鄧雍 馬濤 張寧

膿毒癥是宿主對感染的反應(yīng)失調(diào),可產(chǎn)生危及生命的器官功能損壞?；颊咭坏┌l(fā)生免疫系統(tǒng)紊亂,可造成嚴(yán)重的炎癥級聯(lián)反應(yīng),使機體多處器官功能損傷,尤其是最脆弱的肺臟器官[1-2]。急性肺損傷(ALI)由膿毒癥引起,病死率高達(dá)50%～70%,其發(fā)病機制主要是患者機體釋放大量炎癥因子,導(dǎo)致血流比例失調(diào)、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、肺水腫等病理現(xiàn)象[3-4],故預(yù)防膿毒癥引發(fā)的ALI需要抑制機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生。微小RNA(miR)通過靶向調(diào)控基因的3’-UTR參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、增殖、發(fā)育及凋亡等過程,在基因水平上影響疾病的發(fā)生和發(fā)展,如miR-128-3p[5]。TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-451a與巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)存在結(jié)合位點。miR-451a在膿毒癥患者中表達(dá)失調(diào),血清miR-451a可作為膿毒癥候選診斷生物標(biāo)志物和辨別疾病嚴(yán)重程度的潛在參數(shù)[6]。但目前尚無miR-451a在尿毒癥肺損傷中的功能研究。MIF是目前新發(fā)現(xiàn)的重要炎癥介質(zhì),通過調(diào)節(jié)腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)參與多種疾病的發(fā)病機制[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示,MIF是黃連解毒湯抗膿毒癥的靶蛋白之一,且抑制MIF表達(dá)可減輕膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷[8]。但對于miR-451a靶向MIF對膿毒癥引起的肺損傷卻鮮有報道。本研究通過建立膿毒癥大鼠模型,探討miR-451a通過MIF/AMPK信號通路對膿毒癥大鼠肺損傷的影響,為miR-451a作為膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷的臨床治療靶點提供一定的參考依據(jù)。

材料與方法

1.材料:斯貝福生物技術(shù)有限公司提供SD大鼠50只(清潔級、雄性、7周齡、體質(zhì)量210～230 g),許可證號:SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)房環(huán)境:溫度22～25 ℃、濕度50%～55%。飼養(yǎng)期間按時消毒,清潔。本研究經(jīng)榆林市第一醫(yī)院實驗動物倫理委員會審核批準(zhǔn)(IACUC1900741)。293T細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司;戊巴比妥鈉購自Sigma-Aldrich;IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒購自上海紀(jì)寧實業(yè)生物科技有限公司;MIF一抗購自abcam公司;AMPK一抗購自abcam公司;p-AMPK一抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;MIF抑制劑ISO-1、miR-451a激動劑(miR-451a agomir)、miR-451a激動劑陰性對照(agomir-NC)、miR-451a模擬物(miR-451a mimics)和miR-451a模擬物陰性對照(mimics-NC)均購自杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;野生型MIF 3’UTR(WT-MIF)、突變型MIF 3’UTR(MUT-MIF)、miR-451a、MIF、U6和β-actin引物序列均購自上海生工生物工程股份有限公司;雙熒光素酶實驗試劑盒購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;TUNEL試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。多功能酶標(biāo)儀購自青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司;凝膠成像儀購自賽默飛世爾科技有限公司;熒光顯微鏡購自上海軼舜國際貿(mào)易有限公司。

2.方法

(1)膿毒癥模型制備:參照文獻(xiàn)[9]的方法制備膿毒癥大鼠模型:采用隨機數(shù)表法選取40只大鼠為造模組,其余10只大鼠為假手術(shù)組。戊巴比妥鈉麻醉,采用仰臥位固定大鼠,剖開腹部,暴露盲腸,將糞便擠向盲腸一側(cè),結(jié)扎盲腸盲端3/4處,避開血管,在盲腸末端與結(jié)扎部位中間對穿,排出多余糞便。假手術(shù)組大鼠僅開腹暴露盲腸,不行結(jié)扎和穿孔。大鼠術(shù)后6～12 h出現(xiàn)高熱、動作遲緩、呼吸急促等癥狀,表明建模成功[10]。所有大鼠均符合上述癥狀且無死亡。

(2)實時熒光定量(qRT)-PCR:大鼠造模成功24 h后經(jīng)靜脈取血,血清中加入蛋白提取液后離心10 min,吸取上清液得血清蛋白。TRIzolTM試劑提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用qRT-PCR法檢測miR-451a和MIF mRNA表達(dá)水平。取適量右肺下葉組織,剪碎后加入組織蛋白提取液,勻漿后離心,取上清液。用TRIzolTM試劑提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA;行PCR擴增,檢測miR-451a、MIF mRNA表達(dá)水平。

(3)分組及干預(yù):將造模組的40只大鼠采用隨機數(shù)表法分為模型組、miR-451a agomir組、agomir-NC組和ISO-1組,每組各10只。miR-451a agomir組、agomir-NC組、ISO-1組分別由尾靜脈注射2 mg/kg miR-451a agomir、2 mg/kg agomir-NC、1 mg/kg ISO-1(DMSO溶解)干預(yù)[11-12],假手術(shù)組、模型組大鼠均注射等體積生理鹽水,每4 h注射1次,連續(xù)干預(yù)48 h。

(4)HE染色觀察肺損傷:大鼠麻醉后剝離右肺中葉組織,制備5 μm石蠟切片。切片用蘇木精、伊紅各染色1 min。在顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

(5)TUNEL染色觀察肺組織細(xì)胞凋亡情況:取適量右肺上葉組織,制作冰凍切片。按照TUNEL試劑盒說明書處理。熒光顯微鏡下觀察并用Image軟件定量陽性細(xì)胞數(shù)。

(6)ELISA:取各組大鼠的靜脈血,離心后使用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-6水平。

(7)Western blot:取凍存右肺下葉組織,加入裂解液,測定蛋白水平。用SDS-PAGE分離蛋白后轉(zhuǎn)膜、封閉,與MIF、AMPK、p-AMPK、β-actin(1∶1 000)一抗于4 ℃孵育過夜,加入二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。顯影、成像后分析各蛋白表達(dá)水平。

(8)雙熒光素酶實驗驗證miR-451a與MIF關(guān)系:www.targetscan.org預(yù)測到miR-451a、MIF存在結(jié)合位點。將293T細(xì)胞接種至96孔板中,常規(guī)培養(yǎng),分別將突變型或野生型MIF 3’UTR與miR-451a mimics、mimics-NC轉(zhuǎn)染(miR-451a mimics+MIF WT組、mimics-NC+MIF WT組、miR-451a mimics+MIF MUT組及mimics-NC+MIF MUT組),48 h后測定熒光素酶活性。

結(jié) 果

1.造模組和假手術(shù)組大鼠血清中miR-451a、MIF mRNA表達(dá)水平比較:與假手術(shù)組相比,造模組大鼠血清中miR-451a表達(dá)水平[(0.31±0.03)比(0.94±0.09),t=21.689]降低,MIF mRNA表達(dá)水平[(0.89±0.09)比(0.34±0.03),t=32.796]升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5組大鼠肺組織病理變化:鏡下觀察到假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)無損傷現(xiàn)象;模型組、agomir-NC組大鼠肺組織出現(xiàn)炎性浸潤,伴隨水腫、出血現(xiàn)象;與agomir-NC組相比,miR-451a agomir組大鼠肺組織炎性浸潤、水腫、出血等病理現(xiàn)象均得到緩解;miR-451a agomir組與ISO-1組大鼠肺組織病理現(xiàn)象、炎性浸潤、水腫情況等比較差異不明顯。見圖1。

圖1 5組大鼠肺組織病理變化(A:假手術(shù)組;B:模型組;C:agomir-NC組;D:miR-451a agomir組;E:ISO-1組;HE染色,×200)

3.5組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況及血清炎癥因子水平比較:鏡下觀察到凋亡的細(xì)胞被染成棕褐色,模型組和agomir-NC組棕褐色的細(xì)胞數(shù)高于假手術(shù)組,miR-451a agomir組及ISO-1組棕褐色的細(xì)胞數(shù)低于模型組和agomir-NC組。見圖2。5組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率及TNF-α、IL-6水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組、agomir-NC組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率及TNF-α、IL-6水平均高于假手術(shù)組、miR-451a agomir組及ISO-1組(P<0.05)。其余各組間凋亡率及TNF-α、IL-6水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 5組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率及血清炎癥因子水平比較(n=10)

圖2 5組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況(A:假手術(shù)組;B:模型組;C:agomir-NC組;D:miR-451a agomir組;E:ISO-1組;TUNEL-DAB染色,×400)

4.5組大鼠肺組織p-AMPK/AMPK、miR-451a、MIF mRNA、MIF蛋白表達(dá)水平比較:5組大鼠肺組織p-AMPK/AMPK、miR-451a、MIF mRNA、MIF蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組、agomir-NC組大鼠肺組織p-AMPK/AMPK、miR-451a蛋白表達(dá)水平均低于假手術(shù)組miR-451a、agomir組及ISO-1組,MIF及MIF mRNA蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組、miR-451a agomir組及ISO-1組(P<0.05)。其余各組間p-AMPK/AMPK、miR-451a、MIF及MIF mRNA蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 5組大鼠肺組織p-AMPK/AMPK、miR-451a、MIF mRNA、MIF蛋白表達(dá)水平比較(n=10)

5.各組細(xì)胞相對熒光素酶活性比較:4組細(xì)胞相對熒光素酶活性比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=57.566,P<0.05)。miR-451a mimics+MIF WT組(0.55±0.05)熒光素酶活性低于mimics-NC+MIF WT組(1.00±0.00,P<0.05)。mimics-NC+MIF WT組與miR-451a mimics+MIF MUT組(1.13±0.12)和mimics-NC+MIF MUT組(1.07±0.11)熒光素酶活性比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

討 論

研究發(fā)現(xiàn),miR-451a與許多疾病的發(fā)展有關(guān),尤其是肺部疾病[13]。在膿毒癥患者血液樣本中,miR-451a表達(dá)水平上調(diào),可能與膿毒癥引起的敗血癥及肺損傷密切相關(guān)。但miR-451a在膿毒癥引起的肺損傷研究中的作用鮮有報道。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血清中miR-451a表達(dá)水平顯著下降,與上述研究一致,提示miR-451a低表達(dá)可能與膿毒癥并發(fā)肺損傷密切相關(guān),但具體如何調(diào)控靶細(xì)胞及其下游基因還有待進一步研究。TNF-α作為發(fā)現(xiàn)最早的促炎因子,可引起細(xì)胞因子的級聯(lián)效應(yīng),導(dǎo)致合成釋放誘導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)如IL-6,而炎癥反應(yīng)的過度表達(dá)可導(dǎo)致機體失衡,加重肺組織損傷[14]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠肺組織出現(xiàn)炎性浸潤、出血及水腫現(xiàn)象,TNF-α水平、細(xì)胞凋亡、IL-6水平增加,提示炎癥因子水平的增加使得膿毒癥大鼠表現(xiàn)出肺損傷癥狀。

TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測和相關(guān)研究顯示miR-451與MIF存在結(jié)合位點[15]。Luo等[16]的研究發(fā)現(xiàn)抑制MIF表達(dá)可減輕肺損傷、細(xì)胞因子水平、細(xì)胞外基質(zhì)沉積,MIF的抑制劑未來可能有助于治療肺纖維化疾病。本研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥模型大鼠血清中MIF表達(dá)水平增高,表明MIF可能是防治尿毒癥的潛在靶點。為進一步驗證miR-451a表達(dá)水平與膿毒癥并發(fā)肺損傷的關(guān)系,本研究使用miR-451a agomir干預(yù)該模型大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-451a agomir組大鼠肺組織病理狀況得到緩解,TNF-α水平、細(xì)胞凋亡率、IL-6水平、MIF mRNA蛋白表達(dá)水平均降低,血清及肺組織中miR-451a、p-AMPK/AMPK表達(dá)水平均增加,且miR-451a agomir對模型大鼠的改善作用與MIF抑制劑ISO-1組相比,各項指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果表明上調(diào)miR-451a表達(dá)可改善膿毒癥大鼠病理現(xiàn)象,降低炎性浸潤及細(xì)胞凋亡狀況,可能與靶向抑制MIF有關(guān)。AMPK作為細(xì)胞的“能量感受器”,可調(diào)控機體能量代謝,控制下游基因的凋亡、自噬,與尿毒癥誘導(dǎo)的心、肺等器官損傷關(guān)系密切[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠肺組織中AMPK的磷酸化水平下降,與上述研究一致;而miR-451a agomir和ISO-1干預(yù)可上調(diào)AMPK的磷酸化,提示miR-451a過表達(dá)可通過抑制MIF、激活下游AMPK信號通路改善膿毒癥肺損傷。相關(guān)研究顯示,AMPK通路的激活能夠通過上調(diào)核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1(Nrf2/HO-1)通路抑制氧化應(yīng)激,從而保護膿毒癥引起的細(xì)胞和器官損傷[19]。以上研究結(jié)果說明miR-451a/MIF可能通過多種方式緩解膿毒癥。

綜上,上調(diào)miR-451a表達(dá)可降低炎性浸潤,改善膿毒癥大鼠病理現(xiàn)象,可能與靶向抑制MIF、激活下游AMPK信號通路,進而降低細(xì)胞凋亡狀況有關(guān)。本研究的不足之處在與未設(shè)置回復(fù)實驗來證實miR-451a對MIF的抑制作用,這也是我們未來研究的重點。