儲(chǔ)芳馨, 陳寒青

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

糖尿病作為一種以高血糖為特征的慢性代謝綜合癥,嚴(yán)重影響患者的身心健康,是全人類共同面對(duì)的巨大威脅[1]。氧化應(yīng)激是糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要因素,長(zhǎng)期的氧化應(yīng)激狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡和胰島素分泌不足,從而無(wú)法正常調(diào)節(jié)血糖[2]。因此,通過(guò)減輕氧化應(yīng)激狀態(tài)下的胰島β細(xì)胞凋亡來(lái)改善糖尿病癥狀可能是一種有效的策略。

植物多糖是植物細(xì)胞代謝產(chǎn)生的聚合度超過(guò)10的聚糖,廣泛存在于植物中,通常具有高活性、低毒性的特點(diǎn)[3]。植物多糖已被證實(shí)具有抗氧化、抗疲勞、抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等多種生理活性,有望在保健食品的研發(fā)領(lǐng)域發(fā)揮巨大優(yōu)勢(shì)[4-6]。

仙人掌果(OpuntiadilleniiHaw.fruit)是仙人掌屬植物的果實(shí),仙人掌果的果肉中含有豐富的微量元素、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、多糖類、黃酮類和果膠等物質(zhì),營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富[7]。從仙人掌果中分離純化的多糖已被證實(shí)具有抗腫瘤、降血壓、降血糖、抗氧化、抑制菌生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)免疫等多種生理活性[8-14]。然而目前對(duì)于仙人掌果多糖(OFPPs)抗胰島β細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制的研究很少。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、分析和驗(yàn)證來(lái)揭示生物活性成分在分子水平上的作用機(jī)理,從整體角度研究活性成分與疾病的關(guān)系,突出活性成分、靶點(diǎn)和疾病相互作用的整體性和系統(tǒng)性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的應(yīng)用廣泛,目前已經(jīng)在藥理學(xué)研究、復(fù)雜性疾病機(jī)制的揭示和藥物的發(fā)現(xiàn)、中醫(yī)藥研究和新藥創(chuàng)制上取得了顯著進(jìn)展。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合,對(duì)于驗(yàn)證活性成分的效果并分析其機(jī)制具有巨大的優(yōu)勢(shì)[15]。

因此,本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)仙人掌果多糖對(duì)胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用機(jī)制,分析凋亡在其中起到的作用,并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,為仙人掌果多糖作為功能性食品應(yīng)用于改善糖尿病癥狀提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3種OFPPs組分由本課題組前期提取分離并進(jìn)行單糖組成分析;大鼠胰島素瘤(INS-1)細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所;3% H2O2溶液、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司;B淋巴細(xì)胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 OFPPs的分離純化

仙人掌鮮果洗凈、脫皮、去籽后,將果肉打漿,在常溫下加入0.1 mol/L NaOH溶液,其與果漿的體積比為4∶1,并攪拌提取3 h,將提取液過(guò)100目篩,3 500 r/min離心10 min獲得上清液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液濃縮至原體積的1/4左右,邊攪拌邊加入無(wú)水乙醇并調(diào)節(jié)最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%,4 ℃靜置過(guò)夜后3 500 r/min離心10 min獲得20%乙醇沉淀的粗多糖組分,然后向上清液中繼續(xù)加入無(wú)水乙醇使其最終體積分?jǐn)?shù)為30%和40%,重復(fù)靜置、離心過(guò)程獲得30%乙醇和40%乙醇沉淀的粗多糖組分。將3種粗多糖組分經(jīng)AB-8大孔吸附樹(shù)脂脫色,再通過(guò)Sevag法脫蛋白、透析、凍干后,得到經(jīng)過(guò)初步純化的仙人掌果3種粗多糖組分,分別命名為F1、F2、F3。

將3種粗多糖組分完全溶解于超純水后,離心獲得上清液,分別通過(guò)DEAE-纖維素-52離子交換色譜柱進(jìn)行純化,依次用蒸餾水和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液梯度洗脫,收集洗脫液中的主要組分,濃縮、透析、凍干,再將其重新溶解和離心,上清液分別通過(guò)Sephacryl S-400 HR葡聚糖凝膠柱進(jìn)一步純化,使用超純水洗脫,收集超純水洗脫的主要多糖組分,濃縮、透析、凍干,得到分離純化的3種均一的仙人掌果多糖組分,分別將其命名為OFPP-1、OFPP-2、OFPP-3。將3種多糖組分分別溶于超純水(質(zhì)量濃度為1 mg/mL)制備成多糖水溶液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

對(duì)分離純化獲得的OFPPs進(jìn)行單糖組成分析,OFPP-1由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖組成,5種單糖摩爾比為2.42∶1.00∶1.08∶0.26∶0.39,分子量為803.7 kDa;OFPP-2和OFPP-3由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖組成,3種單糖的摩爾比分別為11.73∶1.00∶2.35、1.09∶1.00∶0.30,分子量分別為555.1、414.5 kDa。

1.3 OFPPs的“成分靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析

運(yùn)用Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得各單糖組分的簡(jiǎn)化分子線性輸入系統(tǒng)表達(dá)式,并導(dǎo)入到結(jié)構(gòu)相似度預(yù)測(cè)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)SwissTargetPrediction預(yù)測(cè)其有效靶點(diǎn)。根據(jù)生物活性成分,制作“network”和Type文件,并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.9.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析,根據(jù)基因的連接數(shù)量(Degree值)調(diào)整靶點(diǎn)的圖形、顏色、透明度和大小,構(gòu)造“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 氧化應(yīng)激及糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將關(guān)鍵詞“Oxidative Stress”與“Diabetes”輸入GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,出現(xiàn)疾病相關(guān)的基因,下載相關(guān)信息得到疾病對(duì)應(yīng)的Gene Symbol信息,保留“Gene Symbol”“Description”和“Category” 3列數(shù)據(jù)進(jìn)行初步篩選;再將關(guān)鍵詞輸入在線人類孟德?tīng)栠z傳(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行再次檢索和篩選,下載相關(guān)信息,并與初步篩選的基因進(jìn)行歸納,提出重復(fù)基因,合并后即為本文所研究的疾病靶點(diǎn)。

1.5 交集靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)Venny軟件獲取活性成分作用的靶點(diǎn)與疾病的交集靶點(diǎn),作為仙人掌果多糖減輕氧化應(yīng)激、改善糖尿病癥狀的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/h3>

通過(guò)String平臺(tái)導(dǎo)入交集基因,設(shè)置對(duì)象為homo sapiens、取最高置信度0.900,隱藏游離基因節(jié)點(diǎn),得到蛋白互作關(guān)系;結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.2軟件中,選擇“network analyzer”,得到網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù);然后把下載的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用圖,根據(jù)Degree值篩選前十的核心靶點(diǎn)。

1.7 GO和KEGG富集分析

利用生物信息學(xué)開(kāi)源軟件Bioconductor在R軟件內(nèi)安裝運(yùn)行clusterProfiler、Stringin和Pathview程序包,對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程的基因本體(Gene Ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encylopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能富集分析,并通過(guò)微生信平臺(tái)進(jìn)行可視化顯示。GO分析從生物過(guò)程探究針對(duì)疾病的作用靶蛋白在基因功能中的作用;KEGG分析主要為通路分析,目的為闡明活性成分針對(duì)疾病的主要信號(hào)通路。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將傳代后重懸的INS-1細(xì)胞接種到6孔板中培養(yǎng)3 d,分別使用含有12.5、25.0、50.0 μg/mL OFPPs(分別定義為L(zhǎng)、M、H組)與50 μg/mL NAC的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h,棄上清液,添加完全培養(yǎng)基稀釋的500 μmol/L H2O2,在培養(yǎng)箱中孵育1 h。使用Trizol法提取細(xì)胞RNA。使用RNA濃度檢測(cè)儀測(cè)定濃度,并根據(jù)所需體系計(jì)算出反轉(zhuǎn)cDNA需要的上樣量,通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)結(jié)束后各管加入50 μL的無(wú)菌蒸餾水,渦旋混勻得到cDNA溶液。構(gòu)建反應(yīng)體系放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase3的mRNA表達(dá)水平。

1.9 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)的形式表示,組間差異比較采用單因素方差分析。與對(duì)照組相比,#表示P<0.05,##表示P<0.01;與H2O2組相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性成分與作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果

在本課題組前期實(shí)驗(yàn)中,對(duì)OFPPs的單糖組成進(jìn)行了分析,其中的主要活性成分為鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和葡萄糖。根據(jù)SwissTargetPrediction的預(yù)測(cè)結(jié)果,有效靶點(diǎn)為82個(gè),具體如圖1所示。

圖1 仙人掌果多糖活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.2 氧化應(yīng)激及糖尿病潛在靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

通過(guò)關(guān)鍵詞“Oxidative Stress”和“Diabetes”在GeneCards和OMIM篩選疾病Score較高的靶點(diǎn),搜尋到“氧化應(yīng)激”相關(guān)的靶點(diǎn)10 051個(gè),“糖尿病”相關(guān)的靶點(diǎn)14 895個(gè),剔除掉重復(fù)靶點(diǎn)并合并疾病的交集靶點(diǎn)后,共有6 623個(gè)潛在靶點(diǎn)。

2.3 靶蛋白與交集蛋白的篩選

利用Venny在線網(wǎng)站,將OFPPs活性成分的作用靶點(diǎn)與氧化應(yīng)激、糖尿病的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行歸納與篩選,如圖2所示,OFPPs和氧化應(yīng)激、糖尿病共有70個(gè)相關(guān)作用靶點(diǎn),約占總集合的1.1%。

圖2 OFPPs與氧化應(yīng)激、糖尿病的共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 核心靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將OFPPs和氧化應(yīng)激、糖尿病的交集蛋白導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)并導(dǎo)入Cytoscape軟件,得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,如圖3所示。

圖3 潛在作用靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

圖3中最中心的圓就是篩選出的核心基因,其中前十的核心靶點(diǎn)分別為CASP3、VEGFA、STAT3、IL2、HSP90AA1、SLC6A2、KDR、BCL2L1、PRKCA和FGF2,其中CASP3在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析

將70個(gè)交集蛋白導(dǎo)入Bioconductor軟件進(jìn)行GO富集和KEGG通路分析。GO功能富集分析的結(jié)果如圖4所示。

圖4 交集蛋白的GO功能富集分析

其中OFPPs參與減輕糖尿病中的氧化應(yīng)激所涉及到的1～10號(hào)生物過(guò)程分別為G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號(hào)通路、腎上腺素能受體信號(hào)通路、平滑肌收縮、藥物反應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過(guò)程、血管收縮、血管直徑負(fù)調(diào)節(jié)、管徑調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血管直徑等生物過(guò)程。

KEGG通路分析結(jié)果如圖5所示。

圖5 交集蛋白的KEGG通路分析

圖5中,獲取的評(píng)分較高的1～23號(hào)信號(hào)通路分別為神經(jīng)活性配體-受體相互作用、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、鈣信號(hào)通路、細(xì)胞間隙連接、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、含血清素的神經(jīng)突觸、血管平滑肌收縮、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、胰島素抵抗和癌癥中的蛋白聚糖、化學(xué)致癌受體激活、生長(zhǎng)激素的合成分泌及作用、淀粉和蔗糖代謝、氮代謝、VEGF信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、NF-κB信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡相關(guān)通路。

2.6 OFPPs對(duì)信號(hào)通路的影響

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase3的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,在H2O2的誘導(dǎo)下,INS-1細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Caspase3的mRNA表達(dá)水平顯著提高,而B(niǎo)ax的mRNA表達(dá)水平顯著下降,證明氧化應(yīng)激狀態(tài)促進(jìn)了胰島β細(xì)胞的凋亡,影響了機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)。但在NAC和OFPPs的處理下,Bcl-2、Caspase3的mRNA表達(dá)水平不同程度地降低,而B(niǎo)ax的mRNA表達(dá)水平不同程度地提高,證明了OFPPs可以抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)下胰島β細(xì)胞的凋亡。

圖6 OFPPs對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

氧化應(yīng)激與多種凋亡信號(hào)通路有關(guān),氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的活性氧可以激活細(xì)胞凋亡信號(hào)從而促進(jìn)胰島β細(xì)胞的凋亡,其中Caspase家族和Bcl-2家族是最常見(jiàn)的調(diào)控因子[16-17]。Bcl-2家族由抗凋亡和促凋亡成員組成,調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑,其中Bcl-2是一種抗凋亡的線粒體膜蛋白,而B(niǎo)ax是一種促凋亡蛋白,Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)比率的降低驅(qū)動(dòng)凋亡因子釋放到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中,促進(jìn)Caspase3的激活,從而啟動(dòng)線粒體凋亡[18]。一些研究[19-20]表明,下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2及Caspase3的水平可以有效抑制細(xì)胞凋亡。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3種OFPPs組分均可以不同程度地減輕氧化應(yīng)激狀態(tài)下胰島β細(xì)胞的凋亡,其效果的差異可能與多糖不同的結(jié)構(gòu)(如分子量、糖殘基和鏈構(gòu)象等)有關(guān),需要進(jìn)一步研究[21]。

3 結(jié) 論

本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)OFPPs減輕糖尿病中氧化應(yīng)激的潛在可能與機(jī)制,對(duì)OFPPs及“糖尿病氧化應(yīng)激”的作用靶點(diǎn)進(jìn)行整合,其中部分核心蛋白與凋亡相關(guān),且其機(jī)制同樣涉及到細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明,OFPPs可以降低Bcl-2、Caspase3的mRNA表達(dá)水平,提高Bax的mRNA表達(dá)水平,抑制凋亡通路的激活。因此,OFPPs具有通過(guò)減輕胰島β細(xì)胞凋亡從而改善糖尿病癥狀的潛力,但其作用仍需進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。