楊甲定,劉雨節(jié),馮建元,2,張遠蘭

(1.南京林業(yè)大學,南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,南京林業(yè)大學生命科學學院,江蘇 南京 210037;2. 江蘇食品藥品職業(yè)技術學院,江蘇 淮安 223005)

氮是植物生長發(fā)育中需求量最大的營養(yǎng)元素[1],在自然生態(tài)系統(tǒng)中,氮素缺乏是限制植物生長與分布的常見環(huán)境因子之一,而在人工農(nóng)林生產(chǎn)系統(tǒng)中,施用氮肥以保證土壤中存在足夠的氮素營養(yǎng)是保障植物生物量生產(chǎn)的重要措施之一[2]。據(jù)估計,全球每年有超過1億t合成氮肥的施用來支持農(nóng)業(yè)生產(chǎn),但由于農(nóng)作物的氮素利用效率普遍低于50%,有近一半的外施氮素并沒有被植物所吸收而流失到環(huán)境中。我國人口眾多,每年需施用大量氮肥來確保農(nóng)作物豐收,但大量化肥投入并沒有帶來成比例糧食產(chǎn)量的提高,化肥利用率僅為30%左右,因此農(nóng)業(yè)生產(chǎn)存在“高肥低效”的問題[1]。就林業(yè)而言,天然林通常不需要化肥的投入,但人工林(plantation forests)作為當前木材相關產(chǎn)品的重要來源,因其速生和短輪伐特性,每年需要密集的管理和投入,其中重要的內容就是化肥的施用。大量氮素的投入不但意味著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本的增加,而且氮素向環(huán)境的流失,帶來土壤酸化、土壤和水體富營養(yǎng)化、溫室氣體大量排放等一系列的環(huán)境問題[3]。因此,如何在保證農(nóng)林系統(tǒng)生物量生產(chǎn)的前提下,減少氮肥施用,減輕環(huán)境污染,成為亟待解決的現(xiàn)實和科學問題[4]。

近年來,以提高植物氮素利用效率(nitrogen use efficiency, NUE)為目標的研究正成為植物學、農(nóng)學領域的研究熱點之一[5],但與樹木相關的機理解析和應用研究尚不多見。培育具有較高NUE的作物和林木新品種,不僅可以一定程度上減少植物根際土壤氮素的流失,有利于改善環(huán)境,同時有助于減少農(nóng)林生產(chǎn)中人工氮肥的施用,降低生產(chǎn)成本,維持可持續(xù)生產(chǎn)經(jīng)營。筆者對植物(側重于樹木)葉片衰老與氮素再吸收的關系及其分子調控機理等方面進行綜述,并就未來研究的方向進行探討,以期為培育具有高氮素再吸收效率的落葉樹木新種質提供科學參考。

1 植物氮素利用效率的基礎

在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中,由于人工化肥的大量施加,土壤中的無機氮(硝酸鹽和銨鹽,包括有機氮肥尿素在脲酶的作用下生成的銨態(tài)氮)含量較高,是作物根系主要吸收的氮源。土壤酸堿性會影響無機氮的存在形式,即在通氣良好的土壤中以硝態(tài)氮為主,在水淹或酸性土壤中以銨態(tài)氮為主[6]。而在人工干擾較少的特定生態(tài)系統(tǒng)中(比如北方或北極的森林或草地),土壤有機氮(比如氨基酸、氨基糖和核苷酸等)通常有較高的水平而作為植物吸收的主要氮源[7]。植物除了可以從土壤中直接獲得氮素之外,豆科(Leguminosae)植物能夠通過與土壤中細菌共生形成根瘤,通過固定大氣中的氮氣為植物提供銨態(tài)氮[8]。

植物對氮素的利用包括幾個步驟,即吸收、同化/轉運、再吸收/轉運等,這些步驟的活性在物種(或亞種)間、植物不同發(fā)育階段、不同植物組織/器官間存在差異,而且受到各種外界環(huán)境條件的影響,因此植物氮素利用效率是一個涉及遺傳因素和環(huán)境因素互作的復雜性狀,是植物根系對土壤氮素的吸收、植株對所吸收氮素的同化與利用、衰老組織/器官中氮素的再吸收等多方面效率的綜合表現(xiàn)[4]。解析植物氮素利用效率形成的限速步驟或環(huán)節(jié),有助于有針對性地調控這些步驟或環(huán)節(jié)以提高氮素利用效率。

1.1 氮素吸收(nitrogen uptake)

植物根系吸收土壤中不同形態(tài)的氮素由相應的轉運蛋白完成,根據(jù)其對所轉運氮素的親和性分為低親和和高親和轉運系統(tǒng)[5]。①植物對硝態(tài)氮的吸收由硝酸鹽轉運蛋白(nitrate transporter,NRT)完成[9]。硝酸鹽轉運蛋白在植物體內成員眾多,以擬南芥(Arabidopsisthaliana)為例,已知有72個硝酸鹽轉運相關的蛋白,分為NRT1、NRT2、CLC和SLAC/SLAH等4類[10],其中NRT1成員最多,達53個,主要是低親和性轉運蛋白,負責在高濃度硝酸鹽條件下對硝酸離子的吸收,但某些成員專一性不強,除了硝酸離子,還可轉運二肽、多種激素或硫代葡萄糖苷。擬南芥AtNRT1.1是植物中第一個被鑒定的硝酸鹽轉運蛋白,不僅可參與根系對硝酸鹽的吸收,也參與硝酸鹽由根向莖的轉運,而且其對硝酸離子的親和活性具有高低兩種狀態(tài),通過其蛋白上Thr101的磷酸化(表現(xiàn)高親和性)與去磷酸化(表現(xiàn)低親和性)轉換親和性[11]。與NRT1不同,NRT2家族成員均對硝酸鹽轉運表現(xiàn)高親和性,參與在低硝酸鹽濃度下根系對硝酸離子的吸收(或轉運)過程,擬南芥中有7個成員(AtNRT2.1-2.7),除AtNRT2.7外,其他成員均需輔助蛋白(AtNAR2.1)的協(xié)助才能發(fā)揮其轉運功能。②植物對銨鹽的吸收由銨鹽轉運蛋白(ammonium transporter,AMT)完成,在擬南芥中,轉運銨鹽的AMT蛋白家族有6個成員,即5個AMT1成員(AMT1;1-1;5)和1個AMT2[12]。根系對銨鹽的吸收由AMT1;1、AMT1;2、AMT1;3、AMT1;5等4個AMT蛋白負責,均為高親和性銨轉運蛋白,其中AMT1;1、AMT1;3和AMT1;5在根表皮細胞表達而AMT1;2則在根系皮層和內皮層細胞中表達。擬南芥四突qko(即amt1;1amt1;2amt1;3amt2;1)在以銨鹽為唯一氮源的生長條件下表現(xiàn)出嚴重的生長受阻,而且根系對銨鹽的高親和吸收活性僅為野生型中活性的5%～10%[13]。③植物對有機氮源吸收的研究聚焦于氨基酸方面,根系吸收氨基酸被認為是通過氨基酸轉運蛋白APC(amino acid-polyamine-choline,氨基酸-多胺-膽堿)超家族中的3個亞家族成員:AAPs(amino acid permeases)、LHTs(lysine/histidine-like transporters)和ProTs(proline and glycine betaine transporters)完成[14]。不同家族之間以及家族之內,各轉運蛋白對底物的特異性和親和性存在差異,比如擬南芥AAP1參與根系對谷氨酸和中性氨基酸的吸收,而AAP5在堿性氨基酸的攝取中發(fā)揮功能;LHT1轉運中性和酸性氨基酸進入根,而LHT6負責從根際空間吸收酸性氨基酸、谷氨酰胺和丙氨酸;ProTs則轉運可作為滲透調節(jié)劑的脯氨酸和甘氨酸甜菜堿[15]。相對而言,植物根系對氨基酸的吸收尚有待深入研究。無論是無機氮源還是有機氮源的轉運蛋白,其基因的表達不僅受植物體內營養(yǎng)水平的調控,也受到土壤氮素水平、溫度、光照、土壤其他理化性質的影響,反映了植物根系吸收土壤氮素的靈活性[16]。

1.2 氮素同化(nitrogen assimilation)

植物根系吸收的硝酸離子,一部分會儲存在根系細胞的液泡中,另一部分則在根中經(jīng)胞質硝酸還原酶和質體亞硝酸還原酶催化還原為銨鹽,并與根系吸收的銨鹽一起在根細胞內同化合成氨基酸和蛋白質;其他大部分硝酸離子會隨木質部液流運輸,在地上部莖葉中還原為銨,再進一步同化。銨鹽的同化主要通過谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、谷氨酰胺-氧戊二酸轉氨酶(glutamine oxoglutarate aminotransferase,GOGAT)和天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,AS)催化而生成氨基酸[17]。谷氨酰胺合成酶是氮同化過程的關鍵酶,根據(jù)亞細胞定位,可分為胞質型GS1和質體型GS2,其中GS1在根中發(fā)揮氮同化的主要作用,特別是在高硝酸鹽濃度時;而GS2主要負責在葉肉細胞內的氮同化和再同化光呼吸產(chǎn)生的銨[15]。無機氮同化過程產(chǎn)生的氨基酸和根系吸收的氨基酸均可被用于細胞內蛋白質的合成,同時地上部合成的氨基酸也可通過韌皮部運回至根系,因此植物體內存在著根系與地上部之間的氮素交流系統(tǒng),這種氮素交流的強度受到植物種類、植物發(fā)育狀態(tài)和環(huán)境因子的影響[18]。

1.3 氮素再吸收(nitrogen resorption)

氮素同化后產(chǎn)生的絕大部分氨基酸會用于蛋白質的合成,既發(fā)揮酶的催化功能也作為氮的儲藏。葉片中存在大量非活性的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)和谷氨酰胺合成酶GS2很可能就是一種氮素的貯藏形式[15]。氮素再吸收就是分解源器官(如衰老葉片)中的儲藏蛋白,以氨基酸或酰脲的形式將氮素轉運至幼嫩器官或儲藏器官。1年生模式植物和作物中的大量研究表明,氮素再吸收的最主要轉運形式是氨基酸和小肽。衰老葉片氮素再吸收有3個連續(xù)的環(huán)節(jié),即蛋白質降解(degradation of leaf proteins)、氨基酸相互轉變(interconversion of amino acids)和氨基酸向韌皮部的裝載(phloem loading of amino acids)[19]。①蛋白質的降解主要通過自噬途徑和蛋白水解酶完成,在擬南芥葉片衰老階段,大量蛋白水解酶基因和自噬基因的表達上調,暗示了二者在氮素再吸收中的作用。②蛋白質降解生成的氨基酸并不是隨機運輸?shù)?研究表明衰老階段韌皮部液流中含量最多的氮素轉運形式是谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、絲氨酸等特定氨基酸,因此存在其他氨基酸向這些特殊氨基酸的轉變反應。這種反應被認為發(fā)生在葉肉細胞和篩管伴胞的線粒體和細胞質內,主要催化酶為谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,GDH)、谷氨酰胺合成酶1(glutamine synthetase 1,GS1)和天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,AS)等[17]。③篩管是運輸氨基酸回流的通道,雖然推測氨基酸從葉肉細胞進入篩管既可通過胞間連絲介導的共質體途徑也可通過質外體途徑,但擬南芥和大多數(shù)作物中的研究表明氨基酸進入篩管是質外體裝載過程,即氨基酸首先從薄壁細胞或維管束鞘細胞以被動運輸方式進入葉片質外體,隨后由定位于韌皮部伴胞細胞膜的轉運蛋白將質外體的氨基酸運入韌皮部,這一環(huán)節(jié)通常認為是氮素由源(比如衰老葉片)向庫(儲藏器官)轉運的限速環(huán)節(jié)[20-21]。

2 植物葉片衰老與氮素再吸收

氮素再吸收通常發(fā)生在整體植株或特定組織/器官進入由發(fā)育年齡引發(fā)的自然衰老或因環(huán)境脅迫誘導的提前衰老時[17,22]。衰老(senescence)作為一種以發(fā)育年齡為內因的程序性過程,可以發(fā)生在細胞、組織、器官和整體植株等不同水平[23]。葉片衰老是葉片正常生長發(fā)育的最后一個生物學階段[24]。營養(yǎng)生長期的葉片作為光合器官,也是活躍同化氮素的主要場所;隨著進入衰老階段,葉片的光合能力和氮素同化代謝逐漸衰弱,而葉綠素、蛋白質、糖、脂質等大分子的分解逐漸增強,因此形態(tài)上的失綠是葉片衰老最明顯的特征,而代謝上則主要是葉綠素的降解和葉綠體結構的解離,使葉片轉變?yōu)閮粝蛲廨敵鰻I養(yǎng)成分的源器官,最終導致葉片的死亡[23]。葉片衰老雖然發(fā)生在器官水平,但與整體植株的生長發(fā)育密切相關:當1年生植物進入生殖生長階段,比如大田作物小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)等開花進而孕育籽粒時,會啟動葉片的衰老進程,同時整體植株趨向自然死亡;而對多年生落葉樹木而言,葉片自然衰老通常伴隨著每年秋季葉片顏色由綠變黃或變紅以及葉片凋落,表明樹木結束當年的生長期而進入休眠期[25]。雖然在適宜的生長條件下,葉片的衰老主要依賴于發(fā)育年齡,但各種內源因素(激素含量、營養(yǎng)物積累等)和外源環(huán)境因子(光周期、溫度、水肥供應、病蟲害等)可以影響衰老的啟動與進程[24],特別是在非生物環(huán)境脅迫條件下,植物往往通過提前啟動成熟葉片的衰老來再吸收其中儲藏的營養(yǎng)資源(比如氮素)以保證其幼葉發(fā)育或完成種子生產(chǎn),因此環(huán)境脅迫引發(fā)的葉片衰老進程也與植物對環(huán)境的適應能力相關聯(lián)[22]。

1年生植物/作物葉片衰老所輸出的氮磷等營養(yǎng)成分主要用于新器官(如新葉和種子)的生長發(fā)育,特別是以籽粒為收獲對象的1年生農(nóng)作物,在其生殖生長階段的花序生長、種子發(fā)育以及籽粒產(chǎn)量主要依賴從衰老葉片中再吸收的營養(yǎng)[19],比如水稻、小麥、大麥(Hordeumvulgare)等作物營養(yǎng)器官中,最高可達90%的氮素會被再吸收轉運至籽粒[2]。大量大田研究也表明,作物衰老葉片的氮素再吸收效率決定了籽粒的產(chǎn)量[26],而且在作物發(fā)育的適當階段促進葉片的衰老可以促使更多的營養(yǎng)成分向籽粒輸送,從而提高籽粒的營養(yǎng)價值,比如具有更高的蛋白含量和某些微量元素的含量等[27]。另一方面,延緩葉片衰老意味著葉片光合功能保持更長時間,有利于光合同化物的生產(chǎn),可以提高植株生物量的積累,特別是對綠葉蔬菜作物來說,延緩葉片衰老還有利于保持蔬菜的采后品質以及延長儲運時間,降低采后損失[28]。因此,闡明植物(作物)葉片衰老和營養(yǎng)再吸收以及利用的調控機理,可在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中根據(jù)所收獲植物器官的差別(比如是葉片還是籽粒),有針對性地調控葉片的衰老進程(即在特定階段延緩或促進農(nóng)作物的葉片衰老),從而更精準地為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務。

與1年生農(nóng)作物不同,多年生木本落葉植物(落葉樹木)每年秋季的葉片衰老過程中,伴隨著葉綠素的降解,葉片內的部分氮素營養(yǎng)會再吸收回枝條、莖干甚至根系[24]。生長于福建濱海同一地區(qū)的4種紅樹植物表現(xiàn)出不同的衰老葉片氮素再吸收效率:拒鹽紅樹秋茄(Kandeliaobovata)和木欖(Bruguieragymnorrhiza)的氮素再吸收效率較高,分別為73%和83%,而泌鹽紅樹白骨壤(Avicenniamarina)和桐花樹(Aegicerascorniculatum)則較低,分別為66%和42%[29];生長于墨西哥中部山區(qū)的兩種落葉櫟樹(Quercuscastanea和Q.deserticola)表現(xiàn)出不同的葉片氮素再吸收效率,分別為87.9%和82.4%[30];生長于干熱河谷區(qū)的林齡為9、15和26 a的新銀合歡(Leucaenaleucocephala),或生長于濱海沙地的林齡為4 、8、13 a的尾巨桉(Eucalyptusgrandis×E.urophylla),其葉片對氮素養(yǎng)分的再吸收率均表現(xiàn)出隨林齡的增大而下降的趨勢[31-32];以重慶石灰?guī)r地區(qū)15種常綠木本植物和14種落葉木本植物為對象的研究結果則表明常綠植物基于單位質量葉片養(yǎng)分含量計算的氮素平均再吸收效率為39.42%,高于落葉植物的24.08%[33];我國太行山地區(qū)闊葉人工林樹種刺槐(Robiniapseudoacacia)的葉片氮素再吸收效率為34%～53%,而針葉樹側柏(Platycladusorientalis)的養(yǎng)分再吸收不明顯[34];在養(yǎng)分虧缺條件下生長的日本落葉松(Larixkaempferi) 其葉片氮素再吸收效率可達 76.3% ,但在營養(yǎng)充分條件下為56.8%[35]。這些研究說明樹木葉片的氮素再吸收效率不僅與樹種、樹木年齡、樹種功能類型(落葉或常綠、針葉或闊葉)等有關,也受生長環(huán)境、土壤氮素水平、水分供應等環(huán)境因子的影響[36]。同時在全球尺度上,衰老葉片的氮素再吸收效率與植物生長區(qū)域的緯度顯著正相關(即隨著緯度的升高而升高),但與年平均氣溫、年平均降水量顯著負相關(即隨年平均氣溫和降水量的升高而降低)[37]。

葉內氮素再吸收回到枝條等器官不僅有助于增強植物對外界寒冷/干旱脅迫的抵抗能力,而且這些營養(yǎng)物質在第2年春季可以再動員轉運,用于芽、葉、花的萌生,從而有利于提高植物的生存競爭能力[38]。利用15N標記手段檢測春季根系對氮素的吸收,發(fā)現(xiàn)許多落葉樹種包括楊樹(Populustrichocarpa)[39]、歐洲花楸(Sorbusaucuparia)[40]、蘋果(Malusdomestica)[41]等,其春季枝條內儲藏氮素的再利用要比根系對氮素的活躍吸收早20～30 d發(fā)生,說明其春季地上部的初生長(新葉和花的萌生)依賴于對枝條內所儲藏氮素營養(yǎng)的再利用,而不依賴于春季的根際肥料施用。新近有關橡膠樹(Heveabrasiliensis)的研究表明,落葉期再吸收的氮素主要貯藏在主干和根系,其15N分配率為 59.58%左右,以主干木質部的15N分配率最高;這些貯藏氮在翌年春季會有超過一半再分配用于新生器官的生長發(fā)育,并且上一季的適量施肥對貯藏氮的分配率有一定的提高作用[42]。這些結果說明落葉樹種在春季的最初長勢可能主要取決于枝條或根系中的貯藏氮素營養(yǎng),而這一營養(yǎng)積累又與上一年秋季落葉前葉內氮素營養(yǎng)的再吸收過程緊密正相關。因此,通過提高樹木衰老葉片的氮素再吸收效率促使更多氮素營養(yǎng)從衰老葉片轉運回枝條或其他貯藏組織,不僅減少了樹木因落葉導致的體內氮素損失,而且在某種程度上降低了樹木下一季生長對外源氮肥的需求,這對大面積落葉人工林來說具有節(jié)省化肥施用、降低經(jīng)營成本的潛在應用價值。

3 衰老葉片氮素再吸收的調控機理

葉片衰老是一個受到嚴格調控的程序化過程,在機理上體現(xiàn)為葉片細胞在基因表達、信號傳導、代謝及結構等層次的有序變化[43]。近年來有關植物葉片衰老的研究已深入到分子水平。在1年生模式植物和農(nóng)作物中,通過從T-DNA插入突變體庫或化學誘變突變體庫中篩選葉片衰老表型發(fā)生改變的突變體,成功鑒定了許多重要的參與葉片衰老的正負調控因子;利用差異表達技術或全基因組轉錄組分析,已經(jīng)從多種植物中篩選出大量的衰老相關基因(senescence associated genes,SAGs),其表達水平在葉片衰老的特定階段上調,暗示SAGs在葉片衰老進程中發(fā)揮一定功能。根據(jù)我國科學家創(chuàng)建的葉片衰老數(shù)據(jù)庫(Leaf Senescence Database, https://ngdc.cncb.ac.cn/lsd/index.php)[44],在87個物種中鑒定到SAGs,其中SAG數(shù)目較多(>100)的物種有擬南芥、香蕉(Musaacuminata)、毛果楊(P.trichocarpa)、中國白菜(Brassicarapa)、棉花(Gossypiumhirsutum)、玉米、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、毛白楊(P.tomentosa)、歐美雜交楊(P.tremula×P.tremuloides)、水稻、高粱(Sorghumbicolor)、大豆和小麥。但這些植物中大多數(shù)SAG的確切功能尚未得到實驗確證。擬南芥中有3 920個SAGs,其中大約11%的基因的表達蛋白是轉錄調控因子(TF),以NAC、WRKY、C2H2鋅指蛋白、AP2/EREBP和MYB等家族的數(shù)量較多,暗示這些家族的TF可能調控不同的下游靶基因和代謝環(huán)節(jié),由此組成一個極其復雜的轉錄調控網(wǎng)絡來精細協(xié)調擬南芥葉片的衰老過程[45]。同時,其他層次(比如表觀遺傳水平、轉錄后水平、可變剪接、蛋白水平和代謝水平)的調控機理尚有待深入闡明[46]。另外,植物激素在葉片衰老中有重要調節(jié)作用[47],通常根據(jù)葉片衰老進程中各類激素的含量變化和外源施用對植物衰老的影響,將植物激素分為延緩衰老激素(包括生長素、赤霉素和細胞分裂素等)和促進衰老激素(包括脫落酸、乙烯、茉莉酸、水楊酸、獨腳金內酯等)兩類,由于植物激素信號轉導途徑存在交叉聯(lián)系,一種激素對葉片衰老的調節(jié)作用可能取決于物種、植株的發(fā)育階段或生長環(huán)境條件和激素濃度等因素[23]。

與1年生模式植物和作物相比,對木本植物的葉片衰老研究并不多。Bhalerao等[48]以歐洲山楊(P.tremula)自然條件生長但無可見衰老表型的秋葉和溫室生長完全展開的P.tremula×tremuloides幼葉為材料,構建兩個cDNA文庫,分別獲得5 128和4 841個表達序列標簽,發(fā)現(xiàn)兩個文庫具有完全不同的基因表達模式:在秋葉中,編碼金屬硫蛋白、早期光誘導蛋白和半胱氨酸蛋白酶的表達序列標簽最為富集,而編碼其他蛋白酶和參與呼吸、脂類和色素降解的蛋白以及脅迫相關的基因也顯著存在;另外,間接估計秋葉中質體蛋白的合成速率低于幼葉中速率的10%。Andersson等[49]利用包含13 490個基因克隆的生物微芯片,對瑞典北部自然生長的歐洲山楊葉片從8月17日到9月21日自然衰老7個時間點的轉錄活性進行檢測,發(fā)現(xiàn)3 792個代表性基因具有顯著表達變化,其中包括與葉綠素降解、線粒體呼吸、脂肪酸氧化分解以及營養(yǎng)轉運相關的基因(比如蛋白酶基因),表現(xiàn)出與擬南芥葉片衰老相關基因SAG相似的表達模式。Wen等[50]以亞熱帶地區(qū)生長的落葉樹木楓香(Liquidambarformosana)為研究對象,利用RNA測序技術檢測了4月綠葉和12月紅葉的轉錄組活性,并利用生物微芯片技術對連續(xù)3年(2011—2013)生長季基因表達水平進行檢測,發(fā)現(xiàn)WRKY基因家族成員(LfWRKY70、LfWRKY75和LfWRKY65)和NAC基因家族成員(LfNAC1和LfNAC100)以及其他一些轉錄因子(LfSPL14和LfMYB113)是葉片衰老的關鍵調控基因;通過對葉片衰老時的上調基因進行調控網(wǎng)絡分析,發(fā)現(xiàn)被LfWRKY75、LfNAC1和LfMYB113所調控的某些基因正是與葉片衰老中葉綠素降解和花青素合成相關的候選基因。與這一結果類似,在1年生模式植物擬南芥中,AtWRKY75被鑒定為葉片衰老中依賴于年齡的正調控因子,其表達水平在葉片衰老中上調,并且與水楊酸合成和活性氧H2O2清除相偶聯(lián)[51]。Li等[52]對大田生長的3株毛白楊在16個時間點(2018年9月22日—11月17日)的葉片進行RNA測序,發(fā)現(xiàn)14 776個差異表達基因,其中有3 459個基因屬于葉片衰老正相關基因,在葉片衰老進程中表達上調,其功能主要是參與糖、脂、氨基酸等的代謝途徑和調控激素響應。這些楊樹葉片衰老正相關基因與擬南芥衰老相關基因(3 852個)之間有1 029個同源基因是重疊的,暗示多年生植物葉片的秋季衰老和1年生植物葉片衰老具有高度的相似性?；蚬脖磉_網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn),來自31個家族的115個衰老相關轉錄因子為衰老節(jié)點轉錄因子,特別是衰老相關的NAC轉錄因子在控制楊樹葉片衰老中發(fā)揮著關鍵作用,其中PtNAC013/PtRD26轉錄因子被鑒定為節(jié)點正因子,可直接調控下游的多個衰老相關基因,包括其他NAC基因(即PtORE1和PtNAP)和參與葉綠素降解(PtSGR1)、葉綠體蛋白降解(PtCV)和賴氨素代謝(PtLKR)的基因以及參與茉莉酸合成(LOX2)、乙烯合成和信號轉導(ACS6和PtEIN3)的基因等。更有意思的是,PtRD26在衰老葉片中會轉錄產(chǎn)生1個攜帶一段內含子的可變剪接體PtRD26IR,其編碼蛋白作為負調控因子,可延遲楊樹葉片的各類衰老過程(如年齡依賴的、黑暗誘導的以及PtRD26誘導的衰老)[53]?？傊?目前對木本植物葉片衰老的研究多以組學手段挖掘衰老相關的差異表達基因,對可能的關鍵基因的功能驗證以及精細的調控途徑解析尚不多見,特別是與葉片衰老氮素再吸收相關的研究有待加強。

分析植物衰老相關的研究可知,迄今經(jīng)實驗確證的與葉片衰老營養(yǎng)轉運相關的轉錄因子主要是NAC家族蛋白。在擬南芥和水稻中,其突變能導致植物葉片自然衰老延遲的基因推測可能對衰老葉片中營養(yǎng)(氮素)的再吸收有正調控作用,如擬南芥AtNAP基因的功能缺失導致植株衰老延遲(即相對于同齡的野生型植株,突變體nap葉片有更高的葉綠素和氮素含量)[54]。在小麥中下調TtNAM-B1同源基因的轉錄水平可以延緩植株的自然衰老,導致旗葉中的蛋白含量提高而籽粒中蛋白含量降低,說明從葉片到籽粒的氮素轉運受到一定抑制[55]。在水稻中超表達OsNAP使植株自然衰老提前,促使更多營養(yǎng)向籽粒轉運,使籽粒的蛋白含量和其他7種元素的含量均顯著提高[27]。這些研究表明,某些NAC轉錄因子具有調控葉片衰老中氮素轉運的功能。Tang等[56]結合3年大田試驗的基因組關聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)和功能驗證,在水稻中發(fā)現(xiàn)了1個雙親合硝酸根轉運蛋白OsNPF6.1HapB的優(yōu)異單體型植株,在低氮生長條件下表現(xiàn)出更強的氮素吸收能力和籽粒產(chǎn)量的提高;而且鑒定到1個NAC轉錄因子OsNAC42,能通過結合OsNPF6.1啟動子上的CACG元件而激活OsNPF6.1的表達,由此揭示了利用OsNAC42-OsNPF6.1信號節(jié)點來提高水稻氮素利用效率的分子育種途徑。最近,在柳枝稷(Panicumvirgatum)中發(fā)現(xiàn)1個核定位的CCCH型鋅指蛋白PvSSG,盡管不具有轉錄調控活性,但表現(xiàn)為葉片衰老的抑制因子,超表達或抑制其基因的表達,可延遲或加速葉片衰老;酵母雙雜交篩選到PvNAP1/2是PvSSG的互作蛋白,由于PvNAP1/2是葉片衰老的正調控因子,可直接轉錄激活下游的葉綠素代謝基因,表明PvSSG是通過與PvNAP1/2蛋白互作,減弱PvNAP1/2對其下游靶基因的轉錄激活作用,從而對葉片衰老進程起到“剎車”作用[57]。盡管這些研究并沒有考察所鑒定的對葉片衰老有正調控作用的基因是否也調控葉內的氮素轉運,但基于氮素再吸收與葉片衰老的密切偶聯(lián)關系,推測這些衰老正調控因子應會對氮素再吸收產(chǎn)生影響,但究竟是直接調控氮素再吸收的某一生理環(huán)節(jié)還是通過其他調控因子間接影響氮素轉運,尚有待解析。

4 展 望

由于現(xiàn)有的關于樹木氮素再吸收的研究多從生理生化水平研究氮素營養(yǎng)的季節(jié)性動態(tài)和對樹齡、外界水肥供應、脅迫因子的響應,從分子水平解析樹木葉片衰老氮素再吸收的調控機理尚不多見,未來應加強以下方面的研究:

1)功能鑒定調控樹木葉片衰老氮素再吸收的關鍵轉錄因子。可以借鑒1年生植物中的研究成果,先從解析某些已知在樹木葉片衰老進程中表達上調的特定NAC、WRKY家族成員入手[53],通過轉基因超表達和基因編輯敲除,分析其對葉片衰老進程和衰老氮素轉運的影響,相應地考察氮素再吸收效率的變化,由此鑒定出具有提高植物氮素利用效率潛力的特定成員。

2)由于衰老葉片中氨基酸由質外體向韌皮部的裝載是氮素再吸收的限速環(huán)節(jié),需要從眾多的氨基酸轉運蛋白中鑒定出定位于篩管伴胞細胞膜且在氨基酸運入韌皮部中發(fā)揮關鍵功能的特定成員?？梢允紫群Y選在葉片衰老中表達上調的氨基酸轉運蛋白基因,通過考察這些基因的啟動子在葉片不同組織的活性和所編碼蛋白的亞細胞定位,獲得定位于篩管伴胞細胞膜的特定成員,進而分析上調/下調該轉運蛋白對衰老葉片氨基酸再吸收的影響。

3)植物激素脫落酸和乙烯對葉片衰老進程發(fā)揮促進作用,不僅二者的內源含量在葉片衰老中上升而且外施一定濃度的激素溶液均可誘導葉片的提前衰老變黃[58]。由于這兩類激素在模式植物中的信號轉導元件已相當清楚,可以通過在樹木中遴選各元件的同源基因,鑒定其是否在葉片衰老與氮素再吸收中發(fā)揮功能,并就其與上述特定NAC或WRKY轉錄因子和特定的韌皮部氨基酸轉運蛋白之間的可能互作關系進行分析。

另外,參照1年生作物和模式植物中的研究,也應關注樹木葉片衰老和氮素再吸收中表觀遺傳水平的調控、非編碼RNA(包括小分子核糖核酸miRNA和長鏈非編碼核糖核酸lncRNA等)和小肽等的作用。通過功能鑒定并篩選樹木葉片衰老氮素再吸收過程的關鍵調控因子或節(jié)點,將可能為分子育種提供可靠的靶標,有助于未來通過遺傳改良培育具有較高氮素利用效率的樹木新品種。