蘇涇涵,王改萍*,劉玉華,戚 亞,彭大慶,李守科,曹福亮

(1.南京林業(yè)大學(xué),南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037;2.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 句容 212400;3.江蘇鹽城林場(chǎng),江蘇 鹽城 224057;4.山東沃奇農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司,山東 濰坊 262106)

文冠果(Xanthocerassorbifolia)為無(wú)患子科文冠果屬落葉小喬木或灌木,是我國(guó)特有的油料樹(shù)種[1]。文冠果的根、莖、葉、花、果實(shí)均可入藥,能祛風(fēng)濕,消腫止痛。文冠果葉富含生物活性物質(zhì),加工后可作為茶飲,具有降血脂、降膽固醇等功效[2]。目前,對(duì)文冠果的研究主要集中在文冠果果實(shí)及油料提取等方面[3-5],文冠果葉總多酚提取工藝的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

多酚是一類存在于植物體內(nèi)具有特殊化學(xué)活性的次生代謝產(chǎn)物,具有很好的抗炎抑菌、抗氧化效果,常作為一種天然的抗氧化劑[6]。多酚常見(jiàn)的提取工藝有溶劑萃取法、超聲波法、微波法。超聲波法操作方便,相比傳統(tǒng)的溶劑萃取法縮短了提取時(shí)間,且提取效果優(yōu)于微波法,常應(yīng)用于中藥及天然產(chǎn)物提取方面,具有提取效率高、活性保持良好等優(yōu)點(diǎn)[7-9]。

超聲輔助提取技術(shù)就是利用超聲波的機(jī)械作用、空化作用、熱效應(yīng)等迅速破壞植物細(xì)胞,縮短原料中有效成分進(jìn)入溶劑的時(shí)間[10],加快提取過(guò)程,提高提取效率,且不易破壞植物體中有效成分,避免其抗氧化等生物活性顯著下降[11-12]。目前,李國(guó)倩等[13]利用超聲波輔助法對(duì)文冠果果殼總多酚的含量及抗氧化活性進(jìn)行了研究,但是對(duì)文冠果葉總多酚的提取研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取文冠果葉總多酚,研究文冠果葉總多酚的最優(yōu)提取工藝。對(duì)15個(gè)不同來(lái)源地的文冠果葉總多酚含量及其抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定,探討不同來(lái)源地的文冠果葉總多酚及其抗氧化活性的差異,旨在為我國(guó)特有油料樹(shù)種文冠果的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù),為后續(xù)葉用文冠果品種篩選工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于山東省安丘市文冠果種質(zhì)資源圃,材料于2021年7月進(jìn)行采集,包括15個(gè)不同來(lái)源地的成年文冠果,來(lái)源地分別為:甘肅張掖、遼寧建平、新疆昌吉、河南沁陽(yáng)、陜西榆林、內(nèi)蒙古赤峰、河北張家口、遼寧朝陽(yáng)、內(nèi)蒙古翁牛特旗、內(nèi)蒙古巴彥淖爾、新疆喀什、寧夏銀川、安徽鳳臺(tái)、青海樂(lè)都、吉林白城。

每個(gè)不同來(lái)源的文冠果選擇3株,設(shè)3個(gè)重復(fù),分別于東、西、南、北4個(gè)方向采集葉片,之后混勻。葉片置于裝有干冰的采樣盒帶回實(shí)驗(yàn)室,將葉片清洗干凈,經(jīng)過(guò)60 ℃恒溫干燥箱烘干,粉碎后過(guò)60目(孔徑0.25 mm)篩備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱取0.2 g樣品,包于脫脂濾紙中,加入一定濃度的乙醇溶液,在不同的提取溫度、提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度的條件下進(jìn)行提取,所得濾液即為待測(cè)液。

1.2.2 文冠果葉總多酚超聲波輔助提取

采用單因素試驗(yàn)方法,以額定功率240 W、體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液、料液比1∶20 g/mL、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間30 min為固定水平,探究不同水平的單因素對(duì)文冠果葉總多酚提取量的影響,為后續(xù)響應(yīng)面法優(yōu)化文冠果葉總多酚提取實(shí)驗(yàn)確立合適的參數(shù)范圍。

每個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)水平,乙醇體積分?jǐn)?shù)[14-15]分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%,提取溫度[14,16]為30、40、50、60、70、80 ℃,提取時(shí)間[17-18]為20、30、40、50、60、70 min,料液比[17,19]分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL。

1.2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化文冠果葉總多酚提取實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,在額定功率下分別對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%)、料液比(1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)、提取時(shí)間(30、40、50 min)、提取溫度(50、60、70 ℃)4個(gè)因子進(jìn)行3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì),采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面分析法以總多酚提取量為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)(RSM),以獲取最佳提取工藝參數(shù)。

1.2.4 文冠果葉總多酚含量的測(cè)定

參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》[20],并采用福林酚法[21]進(jìn)行文冠果葉總多酚含量的測(cè)定。

1.2.5 文冠果葉體外抗氧化活性的測(cè)定與綜合分析

清除總多酚(DPPH)自由基能力參照陳克克等[22]的方法進(jìn)行測(cè)定;總抗氧化能力(FRAP法)參照廖友媛[23]的方法進(jìn)行測(cè)定;采用綜合抗氧化能力指數(shù)(APC)[24-25]綜合評(píng)價(jià)不同來(lái)源文冠果葉總多酚的抗氧化能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS 20.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果葉總多酚超聲波輔助提取

不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)文冠果葉總多酚提取量有明顯影響(表1)。乙醇體積分?jǐn)?shù)由40%上升到70%時(shí),文冠果葉總多酚提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加;乙醇體積分?jǐn)?shù)由70%上升到90%時(shí),文冠果葉總多酚的提取量開(kāi)始不斷減少。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí),文冠果葉總多酚的提取量達(dá)到最高,為40.27 mg/g。

表1 不同單因素對(duì)文冠果葉總多酚提取量的影響

不同的料液比對(duì)文冠果葉總多酚提取量有一定的影響(表1)。料液比由1∶10 g/mL變?yōu)?∶15 g/mL時(shí),文冠果葉總多酚提取量增加;料液比由1∶15 g/mL變?yōu)?∶25 g/mL時(shí),文冠果葉總多酚的提取量增長(zhǎng)緩慢;料液比由1∶25 g/mL變?yōu)?∶30 g/mL時(shí),文冠果葉總多酚的提取量明顯增加;當(dāng)料液比由1∶30 g/mL變?yōu)?∶35 g/mL時(shí),葉總多酚的提取量下降?？傮w看,當(dāng)料液比為1∶30 g/mL時(shí),文冠果葉總多酚的提取量達(dá)到最高,為42.86 mg/g。

不同提取時(shí)間對(duì)文冠果葉總多酚提取量有一定的影響(表1)。提取時(shí)間由20 min增加到40 min,隨著提取時(shí)間的增加,文冠果葉總多酚提取量隨之增加;提取時(shí)間由40 min增加到50 min時(shí),文冠果葉總多酚提取量開(kāi)始減少,超過(guò)50 min時(shí)文冠果葉總多酚提取量又開(kāi)始上升。

不同提取溫度對(duì)文冠果葉總多酚提取量有一定的影響(表1)。提取溫度由30 ℃增加到60 ℃時(shí),總多酚的提取量顯著上升;提取溫度由60 ℃增加到70 ℃時(shí),文冠果葉總多酚的提取量趨于平穩(wěn);由70 ℃增加到80 ℃時(shí),文冠果葉總多酚提取量反而增加,可能是雜質(zhì)導(dǎo)致含量增加。因此,當(dāng)提取溫度達(dá)到60 ℃時(shí),總多酚的提取量達(dá)到最高,為40.24 mg/g。

2.2 文冠果葉總多酚響應(yīng)面法優(yōu)化提取

2.2.1 響應(yīng)面模型建立

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)4因素3水平的文冠果葉總多酚提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn),得到29組多酌提取量如表2所示。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸模型方程擬合,得到以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取溫度(D)為影響因素的文冠果葉總多酚提取含量(c)回歸方程為:

c=39.348-1.28A+0.110 0B+1.003 3C+3.202 5D-0.117 5AB-0.502 5AC-1.102 5AD+0.345BC+0.322 5BD-0.142 5CD-1.776 5A2+0.834 8B2-0.497 8C2+0.566D2。

2.2.2 響應(yīng)面回歸方程的方差分析與顯著性檢驗(yàn)

表3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.3 響應(yīng)面分析及總多酚最優(yōu)工藝的確定

通過(guò)響應(yīng)面及等高線的形狀和顏色變化(圖1),分析4個(gè)主要因素間的交互作用對(duì)總多酚提取量的影響后發(fā)現(xiàn),乙醇體積分?jǐn)?shù)-提取溫度交互的響應(yīng)面圖形曲面最大,顏色變化也最大,判斷乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度之間的交互作用對(duì)文冠果葉總多酚提取量的影響最大。利用Design Expert中Box-Behnken對(duì)總多酚提取量進(jìn)行最優(yōu)化設(shè)計(jì),得到的最佳提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)58.245%、料液比1∶29.794 g/mL、超聲波作用時(shí)間42.882 min、提取溫度69.601 ℃。為了便于實(shí)驗(yàn)的操作,設(shè)定提取工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶30 g/mL、提取時(shí)間43 min、提取溫度70 ℃。在此條件下,文冠果葉總多酚含量測(cè)定為43.66 mg/g,與理論值44.78 mg/g相差較小,因此可以設(shè)定此條件為文冠果葉總多酚最佳提取工藝。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)-提取溫度交互作用效果圖Fig. 1 The interaction effect diagram of material liquid ratio-extraction time

2.3 不同來(lái)源文冠果葉總多酚含量及抗氧化能力比較

不同來(lái)源文冠果葉總多酚含量及抗氧化活性比較見(jiàn)圖2。由圖2a可知,15個(gè)不同來(lái)源地的文冠果葉總多酚平均含量為36.34 mg/g,其中銀川、建平、樂(lè)都、喀什來(lái)源地的文冠果葉總多酚含量較高;15個(gè)來(lái)源地中文冠果葉片總多酚含量最高的是銀川,含量為42.37 mg/g;朝陽(yáng)與榆林文冠果葉總多酚含量均為35.92 mg/g,二者之間無(wú)差異,但均高于來(lái)自昌吉、青海、白城、張掖、鳳臺(tái)、張家口來(lái)源地的文冠果葉總多酚含量;張家口來(lái)源地的文冠果葉總多酚含量最低,僅為27.91 mg/g。

Gz.甘肅張掖 Zhangye, Gansu;Lj.遼寧建平 Jianping,Liaoning;Xc.新疆昌吉 Changji, Xinjiang;Hq.河南沁陽(yáng) Qinyang, Henan;Sy.陜西榆林 Yulin, Shaanxi;Ic.內(nèi)蒙古赤峰 Chifeng, Inner Mongolia;Hz.河北張家口 Zhangjiakou, Hebei;Lc.遼寧朝陽(yáng) Chaoyang, Liaoning;Iw.內(nèi)蒙古翁牛特旗 Wengniute Banner, Inner Mongolia; Ib.內(nèi)蒙古巴彥淖爾 Bayan Zhuoer, Inner Mongolia;Xk.新疆喀什 Kashgar, Xinjiang;Ny.寧夏銀川 Yinchuan, Ningxia;Af.安徽鳳臺(tái) Fengtai, Anhui;Ql.青海樂(lè)都 Ledu,Qinghai;Jb.吉林白城Baicheng, Jilin。下同。The same below.圖2 15個(gè)不同來(lái)源地的文冠果葉總多酚含量及其抗氧化活性比較Fig. 2 A comparison of total polyphenol content and antioxidant activity of X. sorbifolia leaves from 15 different sources

不同來(lái)源文冠果葉總多酚對(duì)DPPH自由基的清除率差異較大(圖2b),15個(gè)來(lái)源地的文冠果葉總多酚對(duì)DPPH自由基清除率的范圍為64.33%～92.65%。其中銀川來(lái)源地樣品的DPPH自由基清除率最高為92.65%,張家口來(lái)源地樣品的DPPH自由基清除率最低為64.33%,銀川、樂(lè)都、朝陽(yáng)來(lái)源的文冠果葉總多酚清除DPPH自由基的能力較強(qiáng)。

不同來(lái)源地文冠果葉總多酚的總抗氧化能力見(jiàn)圖2c。結(jié)果表明FRAP不同來(lái)源地文冠果葉總多酚對(duì)總抗氧化差異較大,15個(gè)來(lái)源地的文冠果葉總多酚的FRAP總抗氧化能力在0.71～1.53 mol/g。其中來(lái)自樂(lè)都、銀川、巴彥淖爾、朝陽(yáng)來(lái)源地的FRAP總抗氧化能力較強(qiáng),樂(lè)都來(lái)源的樣品FRAP總抗氧化能力最強(qiáng)為1.53 mol/g;張掖的樣品FRAP總抗氧化能力最弱為0.71 mol/g。

綜上所述, 銀川、樂(lè)都來(lái)源地的文冠果葉片總多酚含量較高且抗氧化能力較強(qiáng)。

2.4 文冠果葉片總多酚抗氧化能力綜合評(píng)價(jià)

不同來(lái)源文冠果葉總多酚抗氧化能力指數(shù)見(jiàn)表4。由表4知,樂(lè)都、銀川、朝陽(yáng)來(lái)源的文冠果葉總多酚綜合抗氧化能力指數(shù)(APC)較高,張掖、張家口、昌吉來(lái)源的文冠果葉總多酚綜合抗氧化能力指數(shù)APC較低;樂(lè)都的APC指數(shù)最高,為99.73%;昌吉的APC指數(shù)最低,僅為62.82%。

表4 15個(gè)不同來(lái)源文冠果葉片總多酚抗氧化能力指數(shù)

2.5 文冠果葉總多酚與抗氧化活性的關(guān)系

不同來(lái)源文冠果葉總多酚抗氧化能力相關(guān)性見(jiàn)表5。由表5可知,不同來(lái)源的文冠果葉片總多酚含量與DPPH清除能力、總抗氧化能力均呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)。

表5 不同來(lái)源文冠果葉總多酚含量與抗氧化活性 的相關(guān)性分析

3 討 論

隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高,文冠果葉總多酚提取量在不斷上升,但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)總酚含量開(kāi)始下降,造成此現(xiàn)象的原因可能是文冠果葉多酚類物質(zhì)與其他物質(zhì)形成穩(wěn)定化合物,存在一定極性[26],當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí),溶劑的極性減弱,導(dǎo)致溶出的其他物質(zhì)與多酚類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)[27-29],使得多酚提取率下降。料液比由1∶10 g/mL變?yōu)?∶30 g/mL時(shí),隨著乙醇提取劑含量的增加,增大了反應(yīng)面積[30],促進(jìn)文冠果葉多酚類物質(zhì)的提取,但當(dāng)料液比由1∶30 g/mL變?yōu)?∶35 g/mL時(shí),文冠果葉總多酚的含量反而減少,可能由于文冠果葉多酚類物質(zhì)已經(jīng)溶出[31],過(guò)多的乙醇提取劑導(dǎo)致單位體積內(nèi)多酚含量變小,降低了文冠果葉總多酚的提取量[32]。

提取時(shí)間由40 min變?yōu)?0 min時(shí),文冠果葉總多酚提取量開(kāi)始減少,當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增長(zhǎng),出現(xiàn)文冠果葉總多酚含量再次增長(zhǎng)的現(xiàn)象,造成此結(jié)果的原因可能是由于過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間會(huì)使機(jī)械力和熱能破壞總多酚類物質(zhì)分解生成其他雜質(zhì)[33-34];因此選擇40 min作為單因素試驗(yàn)最適提取時(shí)間。前期隨著溫度升高,促進(jìn)分子運(yùn)動(dòng),使得提取劑與物料接觸增多,多酚溶出增加[35];當(dāng)提取溫度大于70 ℃時(shí),文冠果葉總多酚提取量不斷上升,造成此現(xiàn)象的原因可能是提取溫度過(guò)高時(shí)多酚結(jié)構(gòu)被破壞,生成部分雜質(zhì)[26,36]。

超聲波輔助法有利于植物多酚的提取,此方法節(jié)約時(shí)間、便于操作,因此選擇此方法探究文冠果葉總多酚的最佳提取工藝[37]。前期對(duì)文冠果葉片單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定,得到最適提取工藝,并探究了不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇、料液比、提取時(shí)間、提取溫度[38-41]對(duì)總多酚提取率的影響,最適工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶30 g/mL、提取時(shí)間40 min、提取溫度60 ℃。后期為了可以更直觀地反映各因素間的交互作用,得到更可靠的預(yù)測(cè)值,通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法[42]對(duì)文冠果葉總多酚提取率進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì),得到最優(yōu)提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶30 g/mL、超聲波作用時(shí)間43 min、提取溫度70 ℃。在此優(yōu)化條件下,文冠果葉片總多酚提取量為43.66 mg/g。

目前,對(duì)文冠果總多酚含量的研究較少,李媛等[43]研究發(fā)現(xiàn)文冠果果殼總多酚含量為10.22 mg/g。本研究發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的文冠果葉片總多酚平均含量為36.34 mg/g,文冠果葉片的多酚含量遠(yuǎn)高于文冠果果殼總多酚含量。此外,對(duì)于總多酚的研究主要集中在中草藥、茶葉及水果方面。陳克克等[22]研究表明北蒼術(shù)的總多酚含量為11.9 mg/g;馬飛躍等[44]研究表明桑葚葉總多酚含量為26.35 mg/g;薛雯等[45]發(fā)現(xiàn)葡萄葉總多酚含量為36.594 mg/g;李曉英等[46]發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓嫩葉的總多酚含量為43.77 mg/g,老葉總多酚含量為38.76 mg/g。綜上所述文冠果葉片總多酚含量較高,可作為一種新型植物多酚提取樹(shù)種。

本研究結(jié)果顯示文冠果葉片總多酚含量與DPPH清除力、總抗氧化能力呈極顯著正相關(guān),即表現(xiàn)為,文冠果葉總多酚含量越高,其DPPH清除力、總抗氧化能力也整體呈上升趨勢(shì)。這一結(jié)論與馬飛躍等[44]對(duì)不同品種桑葉總酚含量及抗氧化活性的研究結(jié)果,以及林寶妹等[47]不同品種嘉寶葉總多酚抗氧化活性的研究結(jié)果一致。

15個(gè)不同來(lái)源地的文冠果葉總多酚平均含量為36.34 mg/g, 其中銀川的文冠果葉總多酚含量最高,為42.37 mg/g。銀川的DPPH自由基清除率最高,為92.65%;樂(lè)都的總抗氧化能力最強(qiáng),為1.53 mol/g。

綜上所述,15個(gè)來(lái)源地的文冠果葉總多酚含量較高,抗氧化能力較強(qiáng),文冠果可以作為一種新型總多酚提取植物。