黃軍鵬 趙衛(wèi)國 楊趙軍 厲成敏*

(1.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院,鎮(zhèn)江 212100;2.山東美事達農(nóng)牧科技有限公司,濟南 251400)

圍產(chǎn)期是指奶牛產(chǎn)前3周到產(chǎn)后3周的生理階段,其飼養(yǎng)管理的水平直接影響奶牛的健康及產(chǎn)后生產(chǎn)性能的發(fā)揮。在此時期,奶牛能量需求增加,但干物質(zhì)的采食量下降,分娩后需進行大量泌乳活動,導(dǎo)致所需要的能量超過了干物質(zhì)采食量所提供的能量,造成奶牛處于能量負(fù)平衡狀態(tài)。能量負(fù)平衡不僅影響產(chǎn)奶量,嚴(yán)重情況下可導(dǎo)致奶牛代謝性和感染性疾病(如生產(chǎn)癱瘓、乳房炎、酮病、子宮內(nèi)膜炎、胎衣滯留等疾病)的發(fā)生,使得奶牛在整個分娩過程中免疫力降低,增加奶牛發(fā)病機率[1]。

飼料桑作為一種新型飼料原料,適口性好,桑葉中營養(yǎng)成分豐富而均衡,含有多種維生素、礦物質(zhì)以及多種天然活性物質(zhì),又稱蛋白桑,譽為“天然營養(yǎng)庫”,其活性物質(zhì)主要有黃酮類、多糖類、生物堿、植物甾醇類等,具有降血脂、降血壓、降血糖、抗癌、抗氧化、消炎殺菌等生理功能。賈亞洲等[2]研究發(fā)現(xiàn),在絨山羊飼糧中添加桑葉,不僅可以提高蛋白質(zhì)營養(yǎng)水平,而且改善生長育肥羊的生產(chǎn)性能及肉品質(zhì)。郭建軍等[3]研究表明,在奶牛精料中添加5%的桑葉效果最好,可以提高乳蛋白和干物質(zhì)的含量。宋敏等[4]研究發(fā)現(xiàn),在飼糧中添加桑葉提取物,不僅降低腹瀉率,而且提高斷奶仔豬機體的抗氧化能力及免疫力。李勝利等[5]研究報道,在飼糧中添加飼用桑葉,可以提高乳蛋白率,有效降低牛乳中的體細胞數(shù)。葉添梅等[6]報道,生長豬飼糧中添加發(fā)酵桑葉粉,可以降低血清中葡萄糖、甘油三酯含量,增強機體的抗氧化能力。李莉等[7]在飼糧中添加15%的干桑葉,可以有效增加郟縣紅牛肌間粗脂肪和粗蛋白質(zhì)含量,同時提高總氨基酸和不飽和脂肪酸含量,有助于優(yōu)質(zhì)牛肉生產(chǎn)。然而,飼料桑在圍產(chǎn)期荷斯坦奶牛的應(yīng)用效果鮮見報道。因此,本研究以圍產(chǎn)期荷斯坦奶牛為研究對象,探討飼料桑添加對荷斯坦奶牛生產(chǎn)性能、免疫和抗氧化功能及瘤胃微生物區(qū)系的影響,為飼料桑在圍產(chǎn)期荷斯坦奶牛飼糧中的生產(chǎn)實踐及科學(xué)添加提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2021年12月至2022年1月在鎮(zhèn)江市長江乳業(yè)有限公司示范牧場進行。

1.2 主要試劑

試驗所用飼料桑為發(fā)酵顆粒,購自江蘇省某農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園,含有干物質(zhì)90.05%,干物質(zhì)中粗蛋白質(zhì)含量為22.65%、粗灰分含量為5.99%。

1.3 試驗設(shè)計

試驗選取胎次(2～3胎)、體重[(600±50) kg]和產(chǎn)奶量相近的荷斯坦奶牛18頭,采用單因素隨機分組設(shè)計,分成3組,每組6頭。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧,試驗組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加5%、10%飼料桑的飼糧。試驗期42 d,包括預(yù)試期14 d(產(chǎn)前2周)和正試期28 d(產(chǎn)后4周)。

1.4 飼養(yǎng)管理

在試驗期內(nèi),試驗組和對照組奶牛進行分組飼喂?；A(chǔ)飼糧為全混合日糧(TMR),每日08:00和16:00各投料1次,自由飲水?；A(chǔ)飼糧參照NRC(2001)奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制,飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.5 樣品采集

1.5.1 產(chǎn)奶量與乳成分的測定

在奶牛產(chǎn)后第1、7、14、21、28天,采集奶樣50 mL,按早∶中∶晚=4∶3∶3的比例混合采取,取50 mL加入溴硝丙二醇防腐劑,儲存在4 ℃冰箱中,測定的指標(biāo)包括乳蛋白、乳脂肪含量和體細胞數(shù),樣品送至南京農(nóng)業(yè)大學(xué)(江蘇省奶牛生產(chǎn)性能測定中心),采用Foss乳成分分析儀進行測定。

1.5.2 血樣的采集與測定

于產(chǎn)后第1、7、14、21、28天,晨飼前通過尾靜脈采血,血液樣本采用肝素鈉抗凝劑管收集,每頭牛采集血液10 mL,在4 ℃靜止30 min,靜置后3 000×g離心15 min,分裝至2 mL Eppendorf管中,-80 ℃冰箱保存,待測血漿免疫和抗氧化指標(biāo)。

血漿免疫指標(biāo)的測定:白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)含量均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。

血漿抗氧化指標(biāo)測定:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。

1.5.3 瘤胃液樣品的采集與測定

根據(jù)乳成分、血漿免疫及抗氧化指標(biāo)的分析結(jié)果,選取對照組與10%飼料桑試驗組進行瘤胃液采樣和分析。在試驗期最后1 d晨飼前經(jīng)口腔進行瘤胃液樣品采集,采集100 mL,并現(xiàn)場測定pH變化,瘤胃液經(jīng)4層紗布過濾,其中20 mL轉(zhuǎn)移至凍存管先進行液氮冷凍,然后放置-80 ℃保存,用于瘤胃微生物區(qū)系的測定。樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司進行瘤胃16S rRNA測序處理分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)先采用Excel 2013進行初步整理,再通過GraphPad Prism 9.5.0軟件進行分析,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,使用Omicsmart進行16S rRNA基因組學(xué)數(shù)據(jù)信息分析,以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 添加飼料桑對圍產(chǎn)期奶牛乳成分的影響

根據(jù)圖1-A可以發(fā)現(xiàn),添加飼料桑對奶牛乳蛋白含量的影響沒有顯著差異(P>0.05),但是由圖1-B可知,與對照組相比,添加飼料桑顯著提高了奶牛產(chǎn)后第28天的乳脂率(P<0.05)。如圖1-C所示,與對照組相比,飼糧添加飼料?？山档团Ｈ橹畜w細胞數(shù),其中添加10%的飼料桑可以顯著降低產(chǎn)后第21、28天牛乳中的體細胞數(shù)(P<0.05)。

Con:對照組 control group;Con+M5:5%飼料桑組 5% feed mulberry group;Con+M10:10%飼料桑組 10% feed mulberry group。下圖同 the same as below。與對照組相比,*為差異顯著(P<0.05)。圖2和圖3同。Compared with control group, * mean significant difference (P<0.05). The same as Fig.2 and Fig.3.圖1 添加飼料桑對圍產(chǎn)期奶牛乳成分的影響Fig.1 Effects of forage mulberry addition on milk composition of perinatal dairy cows

2.2 添加飼料桑對圍產(chǎn)期奶牛血漿抗氧化指標(biāo)的影響

由圖2-A可知,與對照組相比,飼糧中添加10%的飼料?？稍诋a(chǎn)后第14、21天顯著提高奶牛血漿中的GSH-Px活性(P<0.05);飼糧添加5%、10%的飼料?？稍谀膛．a(chǎn)后第14天顯著提高血漿中SOD活性(P<0.05)(圖2-B),顯著降低血漿中MDA含量(P<0.05)(圖2-C)。

圖2 添加飼料桑對圍產(chǎn)期奶牛血漿抗氧化指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of forage mulberry addition on plasma antioxidation indexes of perinatal dairy cows

2.3 添加飼料桑對圍產(chǎn)期奶牛血漿免疫指標(biāo)的影響

由圖3-A可知,與對照組相比,飼糧中添加5%飼料?？稍诋a(chǎn)后第14、21天顯著降低奶牛血漿中IL-1β含量(P<0.05);添加10%的飼料桑在產(chǎn)后第14天可以顯著降低血漿中IL-1β含量(P<0.05)。由圖3-B可知,與對照組相比,飼糧中添加10%的飼料?？稍谀膛．a(chǎn)后第21天顯著降低血漿中IL-6含量(P<0.05)。飼糧中添加5%的飼料桑在產(chǎn)后第14天顯著降低了血漿中TNF-α含量(P<0.05)(圖3-C)。

圖3 添加飼料桑對圍產(chǎn)期奶牛血漿免疫指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of forage mulberry addition on plasma immune indexes of perinatal dairy cows

2.4 添加飼料桑對圍產(chǎn)期瘤胃微生物區(qū)系的影響

通過對16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域進行測序,由表2可以看出,測序覆蓋度達到0.99,說明樣品測定合理。本研究中2組共鑒別出1 400個操作分類單元(OTU),其中,875個OTU是2個組共有,占OTU總數(shù)的62.50%(圖4)。由表2可知,10%飼料桑組Sobs指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)有高于對照組的趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。另外,由圖5-A可知,本研究中主要檢測到10個差異瘤胃菌門,其中厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)是瘤胃中主要的優(yōu)勢菌門,并且對照組和10%飼料桑組的結(jié)果中優(yōu)勢菌門占總門類的85%以上。在門水平上,與對照組相比,10%飼料桑組擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度有增加趨勢,變形菌門相對豐度有下降趨勢。由圖5-B可知,在屬水平上,2組中優(yōu)勢菌屬均為普雷沃菌屬-1(Prevotella_1)、琥珀酸弧菌科UCG-001(Succinivibrionaceae_UCG-001)、普雷沃菌屬-7(Prevotella_7),對上述優(yōu)勢菌屬的相對豐度進行組間差異性分析,2組差異均不顯著(P>0.05)。通過LEfSe多級物種差異判別分析方法,共鑒別出12個物種為標(biāo)志物,其中11個位于對照組,1個位于10%飼料桑組(圖6)。

圖4 OTU分布韋恩圖Fig.4 Venn graph of OTU distribution

Bacteroidetes:擬桿菌門;Firmicutes:厚壁菌門;Proteobacteria:變形菌門;Spirochaetes:螺旋體門;Patescibacteria:骸骨細菌門;Fibrobacteres:纖維桿菌門;Kiritimatiellaeota:圣誕島菌門;Cyanobacteria:藍藻門;Tenericutes:軟壁菌門;Planctomycetes:浮霉菌門;Unclassified:未分類;Other:其他;Prevotella_1:普雷沃氏菌屬_1;Succinivibrionaceae_UCG-001:琥珀酸弧菌科_UCG-001;Prevotella_7:普雷沃氏菌屬_7;Succiniclasticum:解琥珀酸菌屬;Treponema_2:密螺旋體屬_2;Succinivibrionaceae UCG-002:琥珀酸菌科_UCG-002;Fibrobacter:纖維桿菌屬;Ruminococcus_1:瘤胃球菌屬_1; Ruminococcaceae_UCG-014:瘤胃球菌科_UGG-014;Rikenellaceae RC9_gut_group:理研菌科_RC9腸道群。圖5 瘤胃微生物門和屬水平的群落分布Fig.5 Rumen microbial community distribution at phylum and genus levels

Favabacteriales:蠶豆屬;Lactobacillus:乳桿菌屬;Lactobacillaceae:乳酸桿菌科;Weissella:魏氏菌屬;Lactobacillales:乳酸桿菌;Bacilli:桿菌綱;Bacteroidetes_bacterium_ADurbBinA104:擬桿菌門_細菌_ ADurbBinA104;Ruminococcus_sp_FC2D18:瘤胃球菌屬_FC2D18;Selenomonas_ruminantium_subsp_lactilytica_TAM6421:月形單胞菌屬_反芻動物_亞種_乳酸桿菌_TAM6421;Rhodocyclaceae:玫瑰茄科;Pseudomonadaceae:假單胞菌科;Treponema_saccharophilum_DSM_2985:密螺旋體_嗜糖菌_DSM_2985。圖6 多級別物種差異判別分析結(jié)果Fig.6 Results of multi-level species difference discriminant analysis

表2 瘤胃液菌群α-多樣性指數(shù)Table 2 Rumen microflora alpha-diversity indexes

3 討 論

3.1 添加飼料桑對圍產(chǎn)期奶牛乳成分和體細胞數(shù)的影響

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展,奶牛場養(yǎng)殖水平不斷提高,牛奶質(zhì)量的檢測指標(biāo)主要包括乳蛋白、乳脂率和體細胞數(shù)[8],這些指標(biāo)受環(huán)境、飼糧等因素的調(diào)控[9]。添加桑葉粉飼喂奶牛,不僅可以在一定程度上降低牛乳中體細胞數(shù),同時有效提高乳蛋白率[3],采用青貯桑樹枝飼喂奶?？梢燥@著提高乳脂含量[10]。與上述研究結(jié)果一致,本研究表明,飼糧中添加10%飼料?？娠@著提高奶牛乳脂率,推測與飼料桑中主要活性成分有關(guān)。有關(guān)研究表明,桑葉黃酮可以提高奶牛乳腺上皮細胞的抗氧化性能,調(diào)節(jié)瘤胃菌群,影響瘤胃發(fā)酵[11-12],從而影響乙酸和β-羥丁酸為底物的脂肪酸的從頭合成。另外,研究表明,在奶牛飼糧中添加棕櫚酸對乳脂率的合成起到一定促進作用[13]。此外,在本研究中,飼糧中添加10%飼料桑也可以顯著降低乳中體細胞數(shù)。體細胞數(shù)能夠衡量乳腺內(nèi)部感染程度,是保證奶牛健康和改善其生產(chǎn)性能的主要指標(biāo)[14-15]。飼料桑的抗炎效果同樣與其活性成分有關(guān),如黃酮類化合物具有抑菌抗炎的作用,其有效基團硫代葡萄糖苷可以有效去除自由基,進而降低自由基對乳腺上皮細胞的損害,增強奶牛免疫力來減少牛乳中體細胞數(shù)[16-18]。綜上所述,飼糧中添加飼料桑,可以有效降低牛乳中體細胞數(shù),升高乳脂率,進而降低圍產(chǎn)期奶牛乳腺炎癥的發(fā)生,提高奶牛產(chǎn)奶性能。

3.2 添加飼料桑對圍產(chǎn)期奶牛血漿抗氧化指標(biāo)的影響

研究表明,圍產(chǎn)期奶牛機體在經(jīng)歷妊娠、產(chǎn)犢和泌乳引起的生理負(fù)荷時,進行合理的飼養(yǎng)管理及環(huán)境調(diào)控,將降低奶牛能量負(fù)平衡被打破的風(fēng)險,不易引起氧化應(yīng)激的發(fā)生[19]。正常情況下,動物機體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)是動態(tài)平衡狀態(tài),當(dāng)機體被多種應(yīng)激原刺激時,產(chǎn)生自由基不能及時清除,將會導(dǎo)致機體內(nèi)抗氧化酶合成能力下降,同時內(nèi)源性抗氧化水平降低,微妙的平衡被破壞,易導(dǎo)致機體的氧化損傷[20-21]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,通常用作生物標(biāo)志物,其含量可以間接反映自由基的水平和指示氧化應(yīng)激的程度[22]。研究表明,機體初級抗氧化系統(tǒng)由GSH-Px、SOD、CAT等組成[23]。據(jù)報道,桑葉可以通過提高血清中SOD、CAT和GSH-Px活性,降低血清中MDA含量,進而改善羔羊的抗氧化能力[24]。在本研究中,奶牛飼糧中添加飼料桑提高了血漿抗氧化指標(biāo)GSH-Px和SOD活性,表明細胞外酶系統(tǒng)的抗氧化能力增強。該結(jié)果與桑葚青貯飼料作為功能性飼料在育肥后期的韓牛中研究結(jié)果[25]一致。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn),苜蓿黃酮可以通過增加抗氧化酶的活性來提高抗氧化能力,并緩解氧化應(yīng)激,同時降低MDA的含量[26]。這種效果主要歸因于飼料桑中的活性物質(zhì),例如黃酮類物質(zhì),其可以作為還原劑和供氫體,中和氧自由基,發(fā)揮抗氧化作用[27-28]。最近有關(guān)研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加桑葉黃酮不僅可以顯著提高血清抗氧化酶的活性,還能同時降低水牛血清中MDA含量,從而有效緩解高溫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[29]。萬榮等[30]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加發(fā)酵桑葉可以降低荷斯坦?fàn)倥Ｑ錗DA含量,調(diào)節(jié)抗氧化功能,從而促進動物健康。與上述研究結(jié)果大致相同,王嘉琦[31]研究發(fā)現(xiàn),青貯桑枝葉替代部分飼糧,可以提高奶牛抗氧化能力,改善泌乳性能。綜上所述,在飼糧中添加飼料桑可以提高奶牛血漿的抗氧化酶活性,降低圍產(chǎn)期奶牛機體的氧化應(yīng)激水平。

3.3 添加飼料桑對圍產(chǎn)期奶牛血漿免疫指標(biāo)的影響

圍產(chǎn)期是奶牛生理情況的特殊時期,機體生理和環(huán)境的改變都會使得機體免疫力下降[32]。細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞經(jīng)過刺激產(chǎn)生的具有多功能的蛋白質(zhì)分子,TNF-α、IL-6和IL-1β是巨噬細胞產(chǎn)生的主要促炎因子,在免疫防御和炎癥過程中發(fā)揮著重要的作用[33-35]。王祖文等[36]報道,灌胃桑葉生物堿,可以在一定程度上降低肝纖維化小鼠機體血清中IL-6、TNF-α等炎性因子含量。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn),添加桑葉青貯飼喂羔羊可以降低血清中IL-6和IL-1β的含量,表明飼料桑能夠調(diào)節(jié)反芻動物免疫功能。崔藝燕等[37]研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵桑葉飼喂商品育肥豬,可以改善血漿細胞因子[TNF-α、IL-6、白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-22(IL-22)、干擾素-γ(INF-γ)]含量,提高育肥豬的免疫功能。與上述研究結(jié)果一致,本研究同樣發(fā)現(xiàn),飼糧中添加飼料桑顯著降低血漿中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量,可以預(yù)防疾病對機體免疫反應(yīng)過程中的應(yīng)激反應(yīng),調(diào)節(jié)機體的免疫活性。以上結(jié)果說明,飼料桑可在一定程度上改善圍產(chǎn)期奶牛機體的免疫功能,有利于改善動物機體的健康,但其對奶牛免疫調(diào)節(jié)具體作用機制尚未明確,還有待進一步研究。

3.4 添加飼料桑對圍產(chǎn)期奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

本試驗對瘤胃液進行16S rRNA測序發(fā)現(xiàn),10%飼料桑組共有1 143個OTU,飼料桑組獨有268個OTU。與對照相比,10%飼料桑組瘤胃菌群α-多樣性指數(shù)沒有顯著差異,表明飼料桑對瘤胃微生物區(qū)系豐度沒有顯著影響。本試驗中,奶牛瘤胃中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門和變形桿菌門,與之前的研究結(jié)果[38-39]一致。10%飼料桑組厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度有所提高,分別與結(jié)構(gòu)性碳水化合物和非纖維性碳水化合物降解有關(guān)[40],表明飼喂飼料桑可能會通過調(diào)控微生物結(jié)構(gòu)來改善動物健康,提高其生產(chǎn)性能。原因可能是本試驗所用的試驗?zāi)膛Ｆ贩N、飼糧和基礎(chǔ)飼糧的粗精比較接近,可能導(dǎo)致在瘤胃結(jié)構(gòu)上未形成較大影響。本研究在屬水平上發(fā)現(xiàn),普雷沃菌屬-1、琥珀酸弧菌科UCG-001為泌乳奶牛瘤胃優(yōu)勢菌群,這與Bowen等[41]、逄賓賓等[42]和Petri等[43]的研究結(jié)果一致,普雷沃氏菌屬于擬桿菌門,在瘤胃中分布廣泛,數(shù)量多,可以消化利用淀粉,并且降解植物性半纖維素、蛋白質(zhì)、非纖維多糖,還可以參與多種微生物代謝[44]。琥珀弧菌屬與瘤胃內(nèi)琥珀酸的產(chǎn)生有關(guān)[45],主要代謝終產(chǎn)物是琥珀酸、乙酸及乳酸,琥珀弧菌可以把琥珀酸轉(zhuǎn)化為丙酸,進而增加丙酸含量,從而提高乳糖含量和產(chǎn)奶量[46]。同時,Li等[10]研究發(fā)現(xiàn),桑樹枝和桑葉青貯飼料可以改善瘤胃菌群,增加纖維消化、丙酸合成及乳脂相關(guān)微生物的豐度,提高奶牛的產(chǎn)奶量。本試驗添加飼料桑后,奶牛瘤胃液中普雷沃氏菌屬相對豐度增加,說明添加飼料?？赡茉谝欢ǔ潭壬洗龠M奶牛瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)的分解利用,還可能參與瘤胃內(nèi)總揮發(fā)性脂肪酸的代謝[47]。綜上可知,添加飼料?？梢栽谝欢ǔ潭壬细纳屏鑫肝⑸锵鄬ωS度,進而促進瘤胃發(fā)酵,提高奶牛機體免疫性能和產(chǎn)奶量。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下,飼糧中添加適宜比例飼料桑對圍產(chǎn)期荷斯坦奶牛瘤胃微生物區(qū)系無明顯不良影響,且能夠在一定程度上提高圍產(chǎn)期奶牛機體的抗氧化水平和免疫功能,并可以顯著提高乳脂率和降低牛乳中的體細胞數(shù),進而提高乳品質(zhì)。本研究結(jié)果可為飼料桑在奶牛生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用提供一定參考價值,但飼料桑用作圍產(chǎn)期奶牛飼料原料的適宜添加水平仍需進一步研究。