛生長(zhǎng)所需代謝蛋白質(zhì)的50%乃至全部[41-42]。因此,筆者認(rèn)為L(zhǎng)RFI肉牛瘤胃細(xì)菌對(duì)飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力更強(qiáng),消化每單位營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為肉牛提供的MCP也更多。

綜上可知,血清瘦素與RFI、生長(zhǎng)性能和脂肪沉積存在著密切的關(guān)系。血清瘦素含量高的肉牛RFI更低,飼料效率更高,生長(zhǎng)性能更佳,DMI更低,脂肪沉積指標(biāo)更低,其有可能成為快速篩選LRFI肉牛的生物標(biāo)志物。同時(shí),血清瘦素對(duì)飼料效率和脂代謝的具體調(diào)控機(jī)制值得進(jìn)一步探索,由于血清瘦素含量在喂養(yǎng)期間會(huì)發(fā)生變化,并且受到動(dòng)物性別的影響,因此通過(guò)多次采樣測(cè)定血清瘦素含量的平均值和通過(guò)屠宰試驗(yàn)測(cè)定胴體組成可能是必要的。

4 結(jié) 論

① 與HRFI肉牛相比,LRFI肥育安格斯肉牛在相似的ADG和MMW條件下表現(xiàn)出更低的DMI、更高的血清瘦素含量、更薄的背膘厚度、更大的眼肌面積、更高的瘤胃MCP含量和G/F以及更低的血清載脂蛋白含量。

② 血清瘦素含量與RFI、背膘厚度以及血清VLDL和GLU含量呈負(fù)相關(guān),與G/F和血清CREA含量呈正相關(guān);RFI與DMI、背膘厚度以及血清LDL和VLDL含量呈正相關(guān),與G/F、血清瘦素含量、眼肌面積、血清ALT活性以及瘤胃MCP含量呈負(fù)相關(guān)。

③ 血清瘦素含量可以作為篩選LRFI安格斯肉牛的潛在生物標(biāo)志物。