羅芊芊,李峰卿,肖德卿,鄧章文,王建華,周志春*

(1. 撫州市林業(yè)科學(xué)研究所,江西 撫州 344000;2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所,浙江 杭州 311400;3. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心,江西 分宜 336600)

南方紅豆杉(Taxuswallichianavar.mairei)是集藥用、材用和觀賞于一體的珍稀瀕危樹(shù)種[1],主要分布于我國(guó)亞熱帶季風(fēng)區(qū)的各省山區(qū)。在天然居群中,南方紅豆杉個(gè)體呈小范圍內(nèi)聚集分布,偶有雌雄同株或自花授粉現(xiàn)象[2-3],且居群的年齡結(jié)構(gòu)多以老齡為主,幼齡為輔,幼齡個(gè)體數(shù)量和生長(zhǎng)速度難以支撐居群的擴(kuò)展進(jìn)程[3-5]。鑒于南方紅豆杉的瀕?，F(xiàn)狀,研究人員已對(duì)其群落生態(tài)學(xué)[6-7]、分子生物學(xué)[8-9]、種子發(fā)芽生理學(xué)[10-11]、生長(zhǎng)過(guò)程和生長(zhǎng)規(guī)律[12-13]、培育和栽培技術(shù)[14-15]等方面進(jìn)行了深入研究。然而,對(duì)南方紅豆杉的科學(xué)保護(hù)應(yīng)結(jié)合其現(xiàn)存居群規(guī)模和遺傳多樣性水平進(jìn)行。

植物交配系統(tǒng)是維持兩代個(gè)體間遺傳聯(lián)系的有性系統(tǒng),它決定著后代群體的基因型分布和種群動(dòng)態(tài)(有效群體大小、性別比例和隨機(jī)交配程度),與居群遺傳動(dòng)態(tài)密切相關(guān),且有助于了解有效居群變小的遺傳后果[16]。在為珍稀瀕危樹(shù)種遺傳改良開(kāi)展的數(shù)量遺傳學(xué)研究中,絕大多數(shù)的遺傳參數(shù)估算都必須以交配系統(tǒng)為基礎(chǔ)[17],其遺傳資源保護(hù)方案的制定也與交配系統(tǒng)密切相關(guān)[18-19]。南方紅豆杉的雌、雄生殖系統(tǒng)發(fā)育不一致,晚期發(fā)育的胚珠很難正常授粉且生殖周期較長(zhǎng),這些生殖特性是導(dǎo)致其自然繁殖較困難的一個(gè)重要的內(nèi)部因素。在嚴(yán)苛的環(huán)境條件篩選下,幼齡樹(shù)生存艱難,易出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育不良甚至大面積死亡的現(xiàn)象。天然居群更新過(guò)程中,因生境島嶼化,各居群間基因交流受阻,近交愈發(fā)頻繁,降低了物種的遺傳多樣性,使其適應(yīng)性和抗逆性減弱。此外,森林破碎化引起的林地環(huán)境條件改變,導(dǎo)致南方紅豆杉的天然分布范圍不斷收縮。生境破壞、基因流受阻及其生殖特性致使南方紅豆杉自然更新困難,這是其瀕危的主要原因[20]。南方紅豆杉天然小居群存在難以忽視的問(wèn)題甚至是滅絕的風(fēng)險(xiǎn)。因此,本研究采用SSR標(biāo)記研究南方紅豆杉天然居群的交配系統(tǒng),揭示該樹(shù)種天然居群的交配機(jī)制以及親代間遺傳多樣性的差異,為南方紅豆杉天然居群的長(zhǎng)期保護(hù)以及遺傳資源的改良利用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源、樣本采集及處理

試驗(yàn)主要對(duì)南方紅豆杉天然分布區(qū)內(nèi)的2個(gè)居群進(jìn)行研究,分別位于浙江省龍泉市和江西省分宜縣。2個(gè)居群所處地理位置均屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候,氣候溫和、雨量充沛[21]。2018年11月,在浙江龍泉和江西分宜居群中,采集親本樣本時(shí),對(duì)于50株以下的天然古樹(shù)或大樹(shù)居群,則選取所有古樹(shù)或大樹(shù)(幼齡植株不選取),浙江龍泉居群的取樣數(shù)是人力范圍內(nèi)所能采集到的最大樣本數(shù)(22個(gè)),實(shí)際的植株數(shù)量略大于樣本數(shù)(22～30個(gè));對(duì)于50株以上的居群,則僅選取其中代表性的50株,要求這50株植株分布均勻,且植株間隔50 m以上,因此江西分宜居群的實(shí)際采樣數(shù)量為50,最后可提取到DNA的樣本為49個(gè)。采集子代樣本時(shí),分別就所有當(dāng)年結(jié)實(shí)的親代分單株進(jìn)行采種,同一母株上的種子組成1個(gè)家系。取樣及采種詳細(xì)信息見(jiàn)圖1和表1。采種居群內(nèi)的結(jié)實(shí)母株數(shù)量較少,在浙江龍泉居群僅采集到5個(gè)母株的種子,江西分宜居群僅采集到3個(gè)母株的種子,共計(jì)8個(gè)母株(表1)。

表1 南方紅豆杉天然居群取樣母株基本信息

圖中黃色星形圖案表示采種母株,紅色圓點(diǎn)表示居群內(nèi)的親代,序號(hào)表示株號(hào)。 The yellow star pattern represents the mother plant of seed collection, and the red dots represent the parental plant in the population, the serial number indicates the plant number.圖1 南方紅豆杉天然居群中親代和采種母株的分布Fig. 1 Distribution of parental plants and mother plants in natural populations of Taxus wallichiana var. mairei

2019年12月將采集到的家系種子播種于浙江省龍泉市林業(yè)科學(xué)研究院保障性苗圃,2020年10月將家系幼苗運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室,采集家系子代幼苗葉片,每家系子代采集葉片4～6片(子代個(gè)體數(shù)超出35個(gè)的,采集個(gè)體數(shù)為35個(gè),不足35個(gè)子代的全部采集)。

1.2 總DNA提取及SSR-PCR擴(kuò)增

采用DNA提取試劑盒提取親代及子代樣本的基因組DNA,利用NanoDrop-2000和1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA質(zhì)量及濃度。本試驗(yàn)選用12對(duì)條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(S7、S24、S34、S36、S41、S44、S45、S64、S77、S79、S82、S93)[22-23](表2)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在TaKaRa PCR Thermal Cycle Dire Touch上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL:2×TaqPlus Master Mix(Vazyme Code:P211-02)12.5 μL,引物F&R(10μmol/L)1 μL,DNA模板(20 ng/μL)2 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Takara TP600R Thermal Cycler上進(jìn)行,其程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,54～63 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。采用Qsep100TM全自動(dòng)核酸蛋白分析系統(tǒng)對(duì)所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離檢測(cè)[21]。

表2 12對(duì)引物的基本信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 遺傳多樣性

使用Q-analyze 3.0對(duì)SSR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行峰圖分析及等位基因的讀取,然后采用GenALEx 6.5[24]對(duì)居群內(nèi)親代的遺傳多樣性進(jìn)行分析,遺傳多樣性參數(shù)包括等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Shannon’s多樣性指數(shù)(I)和固定指數(shù)(F=1-Ho/He)。采用HP-Rare 1.1[25]計(jì)算等位基因豐富度(AR)及私有等位基因豐富度(PA)。運(yùn)用FSTAT 2.9.3[26]進(jìn)行1 000次模擬,對(duì)上述遺傳多樣性參數(shù)在每個(gè)居群內(nèi)親代間的區(qū)別進(jìn)行檢測(cè),并計(jì)算親代的近交系數(shù)(Fis)[27]。

1.3.2 交配系統(tǒng)參數(shù)分析

本研究采用MLTR 3.4對(duì)南方紅豆杉交配系統(tǒng)遺傳參數(shù)進(jìn)行估計(jì)[28]。采用最大期望值(expectation maximization,EM)法,在參數(shù)默認(rèn)設(shè)置(t=0.9,FM=0.1,rt=0.1,rp=0.1)和95%的置信區(qū)間下經(jīng)過(guò)1 000次重復(fù)取樣(bootstraps),估算單位點(diǎn)異交率(ts)、多位點(diǎn)異交率(tm)、有效花粉供體數(shù)〔Nep=1/rp(m)〕、雙親近交系數(shù)(Ctm-ts)及父本相關(guān)性(rp)〔包括單位點(diǎn)[rp(s)]和多位點(diǎn)[rp(m)]相關(guān)性〕。其中Ctm-ts是雙親近交水平的估計(jì),數(shù)值越大表明父母本個(gè)體之間的親緣關(guān)系越近;rp是父本相關(guān)性的估計(jì),表示的是一個(gè)家系中兩個(gè)異交子代是全同胞(即兩個(gè)異交子代共享同一個(gè)父本)的比例[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 南方紅豆杉天然居群親代的遺傳多樣性

從南方紅豆杉天然居群親代的遺傳多樣性情況可以看出(表3),兩個(gè)參試居群親代的有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s多樣性指數(shù)(I)、等位基因豐富度(AR)和私有等位基因豐富度(PA)均值分別為4.192、1.508、3.886和1.740,ZJLQ居群的Ne、I、AR和PA要高于JXFY居群,分別為4.831、1.620、4.195和1.832。2個(gè)居群的近交系數(shù)皆大于零,且ZJLQ居群的近交系數(shù)(Fis=0.057)明顯小于JXFY居群(Fis=0.171)。2個(gè)居群的觀測(cè)雜合度(Ho)均小于期望雜合度(He),且固定指數(shù)(F)大于0,表現(xiàn)為雜合子缺失;此外,由引物S7在母株與子代中的擴(kuò)增結(jié)果(圖2)可知,母樹(shù)的等位基因在子代個(gè)體中偶有缺失。ZJLQ居群的固定指數(shù)(F)為0.001,在理論上接近于0。

L. Marker (20～1 000 bp). M.采種母株mother plant;B1—B7.子代progenies。圖2 引物S7在采種母株與子代中的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 The amplification products of primer S7 in part of mother plant and progenies

2.2 南方紅豆杉天然居群的交配系統(tǒng)

對(duì)ZJLQ和JXFY居群的交配系統(tǒng)參數(shù)進(jìn)行了估計(jì)(表4),結(jié)果表明:12個(gè)位點(diǎn)估算出的2個(gè)居群總的多位點(diǎn)異交率(tm)均為1.200,單位點(diǎn)異交率(ts)為0.932,雙親近交系數(shù)(Ctm-ts)為0.268,南方紅豆杉自然居群的雙親近交水平較低。南方紅豆杉自然居群中有效花粉供體數(shù)目(Nep)較少,僅為1.5。單位點(diǎn)父本相關(guān)性和多位點(diǎn)父本相關(guān)性的差值[rp(s)-rp(m)]反映雙親關(guān)聯(lián)度與交配群體結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系,[rp(s)-rp(m)]為0.095,大于零,表明親本間存在近親關(guān)系。

表4 2個(gè)南方紅豆杉天然居群的交配系統(tǒng)參數(shù)

3 討 論

南方紅豆杉是典型風(fēng)媒傳粉針葉樹(shù)種,已有研究表明,南方紅豆杉遺傳多樣性的物種水平(He= 0.638)以及種群水平(He= 0.468,Ho= 0.329)均較高[9, 23]。本研究中,參試的2個(gè)南方紅豆杉天然居群的遺傳多樣性(He= 0.713,Ho= 0.647,I=1.508)皆較高,這可能是由于南方紅豆杉曾廣泛分布于北半球,具有較為豐富的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ),幸存下來(lái)的南方紅豆杉居群保留了祖先居群的大部分遺傳變異。盡管該居群維持了較豐富的遺傳多樣性,但這些被地理隔離的斑塊狀天然小居群,隨著繁殖世代推移,遺傳漂變和近交衰退越來(lái)越明顯[20]。對(duì)大多數(shù)天然小居群來(lái)說(shuō),近親繁殖會(huì)導(dǎo)致后代純合性的增加和雜合性的減少,因而降低居群的繁殖和生存能力[30]。南方紅豆杉雌雄株間的花期不完全同步[2,31],導(dǎo)致居群內(nèi)開(kāi)花早的個(gè)體接受到的異源花粉概率降低,進(jìn)而出現(xiàn)近交繁殖現(xiàn)象[32]。大多數(shù)天然小居群中近緣個(gè)體間交配是不可避免的,當(dāng)經(jīng)歷一定繁殖世代,居群中每個(gè)個(gè)體都變成近緣,這種近親交配會(huì)導(dǎo)致后代個(gè)體數(shù)目減少、不育或交配成功率低,極易引起居群生殖健康度下降,更容易滅絕[20]。

南方紅豆杉的多位點(diǎn)異交率和單位點(diǎn)異交率都較高,表現(xiàn)為高度異交,這一結(jié)果與其他風(fēng)媒針葉樹(shù)種天然群體或人工群體的交配系統(tǒng)研究結(jié)果類(lèi)似[33-35]。南方紅豆杉雌雄異株間的花期不完全同步,也會(huì)導(dǎo)致其傳粉受精受阻[31],這可能是南方紅豆杉居群異交率高的主要原因[28]。參試的ZJLQ居群和JXFY居群的異交水平無(wú)差異,這與其在個(gè)體水平上的發(fā)現(xiàn)幾乎一致。雖然南方紅豆杉是以異交為主,但也存在極少數(shù)的雌雄同株或孤雌生殖的植株[2-3]。另外,早期胚胎發(fā)育階段的近交衰退程度不同也可能是導(dǎo)致個(gè)體間異交率不同的原因[36]。早期的針葉樹(shù)與紅豆杉科植物類(lèi)似,雌雄異株,但在漫長(zhǎng)的適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程中,雌雄生殖結(jié)構(gòu)逐漸融合形成兩性植株[20],因而在其天然居群中可能會(huì)存在自交現(xiàn)象。ZJLQ和JXFY居群有效花粉供體數(shù)目均小于2,且父本相關(guān)性和有效花粉供體數(shù)差別較大,意味著南方紅豆杉自然交配時(shí)親本(父本)來(lái)源非常有限,這與各采種母株在居群內(nèi)所處的位置及周?chē)H代植株的分布密度有關(guān)[32]。采種母株周邊的成年雄性個(gè)體少、密度低、花期不遇,會(huì)導(dǎo)致有效花粉供體較少、父本相關(guān)性較高,且由于傳粉限制,雌花不一定能充分接受到花粉,存在未授粉的雌花或授粉不充分的雌花。此外,生殖器官在發(fā)育過(guò)程中均會(huì)受到資源的限制,這種生殖的資源限制在高等植物中普遍存在。雌花受精后,胚胎發(fā)育受資源限制部分胚珠敗育,不能發(fā)育為種子[37]。居群內(nèi)的有效花粉供體若長(zhǎng)期處于數(shù)目較少的狀態(tài)時(shí),會(huì)逐漸降低子代群體的遺傳多樣性,導(dǎo)致大量有害隱性基因的暴露、子代群體經(jīng)濟(jì)性狀的下降乃至植物群體的衰亡[38]。母樹(shù)接受的花粉庫(kù)組成的多樣性越高,越能提高子代的遺傳變異,進(jìn)而增強(qiáng)物種抵御群口數(shù)量波動(dòng)和遺傳變異的能力[39]。

在調(diào)查ZJLQ和JXFY居群過(guò)程中還發(fā)現(xiàn),參試的ZJLQ居群中,幼苗及幼樹(shù)占比較小,說(shuō)明該居群中幼苗存活率較低,這可能是由于南方紅豆杉在生長(zhǎng)過(guò)程中,不同階段對(duì)光照的需求度有明顯差異,其需要經(jīng)歷嚴(yán)格的光照和水分因子選擇壓力[40]。ZJLQ居群中,老樹(shù)個(gè)體的數(shù)量最多,中幼齡植株嚴(yán)重不足,屬衰退型居群。雖然ZJLQ居群的參試親代數(shù)量明顯低于JXFY居群,但該居群中的雌株占比較大,有利于維持居群內(nèi)的授粉成功率和遺傳物質(zhì)交換,因此ZJLQ居群的遺傳多樣性并不低于JXFY居群。JXFY居群中,幼樹(shù)個(gè)體數(shù)量明顯多于ZJLQ居群,且居群中也具有一定數(shù)量的幼苗,說(shuō)明該居群中的生境有利于南方紅豆杉種子萌發(fā)形成幼苗,如果加以人為的撫育措施,此類(lèi)居群有望發(fā)展成為擴(kuò)展型居群。

致謝中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心曾平生、姚甲寶、厲月橋、劉素貞和張利利等,浙江省龍泉市林業(yè)科學(xué)研究院馮建國(guó)、徐肇友和肖紀(jì)軍等,福建省明溪紅豆杉產(chǎn)業(yè)研究所余能健等在野外取樣過(guò)程中給予了幫助。