徐朋濤 陳亞兵 陳 靖 何 來(lái) 劉誠(chéng)傲 郭雙雙 張正帆** 丁斌鷹**

(1.武漢輕工大學(xué),農(nóng)副產(chǎn)品蛋白質(zhì)飼料資源教育部工程研究中心,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430023;2.天門市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,天門 431700)

壞死性腸炎是肉雞養(yǎng)殖中常見(jiàn)的傳染性消化道疾病,主要由A型和G型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起,通常與球蟲病一起發(fā)生或由球蟲病繼發(fā)感染,造成肉雞食欲減退、腸道出血和潰瘍、腹瀉率增加,生長(zhǎng)性能下降,急性感染可導(dǎo)致雞群大量死亡,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。在我國(guó)飼料禁抗、養(yǎng)殖過(guò)程限抗和減抗的時(shí)代背景下,尋找天然、綠色的飼料添加劑防控家禽壞死性腸炎迫在眉睫。單寧酸(tannic acid,TA)是一類多酚類化合物,廣泛存在于五倍子、栗木和高粱等植物中,具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗腹瀉等多種功效[4]。研究表明,飼糧中添加水解單寧酸可通過(guò)改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收率提高飼料轉(zhuǎn)化效率,改善肉雞生長(zhǎng)性能,還可以通過(guò)清除自由基降低氧化應(yīng)激,提高肉雞抗氧化能力,并能夠防止肝臟代償性增大[5-8]。但是單寧酸是否能通過(guò)促進(jìn)腸道發(fā)育和提高抗氧化能力改善球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染引起的壞死性腸炎尚不明確。因此,本研究旨在探討單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞生長(zhǎng)性能、器官指數(shù)、血清生化指標(biāo)、血清和肝臟抗氧化指標(biāo)以及腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,為單寧酸對(duì)肉雞壞死性腸炎的防護(hù)提供一定數(shù)據(jù)參考和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

產(chǎn)氣莢膜梭菌由中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC2030)提供。球蟲四價(jià)活疫苗購(gòu)自佛山市某生物技術(shù)有限公司。水解單寧酸(含量≥80%)由湖北省某生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì),選取平均體重為(46.40±0.40) g的1日齡愛(ài)拔益加(AA)肉仔雞294只,隨機(jī)分為3組,分別為對(duì)照組(CON組)、混合感染組(CCP組)和單寧酸+感染組(CTA組),每組7個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)14只,公母各占1/2。CON組、CCP組飼喂基礎(chǔ)飼糧,CTA組在基礎(chǔ)飼糧中添加1 000 mg/kg水解單寧酸,試驗(yàn)期為28 d?；A(chǔ)飼糧參照《Arbor Acres Broiler Nutrition Specifications(2019)》并結(jié)合實(shí)際配制,其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。其中,粗蛋白質(zhì)(CP)、鈣(Ca)含量分別參照GB/T 6432—2018、GB/T 6436—2018的方法測(cè)定;分別參照GB/T 6437—2018與蘇琪等[9]的方法測(cè)定總磷(TP)和植酸磷(PP)含量,計(jì)算得出非植酸磷(NPP)含量;代謝能(ME)和可消化氨基酸含量根據(jù)《中國(guó)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值表(2021年第32版)》中數(shù)據(jù)計(jì)算得出。在第7天和第10天,CCP組和CTA組每只雞按照球蟲疫苗制造商推薦劑量的30倍灌服1 mL球蟲懸液(滅菌生理鹽水配制,含3×104個(gè)孢子囊/mL),CON組灌服1 mL滅菌生理鹽水。試驗(yàn)第16～20天,CCP組和CTA組每只雞每天灌服1 mL產(chǎn)氣莢膜梭菌新鮮菌液(活菌數(shù)為1×108CFU/mL),CON組灌服1 mL滅菌皰肉培養(yǎng)基。肉雞自由采食,充足飲水,按正常免疫程序進(jìn)行免疫接種。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

1.3 樣品采集

試驗(yàn)第14、21和28天從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取接近平均體重的2只雞,用抗凝的真空采血管[抗凝劑:乙二胺四乙酸(EDTA)和肝素鈉]翅下靜脈采血5 mL,采血后頸動(dòng)脈放血致死。將血液常溫送至實(shí)驗(yàn)室,4 ℃條件下3 500 r/min離心10 min,取上清分裝于干凈的EP管中,置于-80 ℃冰箱冷凍儲(chǔ)存;使用剪刀和鑷子打開腹腔進(jìn)行屠宰取樣,解剖分離出肝臟、脾臟、十二指腸、空腸、回腸、胸腺和法氏囊,將肝臟、脾臟、胸腺和法氏囊剔除脂肪后進(jìn)行稱重;再取十二指腸、空腸、回腸中段1 cm的腸段置于4%的多聚甲醛液中進(jìn)行固定,然后將樣品送至武漢博士德生物工程有限公司進(jìn)行組織石蠟包埋,制成蘇木精-伊紅(HE)染色切片;將剩余的十二指腸、空腸、回腸和肝臟樣品剪碎,用滅菌錫箔紙包好,標(biāo)記后放入液氮速凍,之后取出保存于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱備用。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)期間每日以重復(fù)為單位記錄采食量和死亡情況,分別于14、21和28日齡以重復(fù)為單位稱取空腹?fàn)顟B(tài)下肉雞體重,計(jì)算各重復(fù)的平均體重(ABW)、平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。計(jì)算公式如下:

ABW=每階段肉雞總末重/雞數(shù);
ADFI=總采食量/試驗(yàn)天數(shù);
ADG=總增重/試驗(yàn)天數(shù);
F/G=ADFI/ADG。

1.4.2 器官指數(shù)

分別于14、21和28日齡屠宰肉雞,分離肝臟、脾臟、胸腺和法氏囊,剔除周邊組織和脂肪,用濾紙擦干血水進(jìn)行稱重,并計(jì)算器官指數(shù),計(jì)算公式為:

器官指數(shù)(%)=[器官重量(g)/

雞體重(g)]×100。

1.4.3 血清生化指標(biāo)

使用日立7100全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中總蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、葡萄糖(glucose,GLU)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、鈣、磷、尿酸(uric acid,UA)含量以及γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyl transferase,GGT)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性。

1.4.4 血清和肝臟抗氧化指標(biāo)

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒使用多功能酶標(biāo)儀(Spectra Max M5,Molecular Devices,美國(guó))測(cè)定血清和肝臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(hydrogen peroxidase,CAT)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性和總抗氧化力(total antioxidant capacity,T-AOC)以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)和過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)含量。

1.4.5 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)

使用OLYMPSBX-41TF型光學(xué)顯微鏡對(duì)腸道組織切片進(jìn)行觀察,應(yīng)用HPISA-1000高清彩色病理圖文報(bào)告系統(tǒng)分析。每張腸道組織切片選取8～10個(gè)不同走向且相對(duì)完整的絨毛,測(cè)量該絨毛高度(VH)及其隱窩深度(CD),取平均值作為最終測(cè)量值,并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(V/C)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,當(dāng)組間差異顯著時(shí),采用Duncan氏多重比較法進(jìn)行組間差異顯著性分析。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05表示差異顯著,0.05≤P<0.10表示差異有顯著的趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知,與CON組相比,球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染顯著降低了肉雞14、21和28日齡的ABW以及1～14日齡、15～21日齡和1～28日齡的ADG和ADFI(P<0.05),顯著提高了1～14日齡、15～21日齡和1～28日齡的F/G(P<0.05)。與CCP組相比,飼糧中添加1 000 mg/kg單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染造成的肉雞各階段生長(zhǎng)性能下降無(wú)顯著改善作用(P>0.05)。

2.2 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞器官指數(shù)的影響

由表3可知,14日齡時(shí),與CON組相比,CCP組肉雞肝臟指數(shù)顯著提高(P<0.05),胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)顯著降低(P<0.05);CTA組肉雞各器官指數(shù)與CCP組差異不顯著(P>0.05)。21日齡時(shí),CCP組肉雞胸腺指數(shù)顯著高于CON組和CTA組(P<0.05)。28日齡時(shí),CCP組和CTA組肉雞脾臟指數(shù)顯著高于CON組(P<0.05);與CON組和CCP組相比,CTA組肉雞肝臟指數(shù)顯著提高(P<0.05)。

表3 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞器官指數(shù)的影響 Table 3 Effects of tannic acid on organ indices of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens %

2.3 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知,與CON組相比,CCP組肉雞14日齡血清ALB、TC和HDL含量顯著降低(P<0.05),21日齡血清GLU、HDL和Ca含量以及28日齡血清HDL含量顯著降低(P<0.05),21日齡血清GGT和LDH活性與28日齡血清磷(P)含量顯著升高(P<0.05)。CTA組對(duì)肉雞各日齡血清生化指標(biāo)與CCP組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞血清生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of tannic acid on serum biochemical indices of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens

2.4 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可知,CCP組肉雞14日齡血清GSH-Px、CAT和T-SOD活性顯著低于CON組和CTA組(P<0.05)。與CON組相比,CCP組肉雞21日齡血清GSH-Px和CAT活性顯著降低(P<0.05);與CCP組相比,CTA組肉雞21日齡血清GSH-Px、CAT和T-SOD活性顯著升高(P<0.05)。CCP組肉雞28日齡血清CAT活性顯著低于CON組和CTA組(P<0.05)。CCP組肉雞14和28日齡血清H2O2含量顯著高于CON組和CTA組(P<0.05)。

表5 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of tannic acid on serum antioxidant indices of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens

由表6可知,CCP組肉雞14日齡肝臟CAT活性顯著低于CON組和CTA組(P<0.05),同時(shí)肝臟MDA含量顯著高于CON組和CTA組(P<0.05)。CCP肉雞組21日齡肝臟CAT和T-SOD活性顯著低于CON組和CTA組(P<0.05)。CCP組肉雞28日齡肝臟T-SOD活性顯著低于CON組和CTA組(P<0.05)。CCP組肉雞各日齡肝臟H2O2含量均顯著高于CON組和CTA組(P<0.05)。

表6 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞肝臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 6 Effects of tannic acid on liver antioxidant indices of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens

2.5 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表7可知,CTA組肉雞14日齡十二指腸VH和V/C顯著高于CON組和CCP組(P<0.05),同時(shí)十二指腸和空腸CD顯著低于CON組和CCP組(P<0.05)。與CON組,CCP組肉雞21和28日齡十二指腸、空腸、回腸VH和V/C顯著降低(P<0.05),同時(shí)十二指腸和空腸CD顯著增加(P<0.05);與CCP組相比,CTA組肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)得到改善。

表7 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Table 7 Effects of tannic acid on intestinal morphology of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens

3 討 論

3.1 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞生長(zhǎng)性能的影響

球蟲感染可導(dǎo)致肉雞腸道黏膜損傷,破壞腸道穩(wěn)態(tài),易繼發(fā)感染產(chǎn)氣莢膜梭菌[2,10-11]。產(chǎn)氣莢膜梭菌可產(chǎn)生多種毒素,最終引起雞壞死性腸炎,導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化利用率下降,飼料轉(zhuǎn)化率和體重降低[12-13]。本研究結(jié)果表明,混合感染球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌后,肉雞生長(zhǎng)性能下降,說(shuō)明腸道損傷模型構(gòu)建成功[14-15]。研究表明,飼糧中添加10～300 mg/kg原花青素、葡萄籽提取物和五倍子單寧酸能顯著改善肉雞的生長(zhǎng)性能[16-18]。但也有研究表明1 000 ～2 000 mg/kg單寧酸會(huì)顯著降低肉雞的日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn),1 000 mg/kg單寧酸不能改善球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染引起的肉雞生長(zhǎng)性能下降,這與Choi等[21]和Xu等[22]的報(bào)道結(jié)果不一致。這些結(jié)果表明單寧酸的生物學(xué)效價(jià)可能呈劑量依賴效應(yīng),和單寧酸種類、提取工藝和飼糧結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

3.2 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞器官指數(shù)的影響

胸腺、脾臟和法氏囊是家禽的主要免疫器官,肝臟是機(jī)體脂肪代謝的重要場(chǎng)所。研究表明,球蟲感染和壞死性腸炎會(huì)導(dǎo)致肉雞腸黏膜損傷,引起肉雞腸道功能紊亂,使腸道細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物易位進(jìn)入肝臟[23-24]。Daneshmand等[25]研究發(fā)現(xiàn),產(chǎn)氣莢膜梭菌會(huì)刺激脾細(xì)胞導(dǎo)致T細(xì)胞繁殖發(fā)育。本試驗(yàn)表明,球蟲感染后肉雞肝臟指數(shù)提高,法氏囊指數(shù)和胸腺指數(shù)降低,可能導(dǎo)致肉雞免疫力下降。本結(jié)果與童玉鑫等[7]的研究結(jié)果一致。而產(chǎn)氣莢膜梭菌感染顯著提高了肉雞胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù),這與張?jiān)蒣26]和陳鎖[27]的研究結(jié)果不一致。其原因可能是產(chǎn)氣莢膜梭菌刺激了胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞繁殖發(fā)育,引起了肉雞的代償性調(diào)節(jié)。

3.3 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞血清生化指標(biāo)的影響

血清TC、TG、LDL和HDL含量可以反映機(jī)體脂質(zhì)代謝情況,過(guò)高或過(guò)低均會(huì)引起血脂異常,導(dǎo)致疾病發(fā)生[28]。本試驗(yàn)中,混合感染球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌顯著降低了肉雞血清TC和HDL含量,表明球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞后可能導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂。LDH與細(xì)胞能量代謝和ATP的產(chǎn)生有關(guān),細(xì)胞受損會(huì)使LDH釋放到細(xì)胞外,降低能量利用率[29]。本研究結(jié)果表明,球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染引起肉雞腸道炎癥,可能導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞損傷,從而導(dǎo)致LDH釋放增加。血清GGT活性能一定程度反映肝臟健康狀況,肝臟受損導(dǎo)致肝細(xì)胞細(xì)胞膜通透性增加,GGT活性升高[30-31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染可能引起肉雞肝功能紊亂,影響肝臟代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn),從而導(dǎo)致生長(zhǎng)性能下降。此外,球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染降低了肉雞血清GLU和Ca含量,導(dǎo)致機(jī)體糖代謝紊亂,可能是肝臟功能、腎臟功能紊亂和壞死性腸炎引起的[32]。

3.4 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞抗氧化能力的影響

動(dòng)物體內(nèi)抗氧化酶活性和MDA含量可反映機(jī)體抗氧化能力強(qiáng)弱。已有研究證明,球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染可增加肉雞體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,引起機(jī)體氧化應(yīng)激[22]。Li等[33]和Zhao等[34]報(bào)道,球蟲和產(chǎn)莢膜梭菌感染肉雞血清和肝臟中CAT、SOD和GSH-Px等酶活性降低。與前人報(bào)道一致,本試驗(yàn)結(jié)果表明,球蟲和產(chǎn)莢膜梭菌混合感染顯著降低了肉雞血清和肝臟GSH、CAT和T-SOD活性,提高了血清和肝臟MDA和H2O2含量。Zhang等[35]研究表明,250和500 mg/kg五倍子單寧酸改善了黃曲霉毒素B1感染肉雞的抗氧化能力。Xi等[5]研究發(fā)現(xiàn),250 mg/kg單寧酸可以降低黃曲霉毒素B1感染肉雞血清MDA含量,提高血清CAT和GSH-Px活性。結(jié)合以上研究結(jié)果可知,飼糧中添加1 000 mg/kg單寧酸可以改善球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染引起的肉雞抗氧化能力下降。

3.5 單寧酸對(duì)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

研究表明,球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染會(huì)造成肉雞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷,引起營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率下降[22,35-37]。李軍輝等[6]報(bào)道,飼糧中添加水解單寧酸顯著提高了肉雞十二指腸和空腸VH和V/C,降低了CD。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加17 mg/kg葡萄原花青素顯著改善了肉仔雞空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)。與前人報(bào)道一致,本研究發(fā)現(xiàn)球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染造成肉雞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)受損,并且飼糧中添加1 000 mg/kg單寧酸能明顯改善球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染會(huì)造成肉雞生長(zhǎng)性能下降、抗氧化能力降低和腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)損壞,盡管飼糧中添加1 000 mg/kg單寧酸不能改善球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染造成的肉雞生長(zhǎng)性能下降,但是可以提高球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染肉雞的抗氧化能力,修復(fù)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷。