陳 爽謝燕燕徐菊菊閆振宇*

（1.華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000）

骨再生是各種類型的骨創(chuàng)傷研究的難點(diǎn)問題，因?yàn)橥鈧?、車禍等外力難以抵抗的因素造成骨損傷、骨缺損，手術(shù)治療是臨床唯一有效的徹底治愈手段。 但是，由于身體不能耐受手術(shù)、置換材料發(fā)生排斥反應(yīng)、手術(shù)費(fèi)用昂貴等因素使其在臨床應(yīng)用上受到一定限制，部分患者常因無法行走而產(chǎn)生心理抑郁。 有研究證實(shí)，向牽張成骨模型注射自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可以對礦化區(qū)形成骨再生［1］，并且能夠分化為成骨細(xì)胞，再通過旁分泌發(fā)揮作用，此細(xì)胞易分離、擴(kuò)增、免疫原性低，間充質(zhì)干細(xì)胞提供了骨再生的新方向之一［2］。 BMSCs 屬于修復(fù)機(jī)體某些特定組織的一類干細(xì)胞，是一種能夠自我復(fù)制和分化為多種細(xì)胞類型的祖細(xì)胞。 另外，多項(xiàng)試驗(yàn)的研究結(jié)果證實(shí)了BMSCs 與生物材料具有很好的相容性，形成復(fù)合支架促進(jìn)骨缺損修復(fù)、骨組織再生的優(yōu)勢［3－4］。 近年來，BMSCs 已經(jīng)成為理想的骨組織工程種子細(xì)胞。 有實(shí)驗(yàn)研究表明，骨髓的收集技術(shù)會影響B(tài)MSCs 的異質(zhì)性，最后影響軟骨細(xì)胞分化，而對成骨或成肪潛力方面無明顯影響［5］。 本實(shí)驗(yàn)中，研究者通過5 d 大鼠乳鼠骨髓骨片法對BMSCs 進(jìn)行分離培養(yǎng)，并作出鑒定。 然后應(yīng)用PKH26 程序性標(biāo)記，觀察對細(xì)胞形態(tài)、增殖、誘導(dǎo)分化的影響，為BMSCs 體內(nèi)移植到軟骨的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級SD 雄性大鼠5 d 乳鼠和3 ～4 周SD 雄性大鼠分別2 只，前者體重11～13 g，后者體重80 ～90 g，實(shí)驗(yàn)動物均購買于北京華阜康生物科技股份動物公司［SCXK（京）2019－0008］。 動物均飼養(yǎng)在華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF 級屏障實(shí)驗(yàn)室環(huán)境內(nèi)［SYXK（冀）2020－007］，飼養(yǎng)條件：室溫18～26℃，相對濕度40%～70%。 實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查獲得華北理工大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2022-SY-012），所有實(shí)驗(yàn)動物在實(shí)驗(yàn)過程中均遵守3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

α-MEM 培養(yǎng)基、0.25% EDTA 胰酶、雙抗（青鏈霉素）均購買于Hyclone 公司，貨號SH30265.01、SH30042.01、SV30010；胎牛血清購買于Gibco 公司，貨號10099-141；PKH26 試劑盒購買于貝博生物科技有限公司，貨號BB-441125；CCK-8 試劑盒購買于北京聚合美生物科技有限公司，貨號MF128-01；油紅O 染色試劑盒、茜素紅S 染色液（0.2%）購買于北京索萊寶科技有限公司，貨號為G1262、G1450；Anti Rat FITC-CD29、Anti Rat FITC-CD90、Anti Rat FITC-CD45 均購買于美國BD 公司。 細(xì)胞培養(yǎng)箱購買于美國Termo 公司；流式細(xì)胞儀購買于美國Becton Dickinson 公司；熒光倒置相差電子顯微鏡購買于日本Nikon 公司；酶標(biāo)儀購買于美國Biotek 公司；生物安全柜購買于美國Farma 公司，型號為HR60-IIA2；微量電子天平購買于德國Satorius 公司，型號為TE601-L。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠BMSCs 提取與培養(yǎng)

采用大鼠5 d 乳鼠骨髓骨片法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，具體方法為：取SD 雄性大鼠5 d 乳鼠2 只，頸椎脫臼法處死后，用無菌鑷子、眼科剪輕輕將其后肢皮膚剝離掉，充分暴露雙后肢，分離雙側(cè)完整的后肢，去除附著的肌肉和筋膜，用含有1%雙抗的PBS 清洗2 次，并用眼科剪剪成體積小于3 mm3的小碎塊轉(zhuǎn)移至含10%血清的α-MEM 培養(yǎng)基中，混勻后接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置在37℃的5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。 接種48 h 后，可觀察到骨片周圍爬出的是細(xì)長的梭形細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80%左右，可進(jìn)行1 ∶2 傳代，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

傳統(tǒng)大鼠BMSCs 的分離培養(yǎng)方法是采用3 ～4周SD 雄性大鼠2 只，使用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，麻醉劑量2 mL／kg，然后用75%酒精浸泡10 min，傳遞至超凈臺內(nèi)。 取仰臥位，充分暴露膝關(guān)節(jié)，將后肢皮膚剪開，小心分離股骨脛骨以及肌肉筋膜等，用無菌PBS 浸泡后，使用1 mL 注射器沖洗骨髓腔，直至無紅色后，收集全部液體，離心，轉(zhuǎn)移到含10%血清的α-MEM 培養(yǎng)基中，混勻后接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置在37℃的5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。 48 h后首次換液，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80%左右，可進(jìn)行1 ∶2 傳代，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

1.3.2 大鼠BMSCs 鑒定

取第3 代BMSCs，對其進(jìn)行消化、離心、重懸后得到密度為1×106／mL 的單細(xì)胞懸液，分別加入抗大鼠單克隆抗體CD29、CD45、CD90，在4℃下進(jìn)行30 min 避光孵育，最后加入PBS 重懸，上機(jī)檢測，重復(fù)檢測3 次。

1.3.3 PKH26 標(biāo)記大鼠BMSCs

應(yīng)用PKH26 對第3 代細(xì)胞進(jìn)行染色，配制PKH26 染色工作液：用無血清α-MEM 培養(yǎng)基將PKH26 母液稀釋250 倍后備用。 用100 μL 染色工作液將消化完成的細(xì)胞沉淀重懸，直至細(xì)胞濃度為107／mL，吹打混勻后加到用錫紙包裹的EP 管中，放入37℃的培養(yǎng)箱進(jìn)行10 min 的孵育，4℃冰箱中孵育25 min，800 r／min 離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞，用PBS 清洗2 次細(xì)胞上未結(jié)合的PKH26 染色液，加入4 mL 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，充分吹打混勻，接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，注意避光，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，傳代擴(kuò)增，隨后可以直接在倒置熒光電子顯微鏡下觀察到細(xì)胞標(biāo)記的效果以及熒光的強(qiáng)弱。

1.3.4 CCK-8 法檢測標(biāo)記與未標(biāo)記細(xì)胞增殖活力

取第3 代被PKH26 標(biāo)記（實(shí)驗(yàn)）組和未被標(biāo)記BMSCs（對照）組，制備成單細(xì)胞懸液，操作依據(jù)CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力，具體步驟：分別將實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞濃度調(diào)整為2×103／L，每孔100 μL，接種到96 孔培養(yǎng)板，設(shè)5 個復(fù)孔，在相同條件下培養(yǎng)，每24 h 分別取5 個實(shí)驗(yàn)組和對照組孔加入10 μL CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱中孵育3 h，在酶標(biāo)儀450 nm 參數(shù)下讀取OD 值，連續(xù)檢測10 d，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將PKH26 標(biāo)記與未標(biāo)記大鼠BMSCs 的生長曲線繪制出來。

1.3.5 PKH26 標(biāo)記與未標(biāo)記細(xì)胞成骨成脂誘導(dǎo)及鑒定

（1）細(xì)胞成骨誘導(dǎo)及鑒定：成骨誘導(dǎo)液配方為向含10%血清的α-MEM 培養(yǎng)基中加入10 mmol／L β-甘油磷酸鈉、0.05 mmol／L Vc 和100 mmol／L 地塞米松。 取第3 代細(xì)胞調(diào)整密度為5×105／孔后，在6孔板中接種；當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%的融合度時，再替換成骨誘導(dǎo)液，培養(yǎng)至第21 天用茜素紅染色。

（2）細(xì)胞成脂誘導(dǎo)及鑒定：成脂誘導(dǎo)液配方為向含10%血清的α-MEM 培養(yǎng)基中加入10 μmol／L胰島素、1 μmol／L 地塞米松、0.5 mmol／L 3－異丁基－卜甲基黃嘌呤和200 μmol／L 吲哚美辛。 取第3 代細(xì)胞調(diào)整密度為5×105／孔后接種于6 孔板培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%融合度時，再替換成脂誘導(dǎo)液，培養(yǎng)至第14 天用油紅O 染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行繪制統(tǒng)計(jì)圖。 計(jì)量資料表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），多組數(shù)據(jù)間差異比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)之間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的形態(tài)觀察

將骨髓骨片接種于培養(yǎng)瓶，經(jīng)過大鼠BMSCs 原代36 h 的培養(yǎng)，可見少量從骨片周圍爬出，貼壁生長，有大量懸浮的細(xì)胞；培養(yǎng)到72 h，第一次半定量換液，懸浮細(xì)胞降低，貼壁細(xì)胞逐漸增加，大量細(xì)胞爬出，它是細(xì)長的梭形、三角形、紡錘形；繼續(xù)培養(yǎng)到96 h 以后細(xì)胞密集生長，出現(xiàn)大片融合現(xiàn)象，呈漩渦狀，可進(jìn)行1 ∶2 傳代培養(yǎng)。 傳代到第3 代細(xì)胞均是呈長梭形，形態(tài)一致，具有較強(qiáng)的折光性，融合密度較高時可呈漩渦狀、魚群狀（圖1）。

圖1 原代BMSCs 細(xì)胞形態(tài)Figure 1 Morphology of primary BMSCs

傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的BMSCs 在36 h 僅觀察到少量細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)到48 h 進(jìn)行首次換液，觀察到細(xì)胞貼壁數(shù)量增加，繼續(xù)培養(yǎng)到第72 h，觀察到細(xì)胞尚未形成群落，排列分散，呈細(xì)長梭形；繼續(xù)培養(yǎng)到96 h，細(xì)胞密度可達(dá)50%以上，但仍需繼續(xù)培養(yǎng)，尚無法傳代（圖1）。

2.2 流式細(xì)胞鑒定

如圖2 所示，經(jīng)流式細(xì)胞儀對表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測，第3 代大鼠BMSCs 陰性對照為（0.55 ±0.73）%，高表達(dá)CD29、CD90，表達(dá)量分別為（91.18±1.29）%、（95.04±0.11）%，而低表達(dá)CD45，僅有（1.74±0.36）%，差異顯著（P＜0.001），證明分離培養(yǎng)的是大鼠BMSC（表1）。

表1 第3 代大鼠BMSCs 表面抗原表達(dá)Table 1 Expression of BMSCs surface antigens in the 3rd generation rats

圖2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原的表達(dá)Figure 2 Detection of cell surface antigen expression by flow cytometry

2.3 PKH26 標(biāo)記結(jié)果

第3 代細(xì)胞經(jīng)PKH26 染色24 h 后，在熒光顯微鏡下觀察呈紅色，熒光在細(xì)胞膜上分布均勻一致，標(biāo)記率為98%，染色前后BMSCs 細(xì)胞形態(tài)沒有變化（圖3）。

注：PKH26 標(biāo)記BMSCS 24 h 后。圖3 PKH26 標(biāo)記結(jié)果Note.24th hour of PKH26 marking BMSCS.Figure 3 PKH26 Mark results

2.4 CCK-8 法測定細(xì)胞生長曲線

PKH26 標(biāo)記組與未標(biāo)記組大鼠BMSCs 第2 天緩慢生長，第3 天加快生長，到第7 天達(dá)到生長增殖高峰期，第8 天至第10 天生長進(jìn)入平臺期，大體生長曲線表現(xiàn)為倒“S”形。 兩組細(xì)胞在460 nm 處的OD 值無顯著差異（P＞0.05），說明PKH26 標(biāo)記BMSCs 對增殖無顯著影響（圖4）。

圖4 PKH26 標(biāo)記組與未標(biāo)記組生長曲線的比較Figure 4 Comparison of growth curve between PKH26 labeled group and unlabeled group

2.5 成骨成脂誘導(dǎo)及染色結(jié)果

成骨誘導(dǎo)21 d 后觀察到大量細(xì)胞呈絮狀，結(jié)節(jié)狀生長，茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)，這種結(jié)節(jié)就是沉積下來的鈣鹽；成脂誘導(dǎo)14 d 后觀察到大量細(xì)胞內(nèi)含有空泡狀透亮圈，具有強(qiáng)折光性，油紅O 染色偏紅，是脂滴的形成（圖5）。

注：A：BMSCs 成骨誘導(dǎo)21 d 后茜素紅染色；B：BMSCs 成脂誘導(dǎo)14 d 后油紅O 染色。圖5 BMSCs 成骨茜素紅染色和成脂油紅O 染色Note.A， Alizarin red staining 21 days after osteogenesis of BMSCs.B， Oil red O staining after 14 days of lipogenic induction of BMSCs.Figure 5 BMSCs Alizarin red staining and fatty oil red O staining

3 討論

BMSCs 具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗纖維化等作用，在炎癥環(huán)境下，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射BMSCs 可能會增加骨異常增殖和異位鈣化的風(fēng)險［6］。 值得肯定的是，BMSCs 可以代替軟骨細(xì)胞進(jìn)行多次擴(kuò)增，對最終形成的組織幾乎沒有影響，這使它們成為組織工程中移植細(xì)胞來源的主要細(xì)胞［7］。 傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法如膠原酶消法、貼壁法和差速離心法等可培養(yǎng)BMSCs［8－10］，但短期內(nèi)大量提取細(xì)胞具有一定困難，因此，尋找一種快速高效且穩(wěn)定的分離純化途徑顯得尤為重要。 本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)大鼠BMSCs 采用大鼠5 d 乳鼠骨髓骨片法，傳代至第3 代，經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)鑒定高表達(dá)CD29、CD44、CD90，低表達(dá)CD45，并向成骨、成脂方向誘導(dǎo)，證明該方法可獲得純度較高的大鼠BMSCs。

近年來發(fā)現(xiàn)，BMSCs 已成為細(xì)胞移植、組織工程、基因治療等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)BMSCs 移植作為治療大鼠肺纖維化模型具有前景性的治療策略，能明顯緩解肺泡炎癥及肺纖維化［11］。 同時，腦動脈栓塞大鼠模型進(jìn)行BMSCs 移植的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BMSCs 可增加趨化因子和聚唾液酸化酶的表達(dá)，增加腦缺血條件下內(nèi)源性神經(jīng)元祖細(xì)胞的遷移，說明該機(jī)制可能有助于改善腦缺血［12］。 另外，間充質(zhì)干細(xì)胞對關(guān)節(jié)炎的修復(fù)作用機(jī)制已逐漸變得成熟，有研究表明BMSCs 可促進(jìn)軟骨修復(fù)［13－14］。 以上這些治療作用的關(guān)鍵在于移植過程中對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記來觀察其分化、存活及遷移。常用的標(biāo)記細(xì)胞方法包括DAPI 標(biāo)記、BrdU 標(biāo)記、Dil 標(biāo)記等，不過，這些熒光染料都有局限性，DAPI標(biāo)記是一種標(biāo)熒光染料，標(biāo)記細(xì)胞核，當(dāng)標(biāo)記的細(xì)胞死亡后會釋放出DAPI，不需要標(biāo)記的細(xì)胞也會被標(biāo)記出來，從而引起假陽性，且容易淬滅，不適合用于長期標(biāo)記［15］。 BrdU 標(biāo)記是通過免疫組化的方式進(jìn)行間接觀察，操作不方便，并且標(biāo)記的細(xì)胞死亡后會釋放出BrdU，與DAPI 類似，同樣會造成較高假陽性率［16］。 Dil 標(biāo)記細(xì)胞3 d 后會出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞毒性反應(yīng)，35 d 后能被檢測到的標(biāo)記細(xì)胞不足1／2，在體外細(xì)胞擴(kuò)增過程中染色的穩(wěn)定性低［17］。 因此，選擇一種合適的染料，對大鼠BMSCs 進(jìn)行標(biāo)記、示蹤尤為重要。

熒光染料PKH26 是一種新型染料，用于標(biāo)記活細(xì)胞可以發(fā)出強(qiáng)烈穩(wěn)定的紅色熒光。 被標(biāo)記的細(xì)胞與未被標(biāo)記的細(xì)胞相比，形態(tài)良好，沒有明顯的區(qū)別，標(biāo)記率為98%，這種方法能較好地檢測出體外細(xì)胞誘導(dǎo)分化的情況，或?qū)?biāo)記的細(xì)胞注射到動物體內(nèi)，便于觀察活體內(nèi)移植細(xì)胞的遷移情況，從而達(dá)到示蹤細(xì)胞的目的。 由于PKH26 染色方法簡便、毒性小，不用放射性同位素，安全系數(shù)高。 因此，PKH26 是大鼠BMSCs 的理想標(biāo)記方式，為大鼠BMSCs 在體內(nèi)遷移分化實(shí)驗(yàn)的后續(xù)研究打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。