章 娜 楊凱麗 張 沙 郝雋毅 鄧圣庭 楊偉光 劉石鵬 孫杰龍 方熱軍*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長沙 410128;2.智慧牧業(yè)湖南省工程研究中心,長沙 410128;3.陜西省渭南市動物疫病預(yù)防控制中心,渭南 714000;4.湖南省鵬暉農(nóng)牧有限公司,安化 413500;5.益陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,益陽 413000)

家禽產(chǎn)蛋過程中,卵黃前體物質(zhì)主要包括極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)和卵黃蛋白原(vitellogenin,VTG),其直接影響蛋禽的卵泡發(fā)育和產(chǎn)蛋性能。在雞的排卵期,卵巢本身不產(chǎn)生內(nèi)源性卵黃前體,由肝臟組裝并合成的VLDL和VTG經(jīng)血液循環(huán)至卵巢后,通過卵泡膜上的極低密度脂蛋白受體介導(dǎo)的胞吞作用被卵母細(xì)胞吸收利用,為卵泡發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]。高產(chǎn)母雞在400日齡后通常會出現(xiàn)卵巢老化、產(chǎn)蛋量下降和蛋品質(zhì)變差等問題[3]。蛋雞在衰老過程中,雌激素作用和肝臟抗氧化機(jī)能逐漸衰退,肝臟分泌卵黃前體物質(zhì)能力下降,導(dǎo)致產(chǎn)蛋性能下降[4]。近年研究發(fā)現(xiàn),天然抗氧化物或植物提取物(如甜菜堿、山楂葉黃酮等)可緩解蛋雞肝臟或卵巢氧化損傷,促進(jìn)卵黃前體物質(zhì)合成及相關(guān)基因的表達(dá),從而提高蛋雞的產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)[5-7]。

植物甾醇(phytosterol,PS)又稱植物固醇,是以環(huán)戊烷全氫菲為骨架的一類抗氧化劑,具有抗氧化、類雌激素和促生長作用,可有效調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡[8]。植物甾醇酯(phytosterol ester,PSE)由PS酯化而成,與PS相比,PSE更容易被動物腸道吸收[9]。本團(tuán)隊前期研究結(jié)果表明,飼糧中添加150～300 mg/kg PSE能夠提高110日齡蛋鵪鶉的產(chǎn)蛋率,顯著提高血清中總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性,降低蛋黃中膽固醇含量[10]。PSE可否通過提高蛋雞抗氧化應(yīng)激能力,促進(jìn)肝臟卵黃前體物質(zhì)的生成,從而達(dá)到提高產(chǎn)蛋性能、改善蛋品質(zhì)目的,其基于“肝臟-血液-卵巢信號軸”的產(chǎn)蛋機(jī)制尚未見報道。因此,本研究擬以產(chǎn)蛋末期(113周齡)蛋雞為研究對象,從抗氧化的角度探究PSE對其產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)的影響,并從卵黃前體物質(zhì)VLDL、VTG合成的影響途徑詮釋其作用機(jī)制,以期為延長蛋雞的產(chǎn)蛋周期、實現(xiàn)蛋雞的“延養(yǎng)”、提高蛋雞養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益提供技術(shù)方案。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

采用單因素試驗設(shè)計,選用180只113周齡產(chǎn)蛋率[(77.22±2.50)%]相近的健康京粉六號蛋雞,隨機(jī)分為3個組,分別為CON組(飼喂基礎(chǔ)飼糧,對照組)、100 PSE組(飼喂基礎(chǔ)飼糧+100 mg/kg PSE)、200 PSE組(飼喂基礎(chǔ)飼糧+200 mg/kg PSE),每組6個重復(fù),每個重復(fù)10只雞。預(yù)試期為7 d,正試期為56 d。試驗結(jié)束后,每個重復(fù)取2只雞屠宰。試驗所用PSE產(chǎn)品由湖南某生物科技有限公司提供,PSE有效含量為15%。基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1994)、中國《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T33—2004)和《中國飼料成分及營養(yǎng)價值成分表(2020年第31版)》配制,其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在湖南省益陽市鵬暉農(nóng)牧有限公司進(jìn)行,預(yù)試期觀察蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)、采食量及死淘情況,及時調(diào)整。雞舍為全封閉式,夏季采用濕簾和風(fēng)機(jī)降溫,環(huán)境溫度控制在18～25 ℃。蛋雞飼養(yǎng)均采用層疊式籠養(yǎng)模式,密度為5只/籠,2籠/重復(fù)。試驗期間,每日飼喂粉料2次,使用乳頭式飲水器自由飲水,按正常免疫程序進(jìn)行免疫接種。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 產(chǎn)蛋性能測定

以重復(fù)為單位每天記錄產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重、破/軟殼蛋數(shù)和死亡淘汰雞數(shù)目,按周統(tǒng)計各重復(fù)蛋雞試驗期間的耗料量,計算平均日采食量、產(chǎn)蛋率、平均蛋重、料蛋比、死淘率和破軟殼率。

平均日采食量[g/(只·d)]=飼料消耗
總量/(存欄雞只數(shù)×試驗天數(shù));
產(chǎn)蛋率(%)=(產(chǎn)蛋數(shù)/存欄雞只數(shù))×100;
平均蛋重(g)=產(chǎn)蛋總重量/總產(chǎn)蛋數(shù);
料蛋比=飼料消耗總量/產(chǎn)蛋總重量;
死淘率(%)=(死淘數(shù)/總存欄數(shù))×100;
破/軟殼率(%)=(破/軟殼蛋數(shù)/產(chǎn)蛋數(shù))×100。

1.3.2 蛋品質(zhì)測定

正試期每天10:00撿蛋,在試驗第28天和第56天從每個重復(fù)挑選接近該重復(fù)平均重(不包括畸形、粗糙或破裂蛋)的合格雞蛋4枚,每組共24枚。使用游標(biāo)卡尺測量雞蛋的縱徑和橫徑,計算蛋形指數(shù)(蛋形指數(shù)=縱徑/橫徑);使用蛋品質(zhì)自動分析儀(EA-01型,以色列)測定蛋黃顏色、蛋黃直徑、蛋白高度、蛋重和哈氏單位,電子天平稱量蛋殼重量,計算蛋殼表面積(蛋殼表面積=4.68×蛋重2/3)。

1.3.3 血清生殖激素指標(biāo)測定

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(由上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn))測定血清中雌二醇(estradiol,E2)、催乳素(prolactin,PRL)、促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)、促黃體素(luteinizing hormone,LH)、孕酮(progesterone,Prog)水平,具體操作方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4 血清和肝臟抗氧化指標(biāo)測定

采用試劑盒(由南京建成生物工程研究所生產(chǎn))測定血清和肝臟中總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)和T-SOD、GSH-Px、CAT活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 血清和肝臟中VLDL、VTG含量測定

使用ELISA試劑盒(由上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn))對血清和肝臟中VLDL和VTG含量進(jìn)行測定,操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6 肝臟中抗氧化及卵黃前體物質(zhì)合成相關(guān)基因檢測

準(zhǔn)確稱取1 g肝臟組織樣品置于裝有液氮的研缽中充分研磨。按照Trizol試劑說明書對肝臟總RNA進(jìn)行提取,使用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計測定其濃度和純度后,用EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(由湖南艾科瑞生物科技有限公司提供)合成cDNA,-20 ℃保存待測。利用Premier生物軟件設(shè)計引物,引物序列由上海生工生物有限公司合成,詳見表2。配制體積為10 μL的反應(yīng)體系,于ABI-7900HT實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,美國)上按照說明書進(jìn)行一步實時熒光定量PCR。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計算樣品中目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

表2 實時熒光定量PCR引物Table 2 Primers for real time quantitative PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),若有顯著效應(yīng),則采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,分析結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。用GraphPad Prism 8軟件作圖。P<0.01為差異極顯著,P<0.05為差異顯著,0.05≤P<0.10表示差異有顯著趨勢,P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞產(chǎn)蛋性能的影響

由表3可知,與CON組相比,100 PSE組和200 PSE組前期(1～4周)產(chǎn)蛋率分別提高6.12%和9.01%,差異顯著(P<0.05);后期(5～8周)產(chǎn)蛋率均有所提高,但差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05);全期(1～8周)產(chǎn)蛋率分別提高6.37%和8.62%,差異顯著(P<0.05)。100 PSE組前期和全期平均蛋重均顯著高于CON組(P<0.05),其后期料蛋比顯著低于CON組和200 PSE組(P<0.05)。200 PSE組后期平均日采食量較CON組提高3.56%,差異極顯著(P<0.01)。各組間前期、后期以及全期死淘率、破/軟殼率均無顯著差異(P>0.05)。

表3 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞產(chǎn)蛋性能的影響Table 3 Effects of PSE on laying performance of laying hens during late laying period

2.2 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

由表4可知,與CON組相比,100 PSE組第28天的蛋殼重量和第56天的蛋黃顏色均極顯著提高(P<0.01);200 PSE組第28天和第56天的蛋黃顏色分別提高16.48%(P<0.01)和17.26%(P<0.01),蛋殼重量分別提高6.57%(P<0.01)和10.85%(P<0.05)。100 PSE組和200 PSE組第56天的蛋重和蛋殼表面積均顯著高于CON組(P<0.05)。其他蛋品質(zhì)指標(biāo)各組間均無顯著差異(P>0.05)。

表4 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞蛋品質(zhì)的影響Table 4 Effects of PSE on egg quality of laying hens during late laying period

2.3 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞血清生殖激素指標(biāo)的影響

由表5可知,與CON組相比,100 PSE組和200 PSE組血清中E2水平分別提高10.29%和14.77%,Prog水平提高10.15%和23.91%,差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。各組間血清中FSH和LH水平均存在極顯著差異(P<0.01),其中200 PSE組FSH和LH含量較CON組分別提高38.46%和42.06%。

表5 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞血清生殖激素指標(biāo)的影響Table 5 Effects of PSE on serum reproductive hormone indices of laying hens during late laying period

2.4 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表6可知,與CON組相比,100 PSE組和200 PSE組蛋雞血清中T-SOD活性分別提高13.67%(P>0.05)和50.11%(P<0.05)。與CON組相比,100 PSE組和200 PSE組蛋雞肝臟中MDA含量均存在下降趨勢(P=0.078);200 PSE組蛋雞肝臟中CAT活性呈上升趨勢(P=0.067)。其他血清和肝臟抗氧化指標(biāo)各組間均無顯著差異(P>0.05)。

表6 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 6 Effects of PSE on serum and liver antioxidant indices of laying hens during late laying period

2.5 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖1可知,與CON組相比,200 PSE組肝臟中Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1,Keap1)mRNA相對表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05);200PSE組肝臟中核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、醌氧化還原酶-l(quinineoxidoreductase-1,NQO-1)mRNA相對表達(dá)量較CON組均有所提高,但差異不顯著(P>0.05)。

2.6 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞血清和肝臟卵黃前體物質(zhì)VLDL、VTG含量的影響

由表7可知,與CON組相比,100 PSE組和200 PSE組血清中VLDL含量分別提高4.51%和2.02%,但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);200 PSE組血清中VTG含量提高25.03%,差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。與CON組相比,100 PSE組和200 PSE組肝臟中VLDL含量分別提高28.42%和37.66%,差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01),肝臟中VTG含量分別提高21.64%和32.43%,差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

表7 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞血清和肝臟卵黃前體物VLDL、VTG含量的影響Table 7 Effects of PSE on yolk precursors VLDL and VTG contents in serum and liver of laying hens during late laying period

2.7 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞肝臟卵黃前體物質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖2可知,與CON組相比,100PSE組和200 PSE組肝臟中卵黃蛋白原Ⅱ(vitellogenin Ⅱ,VTGⅡ) mRNA相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05);200 PSE組肝臟中雌激素受體-α(estrogen receptor-α,ER-α)mRNA相對表達(dá)量極顯著高于CON組和100 PSE組(P<0.01),同時極低密度載脂蛋白Ⅱ(very low-density apoli-poprotein Ⅱ,ApoVLDLⅡ)mRNA相對表達(dá)量顯著高于CON組(P<0.05);100 PSE組和200 PSE組肝臟中載脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)mRNA相對表達(dá)量均較CON組有所提高,但差異不顯著(P>0.05)。肝臟中雌激素受體-β(estrogen receptor-β,ER-β)mRNA相對表達(dá)量各組間均無顯著差異(P>0.05)。

圖2 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞肝臟卵黃前體物質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of PSE on expression of genes related to yolk precursor synthesis in liver of laying hens during late laying period

3 討 論

3.1 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)的影響

產(chǎn)蛋性能是衡量蛋禽產(chǎn)蛋狀況和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo)。處于產(chǎn)蛋后期的蛋雞產(chǎn)蛋性能下降,表現(xiàn)為產(chǎn)蛋率降低、料蛋比和日耗料量增加[11]。PS在水中與脂質(zhì)結(jié)合成植物激素-植物甾醇-核糖核蛋白復(fù)合體后,增加了其在動物體內(nèi)分解的穩(wěn)定性,從而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成,調(diào)節(jié)動物健康和生長[8]。PS有提高畜禽生產(chǎn)性能的趨勢,PSE相較PS具有更強(qiáng)的脂溶性且更易被腸道吸收利用,兩者生理功能相同。王龍昌等[12]在520日齡產(chǎn)蛋后期蛋雞飼糧中分別添加5、10、20和40 mg/kg PS,發(fā)現(xiàn)飼喂5 mg/kg PS的蛋雞全期產(chǎn)蛋率和平均蛋重分別提高1.05%和3.13%,且試驗組死淘率均降低。本團(tuán)隊前期研究結(jié)果顯示,110日齡日本蛋鵪鶉飼糧中PSE添加量為150和300 mg/kg時,其產(chǎn)蛋率相較對照組分別顯著提高2.68%和4.31%[10]。本試驗表明,飼糧中適量添加PSE可提高蛋雞全期產(chǎn)蛋率和平均蛋重,降低后期料蛋比,改善產(chǎn)蛋末期蛋雞產(chǎn)蛋性能受損狀況。

商品蛋雞從產(chǎn)蛋高峰期至產(chǎn)蛋后期,其生理代謝活動隨周齡發(fā)生變化,導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋性能降低,蛋品質(zhì)下降[13]。雞蛋重量隨蛋雞年齡的增長而增加,但蛋殼重量不增加,這種不成比例的變化可能導(dǎo)致蛋殼質(zhì)量下降[14]。蛋黃顏色評分與蛋黃中類胡蘿卜素含量呈線性相關(guān)[15],含類胡蘿卜素的乳糜微粒經(jīng)腸道吸收后轉(zhuǎn)運至肝臟,在肝臟中與VLDL結(jié)合并向外周組織輸送[16]。Xiao等[14]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過5周PS(20和40 mg/kg)處理后,老齡蛋雞的雞蛋外觀質(zhì)量(蛋重、蛋殼表面積)和內(nèi)部品質(zhì)(蛋白高度、哈氏單位和蛋黃顏色)均呈線性提高;在試驗第7周,PS線性提高蛋重和蛋殼重量。常玲玲等[17]在海蘭褐蛋雞基礎(chǔ)飼糧中分別添加20、80、400、800 mg/kg PS后,發(fā)現(xiàn)PS對蛋形指數(shù)、蛋白高度和哈氏單位等蛋品質(zhì)指標(biāo)均無顯著影響。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相似,與CON組相比,飼糧添加PSE顯著提高產(chǎn)蛋末期蛋雞蛋重、蛋殼重量和蛋殼表面積,改善雞蛋的外觀質(zhì)量。此外,PSE一定程度上改善了蛋黃顏色,可能是因為PSE增加禽類肝臟中VLDL的含量,從而促進(jìn)類胡蘿卜素在蛋黃中的沉積。

3.2 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞血清生殖激素指標(biāo)的影響

下丘腦-垂體-性腺軸控制蛋雞的生殖系統(tǒng),直接調(diào)控卵泡發(fā)育、成熟和排卵,最終調(diào)節(jié)產(chǎn)蛋量[18],其中促性腺激素(如FSH、LH)對調(diào)節(jié)卵巢發(fā)育、類固醇激素(如E2、Prog)的產(chǎn)生和配子發(fā)生至關(guān)重要。FSH能刺激卵泡發(fā)育成熟,LH可誘導(dǎo)排卵前卵泡的生長發(fā)育并觸發(fā)排卵,促進(jìn)黃體形成并分泌Prog,兩者協(xié)同作用下刺激卵泡成熟、排卵并提高E2的分泌量[12]。因此,血清生殖激素水平可作為指示產(chǎn)蛋性能的指標(biāo)。老齡蛋雞產(chǎn)蛋量的下降與FSH和LH分泌減少有關(guān)[19]。PS可作為類固醇激素從頭生物合成的前體,在體內(nèi)能表現(xiàn)出一定的激素活性,例如,谷甾醇和豆甾醇可能是植物中Prog的甾醇前體[8,20]。研究表明,PS對雌鼬血漿中E2和LH水平有不同程度的提高作用[21];成熟雌性湖鱒接觸10或20 μg/L的PS后,其血漿中E2水平增加并刺激肝臟中VTG的產(chǎn)生,說明雌性排卵期延長[22]。王龍昌等[12]飼喂520日齡蛋雞5或40 mg/kg PS后,其血清中E2水平顯著提高,FSH水平未發(fā)生顯著變化,與本試驗結(jié)果存在差異,可能是不同種屬和不同時期的動物在應(yīng)答時存在不同的機(jī)制和結(jié)果。在本研究中,飼糧添加PSE顯著提高老齡蛋雞血清中FSH、LH、E2和Prog水平,從而增加卵泡數(shù)量、刺激卵泡生長成熟,這可由2個添加PSE組產(chǎn)蛋率提高得到證實。

3.3 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞肝臟抗氧化能力的影響

蛋雞在衰老過程中,機(jī)體內(nèi)活性氧(ROS)不斷積聚,內(nèi)源性抗氧化劑不足以中和過量的自由基和過氧化物,ROS生成和清除的平衡被打破、抗氧化防御系統(tǒng)失衡,產(chǎn)生氧化應(yīng)激,致使卵泡衰竭、繁殖性能下降,從而導(dǎo)致老齡蛋雞產(chǎn)蛋量降低[3]。在抗氧化防御系統(tǒng)中,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)可作為解毒超氧陰離子自由基的第一線,將氧自由基還原為過氧化氫(H2O2),再經(jīng)CAT將H2O2轉(zhuǎn)化為水(H2O)和氧氣(O2),此過程中GSH-Px可與SOD協(xié)同作用,將其轉(zhuǎn)化為無毒的羥基化合物,防止氧自由基堆積并清除脂質(zhì)過氧化物終產(chǎn)物MDA的形成[13,23]。PS作為溫和的自由基清除劑,其結(jié)構(gòu)中的C-24位叔碳具有較強(qiáng)的抗氧化能力,可與ROS反應(yīng)生成穩(wěn)定的叔自由基,從而阻斷脂肪酸鏈的氧化[8]。田丹丹等[24]研究證實,PS對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子均有較強(qiáng)的清除和抑制作用,且清除率與其濃度呈正相關(guān)性。

黃志毅等[25]在清遠(yuǎn)麻雞飼糧中分別添加100、200和300 g/t PS,提高了血清中SOD和GSH-Px活性并降低了MDA含量,增強(qiáng)了麻雞的抗氧化能力。李志華等[26]發(fā)現(xiàn),在羅非魚飼料中添加20或40 mg/kg的PS后,肝臟中SOD和CAT活性均較對照組有所提高,但當(dāng)添加量為160 mg/kg時兩者活性較對照組有所降低。由此可推斷出,PS與抗氧化酶活性存在劑量關(guān)系,適宜的添加量對抗氧化能力存在積極作用。卿一青[10]報道,飼糧中添加150～300 mg/kg PSE可顯著提高蛋鵪鶉血清中抗氧化酶(T-SOD和CAT)活性,增強(qiáng)肝臟中GSH-Px活性。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相似,飼糧添加PSE后蛋雞血清中T-SOD和肝臟中CAT活性升高,肝臟中MDA含量下降,且200 mg/kg的效果優(yōu)于100 mg/kg。

機(jī)體正常情況下,特異性受體Keap1可通過泛素-蛋白酶體途徑與抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Nrf2結(jié)合,抑制其功能[27]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致Keap1的構(gòu)象發(fā)生改變,Nrf2解離并釋放,活化的Nrf2可反式定位到細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)結(jié)合,啟動下游抗氧化酶基因[包括谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)、NQO-1、HO-1等]的表達(dá),從而緩解H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷[3,27]。Gao等[28]研究表明,蛋雞飼糧中添加染料木黃酮(20和40 mg/kg)能夠激活卵巢中ER-α的表達(dá),調(diào)節(jié)ER-α/Nrf2-Keap1抗氧化信號通路,協(xié)同提高抗氧化酶(CAT、T-SOD和GSH-Px)的活性,抑制MDA的過度積累,從而提高卵巢的抗氧化能力;Yu等[29]報道了Nrf2/HO-1通路的調(diào)控對于保護(hù)胎盤免受氧化應(yīng)激至關(guān)重要。此外,研究發(fā)現(xiàn)金針菇莖具有抗氧化性,可通過調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá),增加血清、肝臟和卵巢中抗氧化酶(GSH-Px和T-SOD)活性,降低MDA含量[30]。在本研究中,與CON組相比,200 PSE組肝臟中Keap1 mRNA相對表達(dá)量顯著下調(diào),其Nrf2、HO-1和NQO-1 mRNA相對表達(dá)量較CON組均有所提高。因此,PSE能夠下調(diào)Keap1 mRNA的表達(dá),促進(jìn)Nrf2的活化和釋放,進(jìn)一步啟動ARE調(diào)控的下游抗氧化酶基因的表達(dá)。相應(yīng)地,本試驗發(fā)現(xiàn),飼糧中添加200 mg/kg PSE后顯著提高血清中T-SOD活性,同時增強(qiáng)肝臟中CAT活性并降低MDA含量。本試驗所得部分試驗結(jié)果與前人研究結(jié)果存在出入,結(jié)果的差異可能是由于動物品種、飼養(yǎng)階段、PSE吸收效率和添加量不同等造成的。例如,年齡增長可引起機(jī)體ROS和蛋白質(zhì)羰基水平增加,從而導(dǎo)致抗氧化劑的需求量更高[31]。綜合上述指標(biāo),推測PSE可通過激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路提高肝臟抗氧化能力,從而減輕產(chǎn)蛋末期蛋雞肝臟氧化損傷。

3.4 PSE對產(chǎn)蛋末期蛋雞卵黃前體物質(zhì)合成的影響

肝臟作為氧化應(yīng)激的靶向和效應(yīng)器官,其氧化還原狀態(tài)與卵黃前體物質(zhì)的合成密切相關(guān)。蛋雞在衰老過程中易發(fā)生氧化應(yīng)激,導(dǎo)致肝臟生理功能衰退和抗氧化能力減弱、卵黃前體物合成受阻,進(jìn)而影響產(chǎn)蛋性能[5]。VLDL和VTG是運輸和沉積額外營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入卵巢,滿足卵母細(xì)胞生長需要的關(guān)鍵卵黃前體物質(zhì)[32]。產(chǎn)蛋雞體內(nèi)的VLDL分為普通型VLDL和小顆粒VLDL(VLDLy),產(chǎn)蛋開始后E2將幾乎所有的普通型VLDL產(chǎn)生的肝細(xì)胞脂蛋白轉(zhuǎn)化為VLDLy(卵巢靶向),VLDLy是唯一能成功到達(dá)發(fā)育中的卵母細(xì)胞沉積成卵黃的物質(zhì)[32-33]。VLDLy運輸需2種載脂蛋白,即載脂蛋白B(ApoB)和ApoVLDLⅡ。氧化應(yīng)激會使肝臟發(fā)生脂質(zhì)過氧化和脂肪變性,導(dǎo)致ApoB降解及錯誤折疊,VLDLy合成受阻[34-35]。VTG是一種磷脂糖蛋白,既可作為非極性分子或酶的載體結(jié)合金屬離子(如鈣、鋅和鐵)并運輸至卵母細(xì)胞,又負(fù)責(zé)供應(yīng)胚胎氨基酸、葡萄糖、脂肪和磷等營養(yǎng)性物質(zhì)[2,36]。此外,ApoVLDLⅡ和VTG的表達(dá)量均與蛋雞的產(chǎn)蛋量有關(guān)[37]。

血清VLDL含量能夠反映蛋雞的產(chǎn)蛋能力,VLDL含量低時其產(chǎn)蛋率也相應(yīng)降低[38]。Gao等[39]在50周齡蛋雞飼糧中添加天然蝦青素(ASTA),發(fā)現(xiàn)可顯著提高肝臟和卵巢中T-AOC、T-SOD和GSH-Px活性,降低MDA含量,且隨著ASTA添加量(50～100 mg/kg)的增加,血漿中VLDL-C含量逐漸升高,但在肝臟中VLDL-C含量無顯著變化。Ali[6]用含0.5%甜菜堿的飼糧連續(xù)4周飼喂38周齡蛋雞,結(jié)果表明,蛋雞產(chǎn)蛋率和血清中VTGⅡ含量顯著提高。此外,盧建軍等[40]在老齡蛋雞飼糧中添加600 mg/kg甜菜堿后,發(fā)現(xiàn)血清中VLDL和VTG含量顯著升高,且產(chǎn)蛋率由76.50%提升至83.13%,料蛋比下降9.02%。本試驗結(jié)果顯示,飼糧中適量添加PSE一定程度上提高了老齡蛋雞血清中VLDL含量,并且血清中VTG含量和肝臟中VLDL和VTG含量均顯著提高,其中添加量以200 mg/kg為佳,其全期產(chǎn)蛋率也由75.33%提升至81.82%,這表明PSE可能通過增加卵黃前體物質(zhì)的含量,從而改善產(chǎn)蛋末期蛋雞的產(chǎn)蛋性能。

蛋雞排卵時,卵巢產(chǎn)生的E2經(jīng)血液循環(huán)至肝臟,介導(dǎo)肝臟上的雌激素受體(包括ER-α和ER-β,以ER-α作用為主),調(diào)控VTGⅡ、ApoB和ApoVLDLⅡ mRNA的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)卵黃前體物質(zhì)的組裝合成[41]。Ali[6]進(jìn)一步探究了甜菜堿對體外雞胚原代肝細(xì)胞的影響,驗證其可通過糖皮質(zhì)激素受體與ER-α間的互作調(diào)控肝臟中卵黃前體物質(zhì)合成相關(guān)基因(VTGⅡ和ApoVLDLⅡ)的表達(dá),促進(jìn)卵黃前體物質(zhì)的合成。Amevor等[42]將槲皮素(0.4 g/kg)添加于種雞飼糧中,發(fā)現(xiàn)在種雞激素及其受體表達(dá)水平較低的情況下,槲皮素可作為植物雌激素提高E2、LH、FSH及相關(guān)受體的水平,促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟,進(jìn)而顯著上調(diào)VTGⅡ、ApoB和ApoVLDLⅡ等基因的表達(dá)。PS具有影響性腺合成類固醇激素的能力,并且在動物體內(nèi)發(fā)揮一定的類雌激素功能。研究發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇發(fā)揮著植物雌激素的作用,且傾向與ER-β結(jié)合[43]。Tremblay等[44-45]證明β-谷甾醇可與雌激素受體結(jié)合并促進(jìn)虹鱒魚肝細(xì)胞中VTG的產(chǎn)生而表現(xiàn)出E2活性,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可增加血漿中VTG含量并誘導(dǎo)VTGmRNA表達(dá)。本試驗結(jié)果表明,飼糧中添加200 mg/kg PSE可顯著提高產(chǎn)蛋末期蛋雞血清中E2水平和肝臟中ER-αmRNA相對表達(dá)量,上調(diào)肝臟中VTGⅡ和ApoVLDLⅡ的表達(dá),這與Amevor等[42]的研究結(jié)果相似,表明PSE可發(fā)揮一定的類雌激素作用,誘導(dǎo)卵黃前體物質(zhì)合成相關(guān)基因ER-α、VTGⅡ和ApoVLDLⅡ的表達(dá)。VLDL和VTG含量與產(chǎn)蛋性能也并非簡單的相關(guān)關(guān)系,是否存在與其他調(diào)控因子(如脂質(zhì)代謝)的共同作用還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

飼糧中添加適量PSE可提高產(chǎn)蛋末期蛋雞血清生殖激素(FSH、LH、E2和Prog)水平和抗氧化酶(血清中T-SOD、肝臟中CAT)活性,降低肝臟中MDA含量和Keap1 mRNA相對表達(dá)量,增強(qiáng)肝臟的抗氧化能力,同時誘導(dǎo)肝臟中卵黃前體物質(zhì)合成相關(guān)基因ER-α、VTGⅡ和ApoVLDLⅡ的表達(dá),促進(jìn)肝臟組裝合成卵黃前體物質(zhì)VTG和VLDL,從而改善產(chǎn)蛋末期蛋雞因氧化損傷而導(dǎo)致的產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)下降狀況,且本試驗中以200 mg/kg效果較好。