王珊珊 狄寒秋 鐘一帆 陳 斌 施 憲 汪海峰*

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,杭州 310058;2.浙江華統(tǒng)肉制品股份有限公司,義烏 322005)

全球變暖已成為世界關(guān)注的熱點(diǎn)問題。正如聯(lián)合國政府間氣候變化專門委員會(IPCC)第6次評估報告所述,全球溫室氣體排放量持續(xù)上升,甲烷(CH4)作為第二大溫室氣體,誘導(dǎo)溫室效應(yīng)能力遠(yuǎn)高于二氧化碳(CO2),目前CH4排放的增長速度為自20世紀(jì)80年代以來的最高值[1]。2021年《全球甲烷評估》報告指出,畜禽糞便和腸道發(fā)酵的CH4排放量約占全球人為排放總量的32%,僅次于能源生產(chǎn)排放的CH4[2]。反芻動物被認(rèn)為是畜禽CH4的主要來源,雖然豬的腸道CH4產(chǎn)量遠(yuǎn)低于反芻動物,但由于其全球種群數(shù)量龐大,尤其我國是世界主要生豬養(yǎng)殖大國,養(yǎng)殖量占世界1/2以上,所產(chǎn)CH4對環(huán)境的影響不容小覷。飼糧成本占生豬生產(chǎn)總成本最大,其中能量是最昂貴的組成部分,約占飼糧成本的70%[3]。現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中,CH4排放產(chǎn)生的能量損失約占豬飼糧總能的0.7%,更有研究表明飼喂高纖維飼糧的成年母豬產(chǎn)生的CH4能量損耗高達(dá)3.36%消化能[4-5]。因此,研究探索如何減少豬生產(chǎn)過程中的CH4排放有助于提高其飼糧利用率,降低CH4對全球變暖的負(fù)面影響。

近年來,有許多研究描述了瘤胃中產(chǎn)甲烷菌的多樣性,以及在體外和體內(nèi)條件下通過一系列方法進(jìn)行的緩解CH4排放策略,包括改變動物管理、調(diào)整飼糧結(jié)構(gòu)、飼喂微生物制劑及添加化學(xué)抑制劑如三氯乙酰胺、水合氯醛、硝基乙烷、3-硝氧基丙醇和氯仿等,這些方法均可以在反芻動物中找到廣泛應(yīng)用,這也可能適用于非反芻動物的CH4緩解。但由于一些抑制劑具有毒性,殘留于動物體內(nèi)不僅容易引起機(jī)體不良副作用,其排泄物還會對環(huán)境造成污染和破壞;更有甚者易蓄積在動物產(chǎn)品中,進(jìn)而損害人類健康[6-8]。研究表明,植物及其提取物可能間接(影響與產(chǎn)甲烷菌相關(guān)的原生動物、細(xì)菌和真菌的數(shù)量)和直接影響產(chǎn)甲烷菌群的生長、發(fā)育、活性和多樣性來影響產(chǎn)甲烷菌[9]。研究報道,一些植物提取物如大蒜、牛至和肉桂等多種植物精油已被證明可以降低體外CH4排放,并具有調(diào)節(jié)瘤胃環(huán)境、改善動物性能的潛力[10-12]。其中,含有有機(jī)硫化合物蒜氨酸、二烯丙基硫醚和大蒜素(allicin,ALN)的大蒜油則被認(rèn)為是體外抑制產(chǎn)CH4最有效的植物化合物之一[13]。

體外發(fā)酵產(chǎn)氣法是一種通過在可控環(huán)境下測量發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氣體量來評估發(fā)酵速度進(jìn)而實(shí)現(xiàn)模擬動物體內(nèi)消化的試驗(yàn)方法,具有簡單易行、通用性強(qiáng)和重復(fù)性好的特點(diǎn)[14]。Menke等[15]研究發(fā)現(xiàn),體外產(chǎn)氣法所測得的產(chǎn)氣量與體內(nèi)干物質(zhì)的代謝能及降解率呈顯著正相關(guān),且相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.98。Bauer等[16]研究表明,豬糞便微生物與結(jié)腸微生物區(qū)系相似,且糞便采樣相比于腸道內(nèi)容物采樣更便捷,因此使用豬糞便作為微生物接種源能有效模擬豬體內(nèi)結(jié)腸發(fā)酵。到目前為止,大多數(shù)體外研究的目的是評估植物提取物對瘤胃CH4產(chǎn)量的影響,而對豬腸道CH4調(diào)控研究有限。因此,本研究利用體外產(chǎn)氣的方法,研究不同植物提取物對生長肥育豬糞樣微生物發(fā)酵特性與CH4產(chǎn)量的影響,比較了不同濃度、不同種類的植物提取物對豬糞樣微生物產(chǎn)CH4的作用差異,旨在為降低豬腸道CH4排放提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物提取物

3種植物提取物牛至油(origanum oil,ORM)、肉桂油(cinnamon oil,CIN)及大蒜素均購自上海某生物科技有限公司。參照張然等[17]所用方法添加樣品:分別稱取100、200和400 mg樣品溶于5 mL無水乙醇中混勻,使得濃度分別為20、40和80 mg/mL,取0.5 mL上述溶液加入到相應(yīng)的產(chǎn)氣瓶中,使樣品最終在50 mL發(fā)酵液中濃度依次達(dá)到200、400和800 mg/L,對照(CON)組加入0.5 mL無水乙醇。

1.1.2 飼糧底物

以浙江省某牧場提供的生長肥育豬飼糧作為底物,飼糧底物組成及營養(yǎng)水平見表1。飼糧在試驗(yàn)前粉碎并過1 mm篩,按照1%質(zhì)量濃度稱取0.5 g到產(chǎn)氣瓶中。

表1 飼糧底物組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the dietary substrate (DM basis) %

1.1.3 接種糞樣采集與處理

隨機(jī)選擇浙江省某牧場5頭日齡、體型相近的平均體重為(55.0±5.0) kg的商品豬,采用直腸刺激法收集新鮮糞樣并立即置于充滿CO2的自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。從5份鮮糞樣中稱取等重量糞樣,在厭氧環(huán)境下混合,并在接種前用39 ℃無菌生理鹽水按照50%質(zhì)量濃度對糞樣進(jìn)行稀釋,并用4層無菌紗布過濾得到含糞樣微生物的濾液(以下簡稱為糞液)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計

采用3×3雙因素試驗(yàn)設(shè)計,在底物中分別添加不同濃度的植物提取物,使發(fā)酵液中3種植物提取物(牛至油、肉桂油和大蒜素)的濃度分別為200、400和800 mg/L,另設(shè)不添加任何植物提取物的空白對照組,每個處理設(shè)7個重復(fù)。

1.2.2 培養(yǎng)基制備

參照Theodorou等[18]提出的配方制備培養(yǎng)液,按表2比例和順序混合制備,同時不斷通入CO2使培養(yǎng)基由藍(lán)色變?yōu)闊o色后按45 mL/瓶迅速分裝至產(chǎn)氣瓶中,并用CO2飽和后密封。

表2 體外發(fā)酵培養(yǎng)基配方Table 2 Components of medium used for in vitro fermentation

1.2.3 體外發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)參照Menke等[19]提出的體外產(chǎn)氣法進(jìn)行,將糞液按5 mL/瓶接種于上述含底物、處理和培養(yǎng)基的100 mL產(chǎn)氣瓶中,并迅速將產(chǎn)氣瓶置于39 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后冰浴終止發(fā)酵(在正式培養(yǎng)前將產(chǎn)氣瓶中所產(chǎn)氣體排空,不計入發(fā)酵產(chǎn)氣量)。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 產(chǎn)氣量與產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)

用壓力傳感器記錄發(fā)酵0、2、6、12、24、48 h的壓力值并用集氣袋收集產(chǎn)氣瓶內(nèi)全部氣體,產(chǎn)氣量由以下公式計算:

GPt=Pt(V0-50)/(101.3W)。

式中:GPt為t時的產(chǎn)氣量(mL/g DM);Pt為t時測得的壓力值(MPa);V0為產(chǎn)氣瓶體積(mL);W為飼糧底物干物質(zhì)重量(g)。

累積產(chǎn)氣量由各時間點(diǎn)的產(chǎn)氣量相加得到。

利用Origin 2021將各時間點(diǎn)的產(chǎn)氣量代入Gompertz模型[20]公式對產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行擬合,公式為:

1.3.2 CH4產(chǎn)量

使用氣密進(jìn)樣針(SGE-008770,Trajan,澳大利亞)從集氣袋中抽取5 mL的氣體注入氣相色譜儀(GC-2010 Plus,島津株式會社,日本)測定CH4濃度(色譜柱:毛細(xì)管柱,30 m×0.25 mm×0.25 μm,HP-INNOWAX,19091N-133)。參數(shù)設(shè)定如下:柱溫80 ℃,汽化室100 ℃,檢測室120 ℃,載氣為高純氮?dú)?N2),壓力179.5 kPa,總流量46.2 mL/min,柱流量2.7 mL/min,分流比15,吹掃流量3 mL/min,循環(huán)流量30 mL/min,氫氣(H2)流量40 mL/min,空氣流量400 mL/min。CH4產(chǎn)量是用生成的氣體總量乘以其在被分析樣品中相應(yīng)的CH4濃度來計算的,累積CH4產(chǎn)量由各時間點(diǎn)CH4產(chǎn)量相加得到。

1.3.3 短鏈脂肪酸(SCFA)

發(fā)酵結(jié)束后抽取1 mL發(fā)酵液,加入250 μL偏磷酸,4 ℃孵育10 min,15 000×g離心10 min,取上清液通過0.22 μm濾膜后用氣相色譜儀(GC-2010,島津株式會社,日本)測定SCFA濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)通過Excel 2016進(jìn)行計算整理后,采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差(one-way AVOVA)分析,利用SAS 9.4進(jìn)行雙因素方差分析,并使用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外發(fā)酵累積產(chǎn)氣量的變化

不同處理的體外發(fā)酵累積產(chǎn)氣量變化曲線如圖1所示。由圖1-A可知,與對照組相比,從發(fā)酵12 h開始,200 mg/L牛至油組累積產(chǎn)氣量顯著降低(P<0.05);從發(fā)酵24 h開始,各200 mg/L植物提取物組累積產(chǎn)氣量均顯著降低(P<0.05),其中200 mg/L大蒜素組下降幅度最大。由圖1-B可知,從發(fā)酵12 h開始,各400 mg/L植物提取物組累積產(chǎn)氣量均顯著低于對照組(P<0.05),其中400 mg/L牛至油組下降幅度最大。由圖1-C可知,從發(fā)酵6 h開始,各800 mg/L植物提取物組累積產(chǎn)氣量均顯著低于對照組(P<0.05),下降幅度由大到小依次為牛至油組>肉桂油組>大蒜素組。

與對照組相比,各濃度植物提取物組體外發(fā)酵48 h累積產(chǎn)氣量變化百分比如圖2所示。各濃度植物提取物組48 h累積產(chǎn)氣量均顯著低于對照組(P<0.05),其中200 mg/L肉桂油組下降幅度最小,800 mg/L牛至油組下降幅度最大;此外,在200和800 mg/L濃度時,各植物提取物組之間48 h累積產(chǎn)氣量變化百分比差異顯著(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)記*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05),數(shù)據(jù)柱之間標(biāo)記*表示差異顯著(P<0.05)。圖4和圖5同。* marked on value columns mean significant difference compared with CON group (P<0.05), and * marked between value columns mean significant difference (P<0.05). The same as Fig.4 and Fig.5.圖2 不同濃度的3種植物提取物對體外發(fā)酵48 h累積產(chǎn)氣量變化的影響Fig.2 Effects of different concentrations of three plant extracts on cumulative gas production changes at 48 h in in vitro fermentation

2.2 體外發(fā)酵產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)的變化

與對照組相比,各濃度植物提取物組體外發(fā)酵產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)差異百分比見表3。各植物提取物組的理論最大產(chǎn)氣量均有不同程度的降低,其中200 mg/L大蒜素組、400 mg/L牛至油組、800 mg/L牛至油組和800 mg/L肉桂油組均顯著低于對照組(P<0.05),且上述4組之間差異顯著(P<0.05),800 mg/L牛至油組理論最大產(chǎn)氣量最低。除800 mg/L牛至油組產(chǎn)氣速率顯著高于對照組(P<0.05)外,其他植物提取物組產(chǎn)氣速率均有不同程度的降低,其中800 mg/L肉桂油組最低。各200 mg/L植物提取物組產(chǎn)氣延滯時間與對照組相比無顯著差異(P>0.05),400 mg/L肉桂油組400 mg/L大蒜素組產(chǎn)氣延滯時間顯著高于對照組(P<0.05),而400 mg/L牛至油組和各800 mg/L植物提取物組產(chǎn)氣延滯時間顯著低于對照組(P<0.05),其中400 mg/L牛至油組產(chǎn)氣延滯時間最低。植物提取物種類與濃度對產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)差異百分比均有極顯著影響(P<0.01),且均存在極顯著交互作用(P<0.01)。

表3 不同濃度的3種植物提取物體外發(fā)酵產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)變化百分比Table 3 Percentage of gas production kinetics parameter changes of three plant extracts with different concentrations in in vitro fermentation %

2.3 體外發(fā)酵累積CH4產(chǎn)量的變化

不同處理的體外發(fā)酵累積CH4產(chǎn)量變化曲線如圖3所示。由圖3-A可知,與對照組相比,從發(fā)酵24 h開始,200 mg/L牛至油組累積CH4產(chǎn)量顯著降低(P<0.05);從發(fā)酵6 h開始,200 mg/L大蒜油組累積CH4產(chǎn)量顯著降低(P<0.05),且200 mg/L大蒜油抑制CH4生成的效果強(qiáng)于200 mg/L牛至油。由圖3-B可知,從發(fā)酵6 h開始,各400 mg/L植物提取物組累積CH4產(chǎn)量均顯著低于對照組(P<0.05),其中400 mg/L牛至油抑制CH4生成的效果最好。由圖3-C可知,當(dāng)處理濃度提高至800 mg/L時,3種植物提取物抑制CH4生成的效果均有所增強(qiáng),且不同植物提取物之間差異顯著(P<0.05),其中800 mg/L牛至油組累積CH4產(chǎn)量最低。

圖3 不同濃度的3種植物提取物體外發(fā)酵累積CH4產(chǎn)量變化曲線Fig.3 Cumulative CH4 production curves of three plant extracts with different concentrations in in vitro fermentation

與對照組相比,各濃度植物提取物組體外發(fā)酵48 h累積CH4產(chǎn)量變化百分比如圖4所示。除200 mg/L牛至油組外,各濃度植物提取物組48 h累積CH4產(chǎn)量均顯著低于對照組(P<0.05),且200和800 mg/L濃度不同處理之間差異顯著(P<0.05)。3種植物提取物的累積CH4產(chǎn)量下降幅度均隨著處理濃度的增大而增大,其中800 mg/L牛至油組下降幅度最大,其次是800 mg/L肉桂油組。

與對照組相比,各濃度植物提取物組不同發(fā)酵時間點(diǎn)所產(chǎn)生的氣體中CH4濃度變化百分比見表4。各400 mg/L植物提取物組從發(fā)酵6 h開始CH4濃度開始顯著下降(P<0.05),各800mg/L植物提取物組從發(fā)酵2 h開始CH4濃度開始顯著下降(P<0.05),說明各800 mg/L植物提取物對CH4生成的抑制效果更快。此外,各400和800 mg/L植物提取物組在發(fā)酵至48 h時CH4濃度下降幅度減小,而200 mg/L大蒜素組CH4濃度下降幅度隨著發(fā)酵時間增加而逐漸增大,直至發(fā)酵48 h,其CH4濃度下降幅度達(dá)到最大,顯著低于其他組(P<0.05)。植物提取物種類與濃度對各時間點(diǎn)的CH4濃度變化百分比均有極顯著影響(P<0.01),且均存在極顯著的交互作用(P<0.01)。

表4 不同濃度的3種植物提取物體外發(fā)酵CH4濃度變化百分比Table 4 Percentage of CH4 concentration changes of three plant extracts with different concentrations in in vitro fermentation %

2.4 體外發(fā)酵SCFA濃度的變化

與對照組相比,各濃度植物提取物組發(fā)酵48 h終末產(chǎn)物中SCFA濃度變化百分比如圖5所示。由5-A可知,各200 mg/L植物提取物組乙酸濃度相較于對照組而言有不同程度的提高,其中200 mg/L大蒜素組乙酸濃度顯著高于其他2組(P<0.05);而各800 mg/L植物提取物組乙酸濃度均顯著低于對照組(P<0.05),且不同植物提取物組之間差異顯著(P<0.05)。由5-B可知,與對照組相比,200 mg/L肉桂油組、200 mg/L大蒜素組和400 mg/L大蒜素組丙酸濃度顯著提高(P<0.05),其中200 mg/L大蒜素組增幅高達(dá)24.38%,其余植物提取物組丙酸濃度則出現(xiàn)不同程度的降低,且各牛至油組丙酸濃度的下降幅度隨著處理濃度的增大而增大。由5-C可知,與對照組相比,除800 mg/L牛至油組和800 mg/L肉桂油組丁酸濃度顯著降低(P<0.05)外,200 mg/L牛至油組、400 mg/L肉桂油組及各大蒜素組丁酸濃度均顯著提高(P<0.05)。由5-D可知,與對照組相比,除200 mg/L牛至油組戊酸濃度顯著提高(P<0.05)外,其余植物提取物組均出現(xiàn)不同程度的降低,且下降幅度均隨著處理濃度的增大而增大。由5-E可知,各200 mg/L植物提取物組總SCFA濃度相較對照組而言都有不同程度的提高,其中200 mg/L大蒜素組總SCFA濃度上升幅度最大(P<0.05);除200 mg/L肉桂油組外,各植物提取物組總SCFA濃度與對照組相比差異顯著(P<0.05),其中各800 mg/L植物提取物組總SCFA濃度均顯著降低(P<0.05),且不同植物提取物組之間總SCFA濃度差異顯著(P<0.05)。由5-F可知,與對照組相比,不同濃度的大蒜素組乙酸/丙酸值均有不同程度的降低,但只有400 mg/L大蒜素組表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05);而800 mg/L肉桂油組乙酸/丙酸值顯著高于對照組(P<0.05),增幅高達(dá)428.80%。

3 討 論

3.1 不同植物提取物對生長肥育豬糞樣微生物體外發(fā)酵產(chǎn)氣的影響

目前體外產(chǎn)氣技術(shù)雖已得到了廣泛應(yīng)用,但由于發(fā)酵過程中不能將代謝產(chǎn)物及時移除,體外發(fā)酵只能反映較短時段內(nèi)的微生物代謝情況?；谏L豬大腸中26～44 h的飼糧轉(zhuǎn)運(yùn)時間,本試驗(yàn)選擇48 h的發(fā)酵時長,以期準(zhǔn)確描述豬糞樣微生物發(fā)酵特性[21]。體外研究表明,產(chǎn)氣量與有機(jī)物的消化率呈正相關(guān)[16]。本試驗(yàn)培養(yǎng)初期發(fā)酵速度較快,可能是由于前期底物能夠提供充足的營養(yǎng),后期可能會因營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被分解消耗導(dǎo)致產(chǎn)氣趨于平穩(wěn),這一趨勢與楊翠鳳[22]的研究一致。此外,本研究結(jié)果與Cobellis等[23]和Zhou等[24]的報告一致,即肉桂油和牛至油表現(xiàn)出了對氣體總產(chǎn)量的顯著抑制作用;而大蒜素的處理結(jié)果與Patra等[11]的研究結(jié)果一致,即低、中和高濃度大蒜油處理后發(fā)現(xiàn)高濃度抑制總產(chǎn)氣量效果最強(qiáng),但遠(yuǎn)不及牛至油。這可能是因?yàn)橹参锾崛∥锏目咕钚耘c其主要化合物的類型密切相關(guān),如牛至油中的香芹酚和百里香酚、肉桂油中的肉桂醛等化合物具有較強(qiáng)的活性,能夠有效阻止微生物生長[25]。體外產(chǎn)氣動力學(xué)可以通過數(shù)學(xué)模型定量描述微生物發(fā)酵及產(chǎn)物生成的過程,提供對預(yù)測飼糧底物消化有用的信息。本研究中,800 mg/L牛至油的理論最大產(chǎn)氣量達(dá)到最低,筆者推測是牛至油更強(qiáng)的抑菌作用引發(fā)了更低的氣體產(chǎn)量。Bindelle等[26]報告表明,更小的發(fā)酵產(chǎn)氣速率和較長的延滯時間可能與接種物中活菌濃度的降低以及微生物適應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)的存在有關(guān)。這或許也解釋了本試驗(yàn)中產(chǎn)氣速率隨著處理濃度提高而降低的現(xiàn)象,但可能還受其他因素的影響,因此還需在以后的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證它們對體外發(fā)酵氣體生成的影響機(jī)制。

3.2 不同植物提取物對生長肥育豬糞樣微生物體外發(fā)酵液中SCFA濃度的影響

碳水化合物在結(jié)腸被微生物發(fā)酵生成的SCFA可被宿主用于自身的能量供應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)菌增殖[27]。Varel等[28]研究表明,SCFA可以滿足生長豬15%和母豬30%的維持能量需求。乙酸、丙酸和丁酸是SCFA的主要成分,占總量的90%～95%[29]。其中,乙酸和丙酸參與宿主的能量代謝,且丙酸已被證明可以抑制主要脂肪生成底物如乙酸的代謝,丁酸則是結(jié)腸黏膜細(xì)胞最重要的能量來源[30-32]。產(chǎn)甲烷菌可以利用腸道中的H2、CO2、乙酸等碳底物合成CH4,而腸道中H2含量可直接受到SCFA發(fā)酵模式的影響,如生成1 mol乙酸能產(chǎn)生2 mol H2,而生成1 mol丙酸只產(chǎn)生1 mol H2[33]。因此,生產(chǎn)上被認(rèn)可的緩解CH4排放的添加劑應(yīng)該在不損害飼糧降解和SCFA產(chǎn)量的情況下減少CH4的生成。

近年來,一些體外研究探討了植物提取物(如精油、大蒜提取物)通過增加揮發(fā)性脂肪酸的比例來提高瘤胃發(fā)酵效率的能力,但也存在與之相反的情況[34-35]。Evans等[36]研究發(fā)現(xiàn),百里香酚在濃度為90 mg/L時能選擇性抑制反芻單胞菌的生長,但不抑制牛鏈球菌的生長,而當(dāng)濃度提高到400 mg/L時,瘤胃微生物活動被全面抑制,說明添加過量的植物提取物有可能使其對微生物種群的選擇性影響轉(zhuǎn)變?yōu)榉翘禺愋缘囊志饔?。本試?yàn)中,各800 mg/L植物提取物均同時顯著降低了乙酸、丙酸和總SCFA濃度,這可能是由于過量的植物提取物導(dǎo)致糞便菌群受到了無差別損傷。Michiels等[37]研究表明,1 000 mg/L香芹酚和百里香酚顯著抑制了體外模擬豬空腸發(fā)酵中所有細(xì)菌的生長,其中厭氧菌總數(shù)均顯著降低。本試驗(yàn)中,200 mg/L牛至油顯著提高了總SCFA濃度,而400 mg/L則結(jié)果相反,說明牛至油可能從某一濃度開始對腸道細(xì)菌生長有明顯的抑制作用。但由于牛至油組成比例不同,且豬腸道細(xì)菌對其敏感性存在差異,因此抑菌臨界值也會不同[38]。本試驗(yàn)中,各200 mg/L植物提取物均提高了總SCFA濃度,且大蒜素效果最好。大蒜素組總SCFA濃度顯著提高可能是由于細(xì)菌和真菌的生長增加,促進(jìn)了有機(jī)物的降解,進(jìn)而增加了SCFA,降低了CH4產(chǎn)量[39];且Cremonesi等[40]發(fā)現(xiàn)在仔豬飼糧中添加大蒜油與牛至油混合物后,SCFA生成菌屬中的瘤胃球菌屬顯著增加,這可能也解釋了本試驗(yàn)出現(xiàn)的結(jié)果。

3.3 不同植物提取物對生長肥育豬糞樣微生物體外發(fā)酵產(chǎn)CH4的影響

一些研究結(jié)果表明,CH4產(chǎn)量的降低通常伴隨著飼糧消化和發(fā)酵的降低[11]。某些植物精油或其化合物的抗產(chǎn)CH4活性是非特異性的,如香芹酚和百里香酚通過破壞細(xì)胞膜、增加細(xì)胞對ATP的通透性等來發(fā)揮抗菌作用[41]。本試驗(yàn)中,各800 mg/L植物提取物處理后48 h累積CH4產(chǎn)量降低的同時累積產(chǎn)氣量和總SCFA濃度都降低,這進(jìn)一步驗(yàn)證了上述說法。Macheboeuf等[12]研究發(fā)現(xiàn),添加264 mg/L肉桂醛能在不影響總揮發(fā)性脂肪酸含量的同時減少體外CH4生成,這與本研究中肉桂醛的處理結(jié)果一致。本研究中,大蒜素表現(xiàn)出了最有趣的結(jié)果,因?yàn)樘砑舆m當(dāng)濃度大蒜素后能在減少CH4產(chǎn)量的同時顯著提高總SCFA濃度。Soliva等[42]研究發(fā)現(xiàn),300 mg/L大蒜油幾乎完全抑制了體外CH4生成,且未顯著降低有機(jī)物表觀消化率。這一研究與本試驗(yàn)的結(jié)果相似,而減少CH4排放的效果則可能取決于大蒜油的不同品種、濃度等因素。Ruiz等[43]研究表明,添加蒜氨酸和大蒜素分解得到的有機(jī)硫化合物能導(dǎo)致體外發(fā)酵豬糞中總厭氧菌表現(xiàn)出劑量依賴性降低,且大蒜油能通過抑制羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的活性直接抑制產(chǎn)甲烷菌的生長和活性[36]。因此,猜測本試驗(yàn)中大蒜素可能直接影響了產(chǎn)甲烷菌。當(dāng)CH4產(chǎn)量減少時,H2濃度通常會增加。同型產(chǎn)乙酸菌能夠利用H2和CO2產(chǎn)生乙酸,這在一些非反芻動物消化生態(tài)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)對發(fā)酵H2的再利用具有重要作用[44]。且李耀宇[45]已報道,同型產(chǎn)乙酸菌在豬糞厭氧發(fā)酵中能通過消耗H2降低氫分壓,這或許能夠解釋本試驗(yàn)中200 mg/L大蒜素在降低累積CH4產(chǎn)量的同時顯著提高了乙酸濃度。氫分壓會因產(chǎn)CH4被抑制而升高,從而導(dǎo)致丁酸的利用和利用丁酸細(xì)菌的生長都會受到抑制[46]。本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度大蒜素在降低累積CH4產(chǎn)量的同時顯著提高了丁酸濃度,這也支持了Patra等[47]的研究結(jié)果。本研究中,200、400 mg/L大蒜素均在抑制CH4生成的同時降低了乙酸/丙酸值,且丙酸濃度顯著提高,而丙酸的生成是H2的有效競爭途徑[48],這似乎表明伴隨CH4產(chǎn)量減少而來的可能是更多的H2轉(zhuǎn)移到了丙酸代謝途徑,這也是大多數(shù)研究中抗產(chǎn)CH4化合物的一個普遍特征[49]。

因此,綜合評估來看,大蒜素抑制CH4的效果最佳,盡管800 mg/L大蒜素對總SCFA濃度的負(fù)面影響不容忽視,但200和400 mg/L大蒜素能夠在體外抑制CH4產(chǎn)生的同時促進(jìn)SCFA的生成。根據(jù)國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)及《省級溫室氣體清單編制指南(試行)》[50],我國生豬腸道發(fā)酵CH4排放因子為1 kg/(頭·年),根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果估測,200和400 mg/L大蒜素分別能夠減少0.573和0.860 kg/(頭·年)的豬CH4排放量,從而減少約4 356.028和6 537.102 kcal/(頭·年)(1 kcal≈4.186 kJ)的能量損耗;按照2022年我國生豬存欄量估測,200和400 mg/L大蒜素分別能夠減少4.011×1014和6.02×1014g的CH4排放,從而減少約3.048×1015和4.575×1015kcal的能量損耗。同時,筆者推測適宜濃度大蒜素可能是通過幾種相互關(guān)聯(lián)的機(jī)制減少CH4產(chǎn)量:1)直接抑制產(chǎn)甲烷菌的生長和活性;2)誘導(dǎo)發(fā)酵模式向丙酸化方向轉(zhuǎn)變,與產(chǎn)甲烷菌競爭系統(tǒng)中的游離H2;3)促進(jìn)能夠利用H2合成乙酸的同型產(chǎn)乙酸菌的生長,作為系統(tǒng)中游離H2的另一個替代匯。

不過,筆者認(rèn)為本研究仍存在以下局限性:1)本試驗(yàn)使用糞便微生物替代遠(yuǎn)端結(jié)腸微生物區(qū)系,且假設(shè)樣品只在結(jié)腸后端被消化,因此這可能無法準(zhǔn)確反映發(fā)生在結(jié)腸的發(fā)酵過程;2)糞便微生物在體外的濃度低于體內(nèi),為增加添加劑與糞菌相互作用的可能性,體外研究所使用的濃度可能比體內(nèi)實(shí)際可行濃度大;3)由于本試驗(yàn)缺乏各處理的微生物區(qū)系特征,無法通過評價各處理間是否存在微生物區(qū)系差異來進(jìn)一步解釋所評估的植物提取物的作用機(jī)制。目前關(guān)于豬的CH4緩解策略的信息有限,暫無任何關(guān)于豬的公開數(shù)據(jù)能夠驗(yàn)證本研究結(jié)果。因此,后續(xù)可以考慮通過參考體外發(fā)酵結(jié)果與實(shí)際生產(chǎn)效益,選擇適宜的濃度和條件進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn),并結(jié)合宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)等方法了解植物提取物影響生長肥育豬結(jié)腸微生物組與CH4生成的途徑,確定其是否有望作為調(diào)節(jié)劑來改善結(jié)腸發(fā)酵特性和生產(chǎn)力,同樣這也可能會進(jìn)一步支持本研究目前的推測。

4 結(jié) 論

① 本研究所用的牛至油、肉桂油及大蒜素3種植物提取物均可作為潛在的生長肥育豬腸道CH4抑制劑,其中800 mg/L濃度的抑制效果最佳。

② 3種植物提取物在200 mg/L濃度下均能提高體外發(fā)酵乙酸和總SCFA濃度,而在800 mg/L濃度下均顯著降低了乙酸、濃度和總SCFA濃度。

③ 在200 mg/L濃度處理下,3種植物提取物中大蒜素的抑制CH4效果最好,且同時能夠提高乙酸、丙酸、丁酸和總SCFA濃度。從經(jīng)濟(jì)成本和處理效果評價,200 mg/L大蒜素的綜合效益最佳。