張 巖 歐念濤 劉孟哲 李艷玲

(北京農(nóng)學院動物科學技術學院,北京 102206)

在畜牧生產(chǎn)中,冷熱刺激、環(huán)境污染、機體炎癥反應和營養(yǎng)代謝異常等均可誘發(fā)畜禽產(chǎn)生氧化應激。氧化應激是由過量活性氧(reactive oxygen species,ROS)所導致的機體氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡引起的,可通過破壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及DNA等生物分子的結構和功能,干擾轉錄因子表達和氧化還原敏感信號通路,導致細胞氧化損傷甚至死亡[1-2]。氧化應激會誘導機體氧化損傷,發(fā)生炎癥反應,導致畜禽免疫力下降、飼料轉化率降低,進而影響經(jīng)濟效益[3]。在畜禽飼糧中添加抗氧化劑不僅是預防飼料成分自氧化的有效方法,也是一種緩解機體氧化損傷的策略?？紤]到畜牧生產(chǎn)中使用合成抗氧化劑的安全性等因素,尋找綠色的天然抗氧化劑尤為重要。天然植物提取物不僅有利于調(diào)節(jié)機體代謝,還具有良好的抗氧化活性[4-6]。其中,植物精油(essential oils,EOs)是通過水蒸餾等方法從植物組織(花、葉和果實等)中提取的次生代謝產(chǎn)物,具有抗菌、抗炎、抗氧化等多種生物活性[7]。尤其是EOs對ROS或炎癥所引起的疾病可能具有良好的預防和治療效果[8]。EOs在畜禽生產(chǎn)中具有巨大的應用潛力。因此,本文綜述了EOs的抗氧化作用及其在畜禽生產(chǎn)中的應用,為EOs在畜禽生產(chǎn)中作為合成抗氧化劑的替代物提供理論參考。

1 EOs的抗氧化活性

1.1 EOs發(fā)揮抗氧化活性的主要成分

1.2 EOs抗氧化活性的評價方法

1.2.1 體外化學評價法

體外化學評價法可通過檢測EOs的自由基清除能力、還原力以及抑制脂質(zhì)過氧化水平等方式快速評估其抗氧化活性。

在體外測定EOs清除ROS自由基能力時通常采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical,DPPH)自由基清除試驗、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]清除試驗、β-胡蘿卜素漂白(beta-carotene bleaching,BCB)試驗、氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)測定試驗、自由基捕獲抗氧化參數(shù)(radical-trapping antioxidant parameter,TRAP)測定試驗等方法。

EOs的還原力可作為評價其潛在抗氧化活性的重要指標,還原力越強抗氧化活性越高[14]。EOs的還原力是通過測定鐵還原抗氧化能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)和總酚含量(total phenolic content,TPC)的方法進行評估。其中,福林酚法是一種衡量天然產(chǎn)物中總酚類化合物含量的方法。研究發(fā)現(xiàn),歐防風草精油雖TPC較低,但具有較高的抗氧化活性[15],因此僅依靠該方法并不能準確評估EOs的抗氧化能力。

此外,EOs的體外抑制脂質(zhì)過氧化測定通常采用硫代巴比妥酸反應物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)和抑制脂蛋白脂質(zhì)過氧化活性(inhibition ability of lipoprotein lipid peroxidation,ILLP)的方法。Wu等[10]研究表明,10～1 000 μg/mL的薄荷精油處理豬肝臟組織勻漿以劑量依賴的方式降低了組織中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,緩解了脂質(zhì)過氧化損傷。另有研究顯示,黑胡椒精油的ILLP顯著高于維生素C,具有良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用[16]。

1.2.2 細胞模型評價法

在細胞模型評價法中通常采用細胞抗氧化活性(cellular antioxidant activity,CAA)和細胞內(nèi)抗氧化活性(intracellular antioxidant activity,IAA)的測定方法。

采用CAA方法測量熒光強度可直接反映細胞內(nèi)ROS含量,熒光強度越低則表明EOs清除ROS能力越強;也可通過積分熒光隨時間的曲線下面積(area under curve,AUC)計算EOs的CAA,CAA越高表明EOs清除ROS能力越強。Wang等[16]研究指出,0.1 μL/mL黑胡椒精油的相對熒光強度顯著低于白胡椒精油,CAA高于白胡椒精油,兩者均具有清除HeLa細胞內(nèi)ROS的活性。

采用IAA方法測定時,可檢測細胞內(nèi)谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量。GSH作為電子供體直接清除自由基或為谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和谷胱甘肽硫轉移酶(glutathione S-transferase,GST)提供底物,其含量增加表明EOs的抗氧化能力增強。研究發(fā)現(xiàn),綠薄荷精油在25 μg/mL的濃度下可顯著增加H2O2處理的豬小腸上皮細胞(IPEC-J2細胞)中GSH含量,增強了細胞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的功能[10]。在細胞氧化應激狀態(tài)下使用GSH檢測試劑盒分析細胞裂解液中總GSH和谷胱甘肽二硫化物的含量并計算兩者的比值,在GSH被氧化為谷胱甘肽二硫化物過程中,可猝滅與脂質(zhì)過氧化氫(lipid hydroperoxide,LOOH)和H2O2相關的細胞內(nèi)ROS。

1.2.3 動物模型評價法

近年來,國內(nèi)外研究學者在動物水平建立氧化損傷模型來評估EOs的抗氧化活性。一般使用氧化應激誘導劑處理秀麗隱桿線蟲等低等生物,檢測EOs緩解急性系統(tǒng)性氧化損傷的有效性[10];小鼠、大鼠等氧化損傷模型可通過檢測血液和組織勻漿中的ROS、MDA含量和抗氧化酶活性來評價EOs的體內(nèi)抗氧化活性。Ahmed等[17]研究表明,250 mg/kg的百里香精油灌胃大鼠可以通過緩解肝臟脂質(zhì)過氧化、增加GSH含量、提高GST和GSH-Px活性等,改善機體抗氧化能力。

綜上所述,雖然體外化學方法在評價EOs抗氧化活性具有快速、簡單、廉價、方便的特點,但不能真實模擬動物內(nèi)部的生理環(huán)境,也不能準確反映抗氧化物質(zhì)在體內(nèi)的抗氧化能力。與體外化學方法相比,細胞模型評價法可分析EOs在細胞內(nèi)吸收、分布和代謝情況,更準確地預測EOs在動物體內(nèi)的抗氧化活性。相比于體外化學方法和細胞模型評價法,動物模型評價法可直接反映EOs在動物復雜的內(nèi)部生理環(huán)境下的抗氧化能力。

2 EOs的抗氧化作用機制

2.1 基于氫原子轉移(hydrogen atom transfer,HAT)和電子轉移(electron transfer,ET)清除自由基

ROS自由基的化學本質(zhì)是含有不成對電子(自由電子)的一種化學實體,Barzegar[18]研究表明,HAT和ET均參與了自由基的清除,如姜黃素異構體的2個酚羥基在HAT和ET中清除ROS發(fā)揮重要作用。在DPPH和ABTS自由基清除試驗中,DPPH或ABTS自由基含有單電子,EOs的活性成分通過ET猝滅DPPH或ABTS自由基產(chǎn)生光學差異,從而初步評估EOs的抗氧化能力;BCB試驗、ORAC測定試驗、TRAP測定試驗的原理是EOs作為氫原子供體,發(fā)生HAT[19]。Simirgiotis等[14]研究發(fā)現(xiàn),牛至精油的高DPPH和ABTS自由基清除能力與其主要成分香芹酚和百里香酚的含量有關;相反,阿米芹精油對DPPH自由基清除能力較低的原因則可能是酚類化合物含量較低[20]。Ahmed等[21]研究指出,羅勒精油的DPPH自由基清除能力與萜烯類化合物發(fā)揮抗氧化活性有關。肉桂精油對β-胡蘿卜素變色有較高的抑制作用,能夠清除及中和導致β-胡蘿卜素變色的亞油酸自由基[22]。綜上所述,EOs中的酚類以及萜烯類化合物等其他次生代謝產(chǎn)物可通過HAT或ET,使ROS自由基形成相對穩(wěn)定的物質(zhì),從而發(fā)揮自由基清除的作用。

2.2 促進金屬離子配位飽和

二價鐵離子(Fe2+)和亞銅離子(Cu+)等過渡金屬離子同樣具有自由電子,在生物系統(tǒng)中Fe2+和Cu+等過渡金屬離子會發(fā)生芬頓(Fenton)反應,即Fe2+和Cu+會被H2O2快速氧化后產(chǎn)生·OH。此外,當細胞內(nèi)Fe2+過度積累時可以與細胞膜上高表達的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應,誘發(fā)細胞死亡即鐵死亡[23]。細胞內(nèi)高含量的銅離子(Cu2+)還可以通過顯著降低GSH含量誘導機體產(chǎn)生氧化應激[24]。因此,如Fe2+、Cu+、Cu2+等過渡金屬離子可破壞細胞結構和功能,造成氧化損傷,使用有效的螯合劑能促進金屬離子配位飽和,降低ROS含量,保護細胞免受氧化損傷。

在化合物結構中含有2個或2個以上官能團(如C-OH、C=O、-OCH3等)可表現(xiàn)出顯著的金屬螯合活性,如姜黃素通過-OH和-OCH3螯合Fe2+,山奈酚可通過C=O螯合Cu2+和Fe2+,迷迭香酸在二酚芳香族基團上螯合了2個Fe2+[25]。EOs含有酚-OH與Fe2+、Cu2+發(fā)生螯合,使其生成相對穩(wěn)定的配合物[26]。因此,EOs的生物活性成分能有效結合Cu2+和Fe2+等金屬離子,使其生成相對穩(wěn)定的物質(zhì),從而保護機體免受金屬離子所誘導的氧化損傷。

2.3 作為供氫體抑制脂質(zhì)過氧化

過量ROS引起的脂質(zhì)過氧化鏈式反應損傷細胞結構和功能,一方面由于細胞膜上含有大量的不飽和脂肪酸具有活性雙鍵而容易受到ROS氧化,導致細胞結構破壞;另一方面在鏈式反應過程中形成大量碳氫化合物、醇類及醛類中間產(chǎn)物。其中MDA具有細胞毒性,能異常修飾胞內(nèi)磷脂、蛋白質(zhì)及核酸生物分子的構象,損害細胞功能。MDA修飾的大多數(shù)蛋白質(zhì)是線粒體蛋白,這可能是由于線粒體是ROS的主要來源之一[27]。MDA代表了在高氧化應激期間產(chǎn)生的一類與氧化損傷相關的分子模式,故常作為脂質(zhì)過氧化的生物標志物,評估MDA含量可反映其發(fā)生脂質(zhì)過氧化程度。Ding等[28]研究表明,在亞臨床大腸桿菌攻毒期間,添加400 mg/kg的茴香油可以上調(diào)體內(nèi)核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)信號通路,降低MDA含量,提高機體抗氧化能力。在鏈式反應過程中脂質(zhì)過氧自由基(peroxyl radical,LOO·)是主要的不穩(wěn)定氧化產(chǎn)物,從另一種脂質(zhì)中提取氫分子后又生成LOOH,而EOs可作為LOO·的供氫體從而阻斷鏈式反應,減少脂質(zhì)自由基(lipid radical,L·)和非自由基性脂類分解產(chǎn)物(non-radical products,NRP)的產(chǎn)生,從而保護脂質(zhì)不被過氧化(圖1)。

ROS:活性氧 reactive oxygen species;EOs:植物精油 essential oils。圖1 EOs抑制自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化鏈式反應Fig.1 EOs inhibit free radicals induced lipid peroxidation chain reactions

2.4 調(diào)節(jié)轉錄因子表達和信號通路

細胞內(nèi)的ROS是有氧代謝過程的產(chǎn)物,廣泛存在于生物體內(nèi)[29]。ROS作為一類信號小分子可通過氧化修飾、磷酸化修飾等使Nrf2、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)等轉錄因子活性改變,影響細胞信號通路,破壞細胞抗氧化系統(tǒng)功能,使之產(chǎn)生炎性反應甚至凋亡。Nrf2是一種對氧化應激高度敏感的轉錄因子,通常在細胞質(zhì)中與Kelch樣ECH關聯(lián)蛋白1(Kelch like ECH associated protein 1,Keap1)結合,控制Nrf2的泛素化和降解;氧化應激狀態(tài)下,Keap1和Nrf2解離并激活Nrf2,使其在細胞質(zhì)中積累。激活的Nrf2發(fā)生易位進入到細胞核中與染色質(zhì)上的多種抗氧化基因上游啟動子區(qū)域抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)結合,可激活通路下游多種抗氧化應激相關基因,如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、GSH-Px等,減少細胞的氧化損傷(圖2)。

Keap1:Kelch樣ECH關聯(lián)蛋白1 Kelch like ECH associated protein 1;Nrf2:核因子E2相關因子2 nuclear factor erythroid-2 related factor 2;E3:E3泛素連接酶 E3 ubiquitin-ligase enzymes;Cul3:泛素連接酶cullin3 ubiquitin-ligase enzymes cullin 3;RBX1:E3泛素連接酶亞基1 E3 ubiquitin-ligase enzymes subunit 1;PI3K:磷脂酰肌醇-3-激酶 phosphatidylinositol-3-kinase;Akt:蛋白激酶B protein kinase B;ROS:活性氧 reactive oxygen species;Maf:小肌肉筋膜纖維肉瘤 musculoaponeurotic fibrosarcoma;ARE:抗氧化反應元件 antioxidant response element;BVR:膽綠素還原酶 biliverdin reductase;SOD:超氧化物歧化酶 superoxide dismutase;CAT:過氧化氫酶 catalase;GSH-Px:谷胱甘肽過氧化物酶 glutathione peroxidase;HO-1:血紅素氧合酶-1 heme oxygenase-1;NADPH:還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;NADP+:煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;CO:一氧化碳 carbon monoxide;Fe2+:二價鐵離子 ferrous iron;Ub:泛素化 ubiquitination;P:磷酸化 phosphorylation。圖2 Nrf2-Keap1-ARE信號通路Fig.2 Nrf2-Keap1-ARE signaling pathway

EOs可以激活Nrf2-ARE信號通路,促進Nrf2的核內(nèi)移,增強細胞的抗氧化能力。Zou等[30]研究表明,2.5～10.0 μg/mL的牛至精油以劑量依賴的方式增強IPEC-J2細胞中Nrf2的mRNA表達水平,并激活ARE,提高SOD活性和GSH含量,而敲除Nrf2基因后,抗氧化酶mRNA表達水平降低;100或200 mg/kg的香葉醇預處理可顯著降低Keap1 mRNA和蛋白表達水平,促進Keap1和Nrf2解離,增加Nrf2的核積累以及HO-1的 mRNA表達水平和蛋白質(zhì)含量,并緩解大鼠心肌組織的氧化應激[31]。此外,EOs可促進Nrf2易位至細胞核內(nèi)與NF-κB競爭性結合CREB結合蛋白(CREB-binding protein,CBP),發(fā)揮抗氧化作用、抗炎作用以及抑制細胞凋亡作用。Younis等[32]研究發(fā)現(xiàn),50和100 mg/kg的沒藥精油預處理可增加大鼠心臟組織中Nrf2、HO-1的mRNA表達水平,提高GSH含量和SOD、CAT活性,通過降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、NF-κB、p65亞基、白細胞介素-6(IL-6)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)和半胱氨酸蛋白酶9(Caspase9)的mRNA表達水平來抑制細胞凋亡。200 mg/kg的香葉醇能有效提高大鼠腎臟中Nrf2和HO-1的mRNA表達水平,降低Keap1的mRNA表達水平,提高GSH含量及SOD、CAT和GSH-Px活性,降低MDA含量,下調(diào)NF-κB的mRNA表達水平,降低TNF-α、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和白細胞介素-10(IL-10)含量,負調(diào)節(jié)凋亡介質(zhì)B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白(B-cell lymphoma/leukaemia-2-associated X protein,Bax)、Caspase 3和Caspase 9,并上調(diào)抗凋亡因子B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukaemia-2,Bcl-2),同時升高血清白蛋白含量[33]。綜上所述,EOs發(fā)揮調(diào)節(jié)轉錄因子的表達和信號通路作用見圖3,EOs可通過激活Nrf2-ARE信號通路,提高抗氧化酶的表達,增強細胞的抗氧化能力;此外,EOs抑制NF-κB通路激活,降低細胞內(nèi)促炎因子的表達,減輕細胞炎癥反應。同時,EOs可上調(diào)抗凋亡蛋白的表達,下調(diào)促凋亡蛋白的表達,從而提高抵抗氧化損傷而導致細胞凋亡的能力。

3 EOs在畜禽生產(chǎn)中的應用

3.1 在豬生產(chǎn)中的應用

在斷奶仔豬飼糧中添加EOs可提高體內(nèi)抗氧化酶活性,改善腸道組織形態(tài)、黏膜抗氧化活性,緩解仔豬斷奶應激產(chǎn)生的氧化損傷。飼糧中添加200 mg/kg的混合精油(13.5%百里香酚和4.5%肉桂醛)可提高斷奶仔豬十二指腸和回腸黏膜的GSH含量、空腸黏膜的SOD活性以及肝臟中GST和Nrf2的mRNA表達水平,并降低空腸黏膜的MDA含量[34]。Zhang等[35]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加100 mg/kg茶樹油可提高斷奶仔豬血清SOD活性,降低血清MDA含量,提高抗氧化能力。母豬在妊娠晚期和泌乳早期階段氧化應激顯著增加,以2.0～3.0 kg/d的劑量飼喂每千克飼糧中混合15 mg牛至精油的飼糧,可降低母豬血清中TBARS含量,并有提高GSH-Px活性、降低ROS含量的趨勢,緩解氧化應激[36]。此外,在育肥豬的低蛋白質(zhì)、氨基酸飼糧中長期添加250 mg/kg牛至精油,提高了血清中SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性,降低了TBARS含量,通過改善其抗氧化防御系統(tǒng)來保護豬免受氧化應激[37],還可增強肌肉組織中CAT活性,提高其抗氧化能力[38]。綜上所述,在斷奶仔豬、母豬以及育肥豬的飼糧中添加EOs可提高機體的抗氧化能力,緩解氧化損傷。

3.2 在家禽生產(chǎn)中的應用

在肉雞飼糧中添加EOs可提高血清中抗氧化酶活性,降低MDA含量。研究指出,飼糧中添加200～600 mg/kg薰衣草精油提高了肉雞血清CAT活性[39];飼糧中添加0～1 g/kg的桉樹精油可提高肉雞血清SOD活性[40]。Elbaz等[41]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加200 mg/kg大蒜精油和檸檬精油混合物可提高肉仔雞血清GSH-Px活性,降低MDA含量,減輕熱應激所帶來的氧化損傷。此外,在肉雞飼糧中添加EOs還可緩解腸道氧化應激。如飼糧中添加150～300 mg/kg牛至精油可提高肉雞空腸和回腸黏膜的總抗氧化能力,減輕腸道局部氧化應激[42]。Zhang等[43]的研究同樣發(fā)現(xiàn),飼糧中添加200 mg/kg牛至精油可降低肉雞血清和空腸MDA含量,提高腸道抗氧化能力。飼糧中添加300 mg/kg迷迭香精油或肉桂精油可提高蛋雞血清SOD活性[44];飼糧中添加100～150 mg/kg大蒜精油降低蛋雞血清MDA含量[45];飼糧中添加200～600 mg/kg八角茴香油以劑量依賴性方式增強蛋雞肝臟總抗氧化能力和GSH-Px活性,減少MDA含量,提高蛋雞整體抗氧化能力[46]。此外,飼糧中添加150 mg/kg牛至精油可減少蛋雞蛋黃中脂質(zhì)過氧化物含量[47]。綜上所述,EOs可通過增強體內(nèi)抗氧化酶活性、降低MDA含量來提高家禽機體的抗氧化能力。

3.3 在反芻動物生產(chǎn)中的應用

EOs不僅在調(diào)節(jié)反芻動物瘤胃發(fā)酵、減少甲烷產(chǎn)量等方面發(fā)揮作用,在提高反芻動物抗氧化能力上也具有很大潛力。在羔羊的飼糧中添加0.5～1.5 g/kg的牛至精油可以顯著提高血清中總抗氧化能力以及SOD活性,顯著降低MDA含量[48]。在哺乳期母羊的飼糧中添加150～450 mg/kg牛至精油,不僅提高了血清中GSH-Px、SOD活性,還增加了奶中CAT活性[49]。Jeshari等[50]研究發(fā)現(xiàn),在犢牛發(fā)酵飼料中添加300 mg/kg迷迭香、設拉子百里香、唇萼薄荷的混合精油可降低血清MDA含量。飼糧中添加100～300 mg/d混合精油(百里香、薰衣草、丹參和棘荸薺精油)可線性提高荷斯坦犢牛的總抗氧化能力[51]。此外,在飼糧中添加EOs后,活性成分可進入到肌肉組織細胞內(nèi),提高肌肉組織的抗氧化能力,緩解肌肉的脂質(zhì)過氧化。Rivaroli等[52]研究發(fā)現(xiàn),在安格斯和內(nèi)洛爾雜交公犢牛的飼糧中添加3.5 g/d的牛至油、大蒜精油、檸檬油、迷迭香精油、百里香精油、桉樹油和甜橙油混合物,可在不影響牛肉化學組成和脂肪酸分布的基礎上減少脂質(zhì)氧化。綜上所述,EOs作為反芻動物的飼料添加劑,可提高反芻動物機體的總抗氧化能力,降低MDA含量,并可緩解肌肉組織的脂質(zhì)過氧化。

4 小 結

EOs依賴其活性成分發(fā)揮抗氧化作用,并可采取體外化學評價法、細胞模型評價法和動物模型評價法評估抗氧化活性的高低。EOs通過HAT和ET清除自由基、結合金屬離子使其配位飽和、作為供氫體抑制脂質(zhì)過氧化以及調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)等途徑改善畜禽機體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)功能,提高機體抗氧化能力,減輕氧化損傷。越來越多的研究證實EOs具有顯著的抗氧化活性,是替代合成抗氧化劑的天然來源之一,在畜禽生產(chǎn)中具有廣闊的應用前景。未來需要深入探討EOs在畜禽的飼糧中有效添加劑量、活性成分在畜禽體內(nèi)的代謝途徑等,從而發(fā)揮其最佳的應用效果。