王文博，汪清云，郭 衛(wèi)，夏 泠*

（1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院腹部腫瘤放化療科，武漢 430071；2.武漢大學(xué)泰康醫(yī)學(xué)院（基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）病理教研室，武漢 430071）

胃癌（gastric cancer）是常見的惡性消化道腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的重要原因［1］。 雖然目前的診斷手段上有較大的改進(jìn)，但大部分胃癌發(fā)病比較隱匿，確診時(shí)，患者已處于中晚期，這是導(dǎo)致胃癌患者生存率低、預(yù)后差的主要原因［2－3］，因此，篩選胃癌早期診斷標(biāo)志物仍是胃癌的研究熱點(diǎn)［3－4］。層粘連蛋白γ2（laminin subunit gamma 2，LAMC2）是異三聚體糖蛋白層黏連蛋白332（laminin-332，Ln-332）的γ2 亞基，是上皮基底膜的基本成分，調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、運(yùn)動，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)LACM2 與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展關(guān)系密切［5］。 LAMC2 在胰腺導(dǎo)管癌、卵巢癌、喉癌及肺癌等多種腫瘤中均高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），降低腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，已成為多種腫瘤的候選診治靶標(biāo)［6－9］。 但目前，LAMC2 的表達(dá)是否影響胃癌細(xì)胞的增殖，目前報(bào)道較少。 本研究利用腫瘤基因圖譜（cancer genome atlas，TCGA）、基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）等數(shù)據(jù)庫，結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)的檢測手段，觀察LAMC2 的表達(dá)對人胃癌細(xì)胞增殖的影響及可能調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人胃癌細(xì)胞（HGC-27、NCI-N87、SNU-1）均購自于國家模式與特色實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫，由本實(shí)驗(yàn)室保存；GES-1 人胃黏膜上皮細(xì)胞購自于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基（貨號：11875101）及優(yōu)質(zhì)胎牛血清（貨號：16000-044）購自于美國Gibco 公司； LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn) 染 試 劑 盒（ 貨 號：L3000015）購自美國Thermo Fisher 公司；RIPA 裂解液（貨號：LS-W-03268）、PBS（貨號：LS-P-0106）、甲醇（貨號：LS-H-0248）、結(jié)晶紫染色液（貨號：LS-H-012）、4%多聚甲醛（貨號：LS-P-113）及Western blot試劑盒（貨號：LS-H-128）購自于武漢靈思生物技術(shù)有限公司；LAMC2（貨號：ab274376）、PCNA （貨號：ab29）、PI3 Kinase p85 α （phospho Y607）（貨號：ab182651）、 pan-AKT （ 貨 號： ab8805） 及 AKT（phospho T308）（貨號：ab38449）抗體購自于英國Abcam 公司；CyclinD1（貨號：26939-1-AP）、GAPDH（貨號：60004-1-Ig）、c-Myc（貨號：10828-1-AP）及辣根過氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的二抗（貨號：APC-65210）購自于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)所需6 孔板、25 cm2培養(yǎng)瓶、96 孔板及15 mL 離心管購自美國Corning 公司。 陰性對照及LAMC2敲減siRNA 由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)及合成，序列參考課題組前期研究［9］。

BB150 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher 公司；Lightcycler480 型熒光定量PCR 儀購自美國羅氏公司；DM3000 正置熒光顯微鏡購自德國萊卡；Varioskan LUX 酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司；Mini Gel Tank 型垂直電泳槽購自美國Thermo Fisher 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 胃癌差異表達(dá)的基因篩選

基于| logFC |＞2 及P＜0.05 標(biāo)準(zhǔn)，edgeR R分析TCGA 及GEO 數(shù)據(jù)庫中GSE122530 數(shù)據(jù)，獲得胃 癌 差 異 表 達(dá) 基 因［9］。 通 過 CTD 數(shù) 據(jù) 庫（comparative toxicogenomics database，CTD，http：／ ／ctdbase.org／） 檢索與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因。 將TCGA、GEO 所獲得的差異基因與CTD 數(shù)據(jù)庫所檢索得到的細(xì)胞增殖相關(guān)基因聯(lián)合分析，以TCGA 及GEO 中上調(diào)倍數(shù)最大的基因?yàn)楹蜻x基因。 利用UALCAN（http：／ ／ualcan.path.uab.edu／index.html）及Kaplan Meier plotter 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／kmplot.com／analysis／）分析候選基因表達(dá)與胃癌臨床特征的關(guān)系。

1.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

GES-1、HGC-27、NCI-N87 及SNU-1 細(xì)胞復(fù)蘇后，均利用含有10%胎牛血清及1%雙抗（青霉素100 U／mL，鏈霉素100 μg／mL）的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，正常更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞數(shù)量鋪滿培養(yǎng)瓶80%左右時(shí)，按照1 ∶2～3 的比例傳代。

1.3.3 Western blot 檢測LAMC2 在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

參考課題組前期文獻(xiàn)方法［9］，收集GES-1 細(xì)胞及人胃癌細(xì)胞（HGC-27、NCI-N87、SNU-1），RIPA 裂解液（RIPA Lysis Buffer）裂解，提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒定量后，每組細(xì)胞按照20 mg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，以GAPDH（1 ∶10 000）為對照，LAMC2（1 ∶800）抗體4℃孵育過夜，TBST 漂洗3 次，每次5 min，加入HRP 標(biāo)記的兔抗二抗（1 ∶1000），37℃孵育2 h，TBST 漂洗，加入ECL 發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)拍照，ImageJ 2x 軟件分析各細(xì)胞中LAMC2 及GAPDH 的灰度值，以LAMC2 灰度值／GAPDH 灰度值的比值代表各細(xì)胞中LAMC2 的相對表達(dá)量。

1.3.4 LAMC2 敲減胃癌細(xì)胞模型構(gòu)建

按照1×105／孔處于對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞（HGC-27、NCI-N87）接種于6 孔板中，待細(xì)胞鋪滿6孔板底部時(shí)，參照LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書，Control 組給予4 μL LipofectamineTM3000＋196 μL OptiRPMI 處理；轉(zhuǎn)染組處理如下：4 μL LipofectamineTM3000＋196 μL Opti-MEM 孵育5 min后，將其分別加入40 μL si-NC siRNA＋60 μL Opti-MEM 和40 μL si-LAMC2 siRNA＋60 μL Opti-MEM的混合液中，混合后靜置30 min，將混合液分別添加至對應(yīng)的6 孔板中，6 h 更換成新的完全培養(yǎng)基。 轉(zhuǎn)染24 h 后，參考文獻(xiàn)［10］，Western blot 檢測LAMC2的表達(dá)，與Control 組、si-NC 組比較，LAMC2 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表示LAMC2 敲減胃癌細(xì)胞模型構(gòu)建成功；同時(shí)，比較si-LAMC2-1＃及si-LAMC2-2＃的敲減效率，篩選敲減效果最明顯的siRNA 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 EdU 檢測胃癌細(xì)胞增殖能力

按照1×105／孔處于對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞（HGC-27、NCI-N87）接種于6 孔板中，將胃癌細(xì)胞分成：Control 組、si-NC 組及si-LAMC2 組；各組細(xì)胞處理參照1.3.4，24 h 后，每孔細(xì)胞中加入總濃度為20 μmol／L 的EdU 工作液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，吸去培養(yǎng)基，37℃預(yù)熱PBS 漂洗3 次，每次3 ～5 min，4%多聚甲醛室溫固定20 min，熒光顯微鏡拍照，計(jì)算每組細(xì)胞中陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分比。

1.3.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞克隆形成能力

取對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞（HGC-27、NCIN87），按照1×103／孔接種于6 孔板中，分組同1.3.5。 細(xì)胞培養(yǎng)2 周后，觀察到每組培養(yǎng)孔形成團(tuán)狀細(xì)胞時(shí)，PBS 清洗3 次，5 min／次，4℃預(yù)冷甲醇固定細(xì)胞20 min，結(jié)晶紫染色1 h，超純水漂洗后晾干，倒置顯微鏡拍照，計(jì)數(shù)每組細(xì)胞中的總克隆數(shù)。

1.3.7 Western blot 檢測胃癌細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

取對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞（HGC-27、NCIN87），按照1×104／孔接種于6 孔板中，分組同1.3.5。 24 h 后，參考文獻(xiàn)［9］，以GAPDH（1：10 000）為對照，PCNA（1 ∶800）、CyclinD1（1 ∶800）及c-Myc（1 ∶1000）為一抗，Western blot 檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照，ImageJ2x 軟件分析各組細(xì)胞中各目的蛋白（PCNA、CyclinD1、c-Myc）及GAPDH 的灰度值，以各目的蛋白灰度值／GAPDH 灰度值的比值分別代表各目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3.8 Western blot 檢測胃癌細(xì)胞PI3K／Akt 通路激活情況

取對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞（HGC-27、NCIN87），按照1×104／孔接種于6 孔板中，分組同1.3.5。 參考文獻(xiàn)［9］， PI3Kp85（1 ∶1000）、PI3Kp85（phospho Y607）（1 ∶500）、Akt（1 ∶1000）及AKT（phospho T308）（1 ∶800）為一抗，Western blot 檢測各 組 胃 癌 細(xì) 胞 中 PI3Kp85、 PI3Kp85 （ phospho Y607）、Akt 及AKT（phospho T308）的相對表達(dá)量，評價(jià)各組細(xì)胞PI3K／Akt 通路激活情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

GraphPad Prism 6.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及繪圖，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較利用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。 以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LAMC2 在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

TCGA 及GSE122530 數(shù)據(jù)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，9 個(gè)基因與細(xì)胞增殖相關(guān)，其中LAMC2 上調(diào)倍數(shù)最大（圖1A），為此，LAMC2 為研究的候選基因。 胃腺癌是胃癌主要病理表現(xiàn)形式［1－3］，利用UALCAN 及Kaplan Meier plotter 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，LAMC2 在胃腺癌中的表達(dá)顯著升高（P＜0.01），見圖1B。LAMC2 表達(dá)與胃腺癌的分期（P＜0.01）、分級（P＜0.01）及生存密切相關(guān)（P＜0.05），如圖1C ～1E。Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞中（HGC-27、NCIN87、SNU-1）中LAMC2 的表達(dá)顯著高于GES-1 細(xì)胞（F＝93.780，P＝0.000），如圖1F、1G。 其中，HGC-27 細(xì)胞中LAMC2 表達(dá)量最低，NCI-N87 細(xì)胞中LAMC2 表達(dá)量最高，同時(shí)，參考文獻(xiàn)［11－12］及中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫及本實(shí)驗(yàn)室胃癌細(xì)胞種源保藏情況，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用HGC-27 及NCI-N87 細(xì)胞進(jìn)行研究。

2.2 LAMC2 在si-LAMC2 組中胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，在HGC-27 細(xì)胞中，si-NC 組中LAMC2 的表達(dá)與Control 組無顯著變化（t＝0.379，P＝0.724）；si-LAMC2-1＃、si-LAMC2-2＃胃癌細(xì)胞中LAMC2 的表達(dá)均顯著低于si-NC 組（t＝6.774、16.290，P＝0.002、0.000）；與si-LAMC2-1＃比較，si-LAMC2-2＃中LAMC2 蛋白表達(dá)顯著降低（t＝13.610，P＝0.000），如圖2A 所示。 在NCI-N87 細(xì)胞中，得到類似的結(jié)果。 同時(shí)，在HGC-27 及NCIN87 細(xì)胞中，si-LAMC2-2＃具有更高的抑制效率，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用si-LAMC2-2＃構(gòu)建LAMC2 敲減胃癌細(xì)胞模型。 如圖2 所示。

2.3 LAMC2 對胃癌細(xì)胞增殖的影響

HGC-27 細(xì)胞中，si-NC 組細(xì)胞EdU 陽性率與Control 組無顯著差異（t＝1.549，P＝0.196）；si-LAMC2 組細(xì)胞EdU 陽性率較si-NC 組顯著減少（t＝6.540，P＝0.002）。 NCI-N87 細(xì)胞中，si-NC 組細(xì)胞EdU 陽性率與Control 組無顯著差異（t＝0.126，P＝0.906）；si-LAMC2 組細(xì)胞EdU 陽性率較si-NC 組顯著降低（t＝8.352，P＝0.001）。 以上暗示抑制LAMC2 后，可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖。 見圖3，表1。

表1 各組EdU 陽性細(xì)胞比例（±s）Table 1 Edu-positive cells rate in each group

表1 各組EdU 陽性細(xì)胞比例（±s）Table 1 Edu-positive cells rate in each group

注：HGC-27 細(xì)胞中，與陰性對照組比較， **P＜0.01；NCI-N87 細(xì)胞中，與陰性對照組比較， ＃＃P＜0.01。Note.In HGC-27 cells， compared with si-NC group， **P＜0.01.In NCIN87 cells， compared with si-NC group， ＃＃P＜0.01.

組別Groups HGC-27 EdU 陽性率（%）Edu positive cell rate NCI-N87 EdU 陽性率（%）Edu positive cell rate空白對照組Control group 71.12±6.55 66.34±6.56陰性對照組si-NC group 63.00±6.08 65.33±6.43 LAMC2 敲減組si-LAMC2 group 30.67±6.03** 25.67±5.13＃＃F 35.280 43.380 P 0.000 0.000

2.4 LAMC2 對胃癌細(xì)胞克隆形成能力的影響

通過細(xì)胞克隆數(shù)量檢測分析：HGC-27 細(xì)胞中，si-NC 組細(xì)胞克隆數(shù)與Control 組比較，無顯著變化（t＝0.519，P＝0.631）；與si-NC 組比較，si-LAMC2組較si-NC 組，細(xì)胞克隆數(shù)顯著減少（t＝11.420，P＜0.01）。 NCI-N87 細(xì)胞中，si-NC 組細(xì)胞克隆數(shù)與Control 組比較，無顯著變化（t＝0.484，P＝0.654）；si-LAMC2 組細(xì)胞克隆數(shù)較si-NC 組，顯著降低（t＝12.760，P＜0.01）。 見圖4，表2。

表2 各組細(xì)胞克隆數(shù)量（±s）Table 2 Number of cell clones in each group

表2 各組細(xì)胞克隆數(shù)量（±s）Table 2 Number of cell clones in each group

注：HGC-27 細(xì)胞中，與陰性對照組比較， **P＜0.01；NCI-N87 細(xì)胞中，與陰性對照組比較， ＃＃P＜0.01。Note.In HGC-27 cells， compared with si-NC group， **P＜0.01.In NCIN87 cells， compared with si-NC group， ＃＃P＜0.01.

組別Groups HGC-27克隆數(shù)（n）Number of cell clones NCI-N87克隆數(shù)（n）Number of cell clones空白對照組Control group 609.67±18.15 457.27±24.12陰性對照組si-NC group 594.16±29.37 439.00±35.34 LAMC2 敲減組si-LAMC2 group 148.54±18.03** 110.42±18.58＃＃670.500 156.200 P 0.000 0.000 F

圖4 克隆形成能力檢測胃癌細(xì)胞增殖Figure 4 Proliferation of gastric cancer cells detected by clone formation ability

2.5 LAMC2 對胃癌細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響

Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)：HGC-27 細(xì)胞中，Control組PCNA、CyclinD1 及c-Myc 的表達(dá)分別為（0.58±0.05）、（0.68 ± 0.03）、 （0.66 ± 0.03）， si-NC 組CyclinD1、PCNA 及c-Myc 的表達(dá)分別為（0.59±0.02）、（0.67±0.03）、（0.65±0.03），si-LAMC2 組CyclinD1、PCNA 及c-Myc 的表達(dá)分別為（0.35±0.02）、（0.26±0.01）、（0.32±0.04），與si-NC 組比較，si-LAMC2 顯著抑制CyclinD1（t＝27.630，P＜0.01）、PCNA（t＝11.340，P＜0.01）及c-Myc（t＝11.340，P＜0.01）的表達(dá)。 NCI-N87 細(xì)胞中得到類似的結(jié)果。 見圖5。

注：HGC-27 細(xì)胞中，與陰性對照組比較， **P＜0.01；NCI-N87 細(xì)胞中，與陰性對照組比較， ＃＃P＜0.01。圖5 Western blot 檢測細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)Note.In HGC-27 cells， compared with si-NC group， **P＜0.01.In NCI-N87 cells， compared with si-NC group， ＃＃P＜0.01.Figure 5 Expression of proliferation-related proteins detected by Western blot

2.6 LAMC2 對胃癌細(xì)胞PI3K／Akt 通路激活的影響

如圖6 所示，Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)：HGC-27 細(xì)胞中，Control 組PI3Kp85（phospho Y607） 及Akt（phospho T308）的表達(dá)分別為（0.66±0.02）、（0.56±0.04）；si-NC 組PI3Kp85（phospho Y607）及Akt（phospho T308）的表達(dá)分別為（0.65±0.01）、（0.54±0.06）；si-LAMC2 組PI3Kp85（phospho Y607）及Akt（phospho T308）的表達(dá)分別為（0.24±0.03）、（0.18±0.04），與Control 組比較，si-NC 對PI3Kp85（phospho Y607） （t＝1.331，P＝0.254） 及Akt（phospho T308）（t＝0.308，P＝0.773）的表達(dá)無顯著影響。 與 si-NC 組 比 較， si-LAMC2 顯 著 抑 制PI3Kp85（phospho Y607）（t＝20.570，P＜0.01）及Akt（phospho T308）（t＝8.437，P＜0.01）的表達(dá)顯著降低。 NCI-N87 細(xì)胞中得到類似的結(jié)果。

注：HGC-27 細(xì)胞中，與陰性對照組比較， **P＜0.01；NCI-N87 細(xì)胞中，與陰性對照組比較， ＃＃P＜0.01。圖6 Western blot 檢測胃癌細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt 表達(dá)Note.In HGC-27 cells， compared with si-NC group， **P＜0.01.In NCI-N87 cells， compared with si-NC group， ＃＃P＜0.01.Figure 6 Expression of p-PI3K and p-Akt in gastric cancer cells detected by Western blot

3 討論

胃癌是常見惡性消化道腫瘤之一，是引起全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要惡性腫瘤，嚴(yán)重影響人類的身體健康和生活質(zhì)量［1，13－14］。 我國是胃癌發(fā)病率較高的國家之一，約占全球病例的40%［12］。 手術(shù)切除和／或化療是胃癌目前臨床主要治療策略，但由于胃癌確診時(shí)已處于中晚期，導(dǎo)致胃癌患者5 年總生存率仍低于20%，并出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差［15－17］。 因此，深入探討胃癌發(fā)生及進(jìn)展的分子機(jī)制，篩選胃癌早期診斷靶標(biāo)，對胃癌患者的診治均具有重要意義。

LAMC2 是laminins 家族成員，作為Ln-332 的γ2 亞基，參與細(xì)胞增殖、侵襲、粘附及遷移等生物學(xué)的過程［18］。 但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，LACM2 單亞基與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展關(guān)系密切［5］。 LAMC2 在喉癌中的表達(dá)顯著升高，其表達(dá)量與喉癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和總生存期相關(guān)，LAMC2 可顯著促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖［19］。 在卵巢癌中，LAMC2 的表達(dá)較癌旁組顯著升高，抑制LAMC2的表達(dá)顯著降低卵巢癌細(xì)胞的增殖及侵襲；作為miR-5580-3p 的靶基因，LAMC2 的表達(dá)可被miR-5580-3p 顯著抑制［20］。 陰莖鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤組織及血清中LAMC2 的表達(dá)均顯著升高，LAMC2 可影響細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，LAMC2 可作為陰莖鱗狀細(xì)胞癌潛在的診治靶標(biāo)［21］。 LAMC2 在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)顯著升高，沉默LAMC2 可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，上調(diào)N-cad、vimentin，下調(diào)E-cad 蛋白表達(dá)，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程［22］。 多組學(xué)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，LAMC2 在多種腫瘤的表達(dá)顯著上高，LAMC2 的表達(dá)不利于泛癌的臨床預(yù)后，并跟多種腫瘤免疫浸潤相關(guān)［23］。 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，抑制LAMC2 后，胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力被顯著抑制［9］。 本研究首先通過TCGA、GEO 及介導(dǎo)細(xì)胞增殖相關(guān)基因聯(lián)合分析篩選影響胃癌增殖的相關(guān)差異表達(dá)的候選基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMC2 在胃癌中的表達(dá)顯著升高，與胃癌患者的分級、分期及生存等臨床病理相關(guān)；體外實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，LAMC2 的表達(dá)與胃癌細(xì)胞的增殖關(guān)系密切。

磷脂酰肌醇3－激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）／蛋白激酶B（Portein kinase B，PKB）信號通路在胃癌、肝癌、肺癌等腫瘤中均被顯著激活，參與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展［24］。 PI3K／Akt 通路激活與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移、EMT、免疫微環(huán)境和耐藥密切相關(guān)，該通路抑制劑可顯著抑制腫瘤的進(jìn)展［25－26］。 PI3K／Akt 通路可促進(jìn)CyclinD1、p21、PCNA、c-Myc 等相關(guān)蛋白的表達(dá)，繼而促進(jìn)細(xì)胞增殖［27－29］。 LAMC2 可通過激活PI3K／Akt 通路促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌中腫瘤干細(xì)胞的侵襲及遷移，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的增殖及復(fù)發(fā)［30］；LAMC2 可通過integrinβ1／FAK／Src 激活A(yù)KT 促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［31］；LAMC2 可通過EGFR／ERK1／2 通路激活A(yù)kt，導(dǎo)致胰腺導(dǎo)管癌的進(jìn)展［32］；LAMC2 可激活PI3K／Akt 通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，抑制其對吉西他濱的敏感性［33］。 以上研究說明LAMC2 可通過直接或者間接激活PI3K／Akt 通路，參與腫瘤的進(jìn)展。 本研究檢測發(fā)現(xiàn)，抑制LAMC2的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞中PI3K／Akt 通路被顯著抑制，降低PCNA、CyclinD1 及c-Myc 等細(xì)胞增殖等相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞增殖，初步說明，LAMC2可通過激活PI3K／Akt 促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。

綜上所述，初步說明LAMC2 在胃癌中的表達(dá)顯著上調(diào)，與胃癌的分期、分級及生存等臨床組織病理相關(guān)，LAMC2 可通過激活PI3K／Akt 通路促進(jìn)細(xì)胞增殖。 但本研究僅局限于細(xì)胞水平，后續(xù)還需利用動物及臨床水平深入研究LAMC2 與胃癌細(xì)胞增殖的關(guān)系及其影響PI3K／Akt 的具體作用機(jī)制。