李廣瑩, 肖桂然, 吳 磊, 閆永平, 紀(jì)曉雯, 金 禮

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

Piwi(P-element induced wimpy testis)屬于Argonaute 蛋白家族,特異性表達(dá)于生殖細(xì)胞中[1],通過與piRNA(Piwi-interacting,RNA)進(jìn)行結(jié)合,形成piRNA沉默復(fù)合物(piRNA-induced silencing complex,piRISC),以維持基因組中轉(zhuǎn)座子的正常沉默狀態(tài),防止轉(zhuǎn)座子爆發(fā)而引起相應(yīng)基因的改變,對生殖細(xì)胞的發(fā)育和維持基因組的完整性及穩(wěn)定性意義重大[2-4]。研究表明,Piwi蛋白在哺乳動物和其他昆蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)也有表達(dá)[5-6],在多種生物中表現(xiàn)出高度保守的結(jié)構(gòu)和功能特點[7]。Piwi/piRNA對轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的調(diào)控方式是多方面、多層次的,若Piwi蛋白發(fā)生突變或 piRNA通路受阻,則會使生殖細(xì)胞發(fā)育受到嚴(yán)重阻滯[8]。另有研究表明,Piwi在其他器官和組織如脂肪體中也有少量分布,但很少有關(guān)于piRNA與Piwi在脂肪體中功能的研究[9]。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是機(jī)體細(xì)胞正常代謝的產(chǎn)物,是一類大分子,屬于自由基[10],具有重要的生理功能,比如激活胞漿內(nèi)的第二信使參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]。線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞鏈?zhǔn)荝OS合成的主要場所,正常細(xì)胞所產(chǎn)生的ROS中有95%均來源于此[12]。但高濃度的ROS具有細(xì)胞毒性,當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)外環(huán)境刺激后,會產(chǎn)生大量的ROS分子,其中包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等,這些分子具有極強(qiáng)的氧化能力,破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的平衡,引起氧化應(yīng)激,攻擊DNA、蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子,給細(xì)胞帶來嚴(yán)峻的考驗[13-15]。因此,ROS過量積累會嚴(yán)重干擾相應(yīng)組織的正常功能。

作為四大經(jīng)典模式生物之一的黑腹果蠅,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳、發(fā)育、生理和行為等領(lǐng)域[16]。原因在于它具備如下優(yōu)良特性:果蠅易于培養(yǎng)、生長迅速、繁殖速度快;染色體數(shù)目少,但突變性狀多,已構(gòu)建多種基因型的突變體;相關(guān)技術(shù)成熟,易于進(jìn)行遺傳上的操作[17-18]。此外,果蠅與哺乳動物在許多方面具有相似性,比如類似的組織和器官結(jié)構(gòu),其中果蠅的脂肪體(fat body)相當(dāng)于哺乳動物的脂肪和肝臟[19]。另外,果蠅具有許多哺乳動物相關(guān)蛋白的同源物[20],因此可利用模式生物果蠅對Piwi蛋白在脂肪體中的功能進(jìn)行研究。

本實驗主要研究脂肪體中的Piwi對機(jī)體生長發(fā)育的影響。研究表明,在脂肪體敲低Piwi的表達(dá),脂肪體的儲存代謝受損,進(jìn)而影響到果蠅的生長發(fā)育,包括羽化率降低、生長周期延長、壽命縮短。進(jìn)一步的研究表明,敲低Piwi基因會誘導(dǎo)ROS大量生成,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂,從而對脂肪體的功能造成損傷。本研究對Piwi調(diào)控相關(guān)疾病的發(fā)生具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

GAL4-UAS系統(tǒng)是實現(xiàn)果蠅體內(nèi)基因特異性敲低的常用手段,該系統(tǒng)由driver(GAL4)和responder(UAS)2個調(diào)控元件組成,分別存在于2種轉(zhuǎn)基因果蠅中,2種果蠅雜交產(chǎn)生的后代同時含有這2種元件,GAL4啟動UAS下游基因細(xì)胞的組織特異性表達(dá)。

由于布置擋板會導(dǎo)致風(fēng)室局部阻力增大，相應(yīng)增加風(fēng)機(jī)負(fù)荷，造成風(fēng)機(jī)功率降低，增加電耗。因此在研究爐排橫向配風(fēng)不均勻時需要考慮風(fēng)室的阻力及阻力造成的電耗損失。模擬結(jié)果如圖9、圖10所示。

本研究所用的GAL4驅(qū)動子是Cg-GAL4,該果蠅來自Bloomington Drosophila Stock Center,它能特異地在果蠅的脂肪組織中表達(dá),實驗中利用該驅(qū)動子實現(xiàn)脂肪體中特異性敲低Piwi基因;研究中所用到的對照組果蠅品系為野生型和Piwi-RNAi 2個品系的果蠅,均來源于Vienna Drosophila Research Center(VDRC)。

1.2 實驗儀器

酶標(biāo)儀(澳大利亞INFINITE M NANO);倒置熒光DIC顯微鏡(日本Nikon)。

1.3 方法

1.3.1 果蠅飼養(yǎng)條件

根據(jù)甘油三酯測試盒(南京建成生物工程研究所,貨號A110-1-1)的使用說明,對細(xì)胞內(nèi)甘油三酯水平進(jìn)行檢測。

龐樸先生指出，大概到春秋時期，“五行”已經(jīng)逐步由具體的物質(zhì)抽象為具有統(tǒng)攝性的物質(zhì)“屬性”［14］，例如在《左傳·昭公二十九年》蔡墨對魏獻(xiàn)子的答辭中，蔡墨提出：“有五行之官，是謂五官?！菊痪涿ⅲ鹫蛔Ｈ?，金正曰蓐收，水正曰玄冥，土正曰后土。龍，水物也。水官棄矣，故龍不生得。”［15］2323無論是五行的神格化，還是以“龍”為“水物”，均顯示此時“五行”已經(jīng)具有類型化的屬性。不過，當(dāng)蔡墨進(jìn)而論及“五官”之神的形成過程時，他以五官先后出自少皞、顓頊、共工三氏，且為六人所分守，這種結(jié)構(gòu)上的粗疏顯示出此時的“五行說”尚未達(dá)到充分系統(tǒng)化的水平，其與“陰陽”似乎也未發(fā)生關(guān)聯(lián)。

所有受試者均經(jīng)MRI檢查，然后對其3D-TOF-MRA和3D-FIESTA影像資料進(jìn)行對比分析。①診斷設(shè)備選用型號為Signa HDxt 3.0T超導(dǎo)型MRI成像系統(tǒng)設(shè)備（GE公司），其能夠高效準(zhǔn)確的對三又神經(jīng)腦池段進(jìn)行3D-TOF-MRA和3D-FIESTA掃描；②掃描檢查出來的最終結(jié)果邀請神經(jīng)科醫(yī)師和至少兩名MR診斷醫(yī)師共同使用盲法進(jìn)行讀片，然后判斷出患側(cè)組及健側(cè)組三叉神經(jīng)腦池段，分別與周圍血管的關(guān)系及責(zé)任血管構(gòu)成比[3]。

1.3.2 果蠅羽化率和生長周期的測定

每只果蠅培養(yǎng)管隨機(jī)放入9～12只羽化3 d的Cg處女蠅,3～5只雄性雜交品系果蠅,25 ℃培養(yǎng)下培養(yǎng)3 d(即交配3 d),然后將它們轉(zhuǎn)移到葡萄汁培養(yǎng)板上產(chǎn)卵24 h。新孵化的1日齡幼蟲被轉(zhuǎn)移到果蠅培養(yǎng)基上進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。密度控制為每管50只幼蟲,每組10管,統(tǒng)計羽化果蠅的數(shù)目和每管果蠅全部羽化所用時間。羽化率計算公式為:

根據(jù)活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號S0033S)的使用說明,使用綠色熒光探針DCFH-DA對活性氧水平進(jìn)行檢測。

羽化率=(羽化的果蠅數(shù)/50)×100%。

1.3.3 果蠅壽命的測定

雖然國家在解決貧困人口問題上做出了堅持不懈的努力，也讓農(nóng)村經(jīng)濟(jì)得到了極大的發(fā)展，但是任務(wù)并沒有完成。這是當(dāng)前我國社會矛盾的真實反映，同時這也是我國在全面建成小康社會的道路上必須跨越的一步，需要全社會的共同的努力。

圖1中,A組、B組分別表示Piwi-RNAi的2個品系,下同。由圖1可知,對照組果蠅羽化率將近100%,而Piwi敲低后果蠅的羽化率明顯降低,只有40%～50%。這說明Piwi所調(diào)控的某種機(jī)制對果蠅的生長發(fā)育有至關(guān)重要的作用。

對于有單獨公豬舍的豬場，應(yīng)想法使公豬舍的室溫保持在13℃～20℃，或者把公豬放入后備舍或妊娠母豬舍以維持公豬需要的適宜溫度，減輕降溫對公豬的影響。

果蠅培養(yǎng)基的制備。天平準(zhǔn)確稱取玉米粉100 g、大豆粉10 g、白糖14.5 g、紅糖40 g、酵母25 g、瓊脂8 g,蒸餾水1 L攪拌均勻并煮沸。冷卻至適當(dāng)溫度,加入防腐劑(2%),倒入果蠅培養(yǎng)管,冷卻凝固后即可使用。果蠅飼養(yǎng)的溫度為25 ℃,濕度為65%。

1.3.5 細(xì)胞ROS水平的測定

入組患者均于術(shù)前抽取靜脈血2mL，采用北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司的試劑對CYP2C19*2、CYP2C19*3基因型進(jìn)行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

通過SPSS22.0軟件分析處理實驗數(shù)據(jù),實驗結(jié)果表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差),組間差異使用One-Way ANOVA檢驗,本實驗中顯著性水平P<0.05(*),P<0.01(**),P<0.001(***)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對果蠅羽化率的影響

對外部市場項目開展監(jiān)督制約是一項專業(yè)性較強(qiáng)、涉及面廣、情況比較復(fù)雜的綜合性工作，需要認(rèn)真總結(jié)工作經(jīng)驗，不斷向?qū)掝I(lǐng)域和深層次延伸，使監(jiān)督制約工作逐步走上制度化、規(guī)范化的道路，以促進(jìn)社會市場項目優(yōu)質(zhì)、廉潔、高效運行，保障企業(yè)利益的實現(xiàn)。

1.3.4 細(xì)胞甘油三酯水平的測定

圖1 敲低脂肪體Piwi對果蠅羽化率的影響

每只果蠅培養(yǎng)管放入20只同一天羽化的雌蠅,每組10管。每2 d轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)管(保證食物新鮮與充足),除去管底已死亡的個體并統(tǒng)計記錄,直到每管不存在存活個體,29 ℃、65%濕度,每組10管。

羽化率是衡量果蠅生存能力的重要指標(biāo)。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)Piwi敲低后果蠅的羽化率顯著下降,統(tǒng)計結(jié)果如圖1所示。

2.2 對果蠅生長周期和壽命的影響

一般飼養(yǎng)環(huán)境下正常果蠅從幼蟲到羽化約為10 d,Piwi敲低后果蠅生長遲緩,結(jié)果如圖2所示。

圖2 敲低脂肪體Piwi對果蠅生長周期的影響

Piwi敲低組果蠅生長周期與對照組相比延長,大約比對照組多2 d。

不同組別果蠅的存活率如圖3所示。由圖3可知,與對照組相比,Piwi敲低后果蠅的壽命發(fā)生顯著縮短,Piwi-RNAi的2個品系均在40 d左右發(fā)生大規(guī)模的死亡,分別在60、70 d時全部死亡。實驗結(jié)果表明,Piwi對果蠅的存活十分重要。

圖3 敲低脂肪體Piwi對果蠅壽命的影響

圖4 敲低脂肪體Piwi對果蠅TAG的影響

2.3 對果蠅脂肪體功能的影響

甘油三酯(triacylglycerol,TAG)是脂質(zhì)的重要組分,果蠅的內(nèi)源性TAG主要分布在脂肪組織中,功能是供給和儲存能量[21]。因此甘油三酯含量是鑒定脂肪體功能的重要指標(biāo),反映脂肪體的儲存代謝[22],結(jié)果如圖3所示。與對照組相比,Piwi敲低后果蠅脂肪體TAG摩爾分?jǐn)?shù)顯著下降,2個品系均降低到50%以下。本實驗結(jié)果表明,Piwi對脂肪體的功能至關(guān)重要,Piwi敲低引起脂肪體TAG的儲存異常。

式中，(0,σ2)分別為竊聽節(jié)點處第1跳和第2跳的復(fù)加性高斯白噪聲.本文中，符號上標(biāo)(1)、(2)分別表示第1跳和第2跳.

2.4 果蠅脂肪體細(xì)胞的過氧化

為進(jìn)一步研究脂肪體細(xì)胞在Piwi敲低后受到何種影響,本實驗通過使用活性氧檢測試劑盒來鑒定果蠅脂肪體細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,染色結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,與對照組相比,Piwi-RNAi的2個品系脂肪體細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),說明Piwi敲低后,脂肪體細(xì)胞ROS積累過多。ROS堆積會對脂肪體細(xì)胞的儲存功能造成嚴(yán)重?fù)p傷,這是影響果蠅生長發(fā)育的重要原因。

圖5 敲低果蠅脂肪體Piwi的ROS水平

3 結(jié) 論

本文以果蠅為模式生物,研究了Piwi基因在脂肪體表達(dá)量降低對果蠅生長發(fā)育的危害以及對脂肪體儲存功能的干擾。實驗結(jié)果表明,Piwi敲低導(dǎo)致果蠅脂肪體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS,引起脂肪體儲存TAG的功能下調(diào),影響果蠅的生長發(fā)育,導(dǎo)致果蠅羽化率下降、發(fā)育遲緩以及壽命縮短。本研究發(fā)現(xiàn)Piwi在脂肪組織中的重要功能,為后續(xù)研究Piwi在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮的功能提供參考。