鮑 丹，郭 蕊，侯道榮

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所），北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，南京 210000；2.南京醫(yī)科大學(xué)，南京 210000）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種由于胰島素分泌缺陷和／或胰島素生物作用受損所致的，以高血糖為特征的代謝性疾病。 國際糖尿病聯(lián)合會(huì)最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，2021 年，全球20 ～79 歲的人群DM 患病率為10.5%（5.366 億人），預(yù)計(jì)到2045 年將上升至12.2%（7.832 億人）［1］。 據(jù)報(bào)道，全球30%～97%DM 患者可能有皮膚病變或并發(fā)皮膚病［2］。 在中國大慶糖尿病研究中，DM 患者皮膚病的患病率為93.7%，75.7%的DM 患者有兩種或兩種以上的皮膚?。?］，且DM 患者的皮膚病變多發(fā)生在DM 診斷之前［4］，因此，皮膚的病理性改變對DM的初步識(shí)別和診斷具有重要意義。

創(chuàng)面愈合障礙是DM 最常見、最嚴(yán)重的皮膚并發(fā)癥之一，也是當(dāng)前DM 治療中的一個(gè)重要醫(yī)學(xué)問題。 DM 患者更容易出現(xiàn)慢性傷口，如糖尿病腿和足潰瘍。 研究報(bào)道，DM 患者慢性傷口的終生患病風(fēng)險(xiǎn)為12%～25%［5］。 DM 患者的慢性創(chuàng)傷已成為非創(chuàng)傷性下肢截肢的主要原因（在美國，每年約有65 700 例），并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［6］。 現(xiàn)階段，關(guān)于DM 創(chuàng)面愈合障礙發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍不完全清楚。

本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)皮膚受到損傷時(shí)，創(chuàng)面近端的角質(zhì)形成細(xì)胞中角蛋白17（keratin 17，KRT17）的表達(dá)顯著升高；而T2DM 小鼠創(chuàng)面中KRT17 的表達(dá)較對照組小鼠顯著下調(diào)。 KRT17 是一種I 型角蛋白，在正常生理情況下，KRT17 主要表達(dá)于皮膚的附屬物中；在某些疾病，如銀屑病、乳腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、胃癌等惡性腫瘤中，KRT17 異常過表達(dá)［7－8］。 現(xiàn)階段，關(guān)于KRT17 的研究主要集中在其對銀屑病的調(diào)控作用和潛在的臨床治療方面。 在銀屑病的皮膚中，上調(diào)的KRT17 與T 細(xì)胞及細(xì)胞因子形成一個(gè)自身免疫環(huán)路［9］；下調(diào)KRT17 的表達(dá)可減輕銀屑病模型小鼠皮損的嚴(yán)重程度［10］。然而，KRT17 在T2DM 創(chuàng)面愈合中的研究仍較少，因此，本文旨在結(jié)合前期研究結(jié)果通過Krt17 基因敲除小鼠（Krt17－／－）分析Krt17 基因敲除對T2DM小鼠的創(chuàng)面愈合的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為野生型（wild type，WT）C57BL／6J（雄性30 只）SPF 級(jí)小鼠和Krt17－／－（雄性30 只）SPF 級(jí)小鼠，5～6 周齡，體重18 ～20 g，由南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（蘇）2021－0001］，小鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)屏障設(shè)施的飼養(yǎng)間［SYXK（蘇）2022－0017］，飼養(yǎng)間溫度（23±2）℃，12 h／12 h 明／暗燈照，動(dòng)物自由飲水和攝食。 實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物操作程序均遵循3R 原則并已取得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)（2022-DW-026）。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（S0130）購自美國Sigma-Aldrich 公司；檸檬酸鈉（＃C12931024）和檸檬酸（＃C13056322）購自上海麥克林生化科技有限公司；KRT17 抗體（＃4543）購自美國Cell Signaling Technology 公司；60%高脂飼料購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。 電泳儀和電泳槽購自Bio-Rad 公司；組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)和熒光顯微鏡均購自德國Leica 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高脂飲食和STZ 聯(lián)合誘導(dǎo)T2DM 小鼠模型并建立創(chuàng)面模型

選用5 周齡雄性WT 小鼠和Krt17－／－小鼠普通飼料飼養(yǎng)1 周適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分成6 組：WT 空白組、Krt17－／－空白組、WT 對照組、Krt17－／－對照組、WTT2DM 組和Krt17－／－-T2DM 組（n＝10）。 空白組小鼠普通飲料喂養(yǎng)且不制造任何傷口；對照組小鼠繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，T2DM 組小鼠60%高脂飼養(yǎng)喂養(yǎng)；4周后，T2DM 組小鼠腹腔注射STZ，劑量為40 mg／（kg·d），連續(xù)注射5 d，對照組小鼠腹腔注射同等量的生理鹽水；STZ 注射1 周后，對照組和T2DM 組小鼠禁食12 h 后檢測血糖，空腹血糖值≥11.1 mmol／L 視為T2DM 造模成功［11－13］。 T2DM 造模成功后1 周，小鼠異氟烷全身麻醉，背部剃毛，用6 mm環(huán)鉆制造在體的皮膚圓形損傷，T2DM 組分為T2DM空白組（未制造創(chuàng)面）和T2DM 對照組（制造創(chuàng)面）。

1.3.2 免疫熒光染色和Western blot 檢測KRT17在創(chuàng)面愈合中的定位和表達(dá)

于制造創(chuàng)面后第8 天，安樂死犧牲小鼠，取對照組和T2DM 組小鼠創(chuàng)面周圍2 mm 的皮膚組織，一部分進(jìn)行4%多聚甲醛固定24 h 后進(jìn)行修塊、脫水、包埋和切片；一部分進(jìn)行RIPA 裂解液裂解、勻漿提取皮膚總蛋白。 免疫熒光染色和Western blot 檢測KRT17 的定位和表達(dá)。

1.3.3 創(chuàng)面愈合速率的計(jì)算

于制造創(chuàng)面后的第0、2、4、6 和8 天拍照記錄，運(yùn)用ImageJ 軟件定量分析創(chuàng)面愈合速率，創(chuàng)面愈合速率＝（基線創(chuàng)面面積－第n天創(chuàng)面面積）／基線創(chuàng)面面積×100%。

1.3.4 創(chuàng)面愈合近端皮膚的病理組織學(xué)觀察

于制造創(chuàng)面后第8 天，安樂死犧牲小鼠，取對照組和T2DM 組小鼠創(chuàng)面周圍2 mm 的組織，進(jìn)行4%多聚甲醛固定24 h 后進(jìn)行修塊、脫水、包埋、切片和蘇木素－伊紅（haematoxylin-eosin，HE）染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食和STZ 聯(lián)合誘導(dǎo)T2DM 小鼠和創(chuàng)面愈合模型的建立

本研究采用高脂飲食和STZ 聯(lián)合誘導(dǎo)的方法建立T2DM 小鼠模型，T2DM 造模成功后，再進(jìn)行創(chuàng)面愈合模型的建立（圖1A）。 STZ 注射前，與正常飲食的對照組小鼠相比，WT-T2DM 和Krt17－／－-T2DM組小鼠60%高脂飲食4 周后，均表現(xiàn)出體重顯著升高的表型（P＜0.001，圖1B）；STZ 注射后1 周，與STZ 注射前相比，WT-T2DM 和Krt17－／－-T2DM 組小鼠的體重均顯著下降（P＜0.001，圖1B），呈現(xiàn)臨床上T2DM 患者體重減輕的表型。 于STZ 注射1 周后，對4 組小鼠禁食12 h 后的空腹血糖檢測發(fā)現(xiàn)，與WT 對 照 組和Krt17－／－對 照 組 小 鼠 相比，WTT2DM 組和Krt17－／－-T2DM 組小鼠的空腹血糖值均顯著升高，且均≥11.1 mmol／L（P＜0.001，圖1C），表明高脂飲食和STZ 聯(lián)合誘導(dǎo)T2DM 小鼠造模成功。

注：A：高脂飲食和STZ 聯(lián)合誘導(dǎo)T2DM 小鼠和創(chuàng)面愈合模型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；B：STZ 注射前后的體重；C：STZ 注射1 周后的空腹血糖。 與WT 對照組和Krt17－／－對照組相比， ***P＜0.001；與處理前后相比， ＃＃＃P＜0.001。圖1 高脂飲食和STZ 聯(lián)合誘導(dǎo)T2DM 小鼠和創(chuàng)面愈合模型的建立Note.A， Experimental design of high-fat diet combined with STZ to induce T2DM mice and wound healing models.B， Body weight before and after STZ injection.C， Fasting blood glucose after STZ injection 1 week.Compared with WT control group and Krt17－／－ control group， ***P＜0.001.Compared with before and after treatment， ＃＃＃P＜0.001.Figure 1 Establishment of T2DM and wound healing mice model induced by high-fat diet combined with STZ

2.2 KRT17 在T2DM 小鼠創(chuàng)面皮膚組織中的表達(dá)顯著下調(diào)

高脂飲食和STZ 聯(lián)合誘導(dǎo)T2DM 小鼠造模成功后，對WT 和T2DM 組小鼠在背部制造6 mm 在體的皮膚圓形損傷，于制造創(chuàng)面后第8 天，取WT 空白組和T2DM 空白組小鼠的皮膚及WT 對照組和T2DM對照組小鼠創(chuàng)面周圍2 mm 的皮膚組織，檢測KRT17 的表達(dá)水平。 結(jié)果顯示，在未制造創(chuàng)面的情況下，WT 和T2DM 小鼠皮膚組織中KRT17 的表達(dá)水平無顯著差別；制造在體皮膚創(chuàng)面后，WT 和T2DM 小鼠創(chuàng)面周圍皮膚組織中KRT17 的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.001，P＜0.01，圖2）；但與WT對照組小鼠相比，T2DM 小鼠創(chuàng)面周圍皮膚組織中KRT17 的表達(dá)顯著降低（P＜0.001，圖2）。 IF 染色的檢測結(jié)果與Western blot 結(jié)果趨勢一致，即在未制造創(chuàng)面情況下，KRT17 主要定位在毛囊中，WT 和T2DM 小鼠無顯著差異；制造在體皮膚創(chuàng)面后，WT和T2DM 小鼠創(chuàng)面近端的角質(zhì)形成細(xì)胞中KRT17的表達(dá)均顯著升高，但與WT 小鼠相比，T2DM 小鼠創(chuàng)面近端的角質(zhì)形成細(xì)胞中KRT17 的表達(dá)水平較低（圖2C）。

注：A：Western blot 檢測KRT17 在WT 空白組和T2DM 空白組（未制造創(chuàng)面）皮膚組織及WT 對照組和T2DM 對照組小鼠創(chuàng)面周圍皮膚組織中的表達(dá)，內(nèi)參：GAPDH；B：運(yùn)用ImageJ 軟件分析密度定量KRT17 的相對表達(dá)水平；C：IF 檢測KRT17 在WT 和T2DM 空白組及WT 和T2DM 對照組小鼠創(chuàng)面周圍皮膚組織中的表達(dá)。 藍(lán)色：DAPI，細(xì)胞核；綠色：KRT17。 與WT 空白組和T2DM 空白組相比， ＃＃P＜0.01， ＃＃＃P＜0.001；與WT 對照組相比， ***P＜0.001。圖2 KRT17 在正常小鼠和T2DM 小鼠創(chuàng)面愈合皮膚中的表達(dá)Note.A， Expression of KRT17 in skin tissue of WT blank group， T2DM blank group， WT control group and T2DM control group mice detected by Western blot， using GAPDH as normalization.B， Relative expression level of KRT17 quantified by densitometric analysis using ImageJ software.C，Expression of KRT17 in skin tissue of WT blank group， T2DM blank group， WT control group and T2DM control group mice detected by IF.Blue，DAPI， cell nucleus.Green， KRT17.Compared with WT blank group and T2DM blank group， ＃＃P＜0.01， ＃＃＃P＜0.001.Compared with WT control group， ***P＜0.001.Figure 2 Expression of KRT17 in wound healing skin tissue of normal and T2DM mice

2.3 Krt17 基因敲除減慢T2DM 小鼠的創(chuàng)面愈合速率

于制造創(chuàng)面后的第0、2、4、6 和8 天分別對4 組小鼠的創(chuàng)面拍照記錄，運(yùn)用ImageJ 軟件定量分析創(chuàng)面愈合速率發(fā)現(xiàn)，在正常生理情況下，與WT 組小鼠相比，Krt17－／－組小鼠的創(chuàng)面愈合速率顯著減慢，制造創(chuàng)面后的第8 天，WT 組小鼠創(chuàng)面愈合率達(dá)到88.94%，而Krt17－／－組 小 鼠 僅 為 78.06% （P＜0.001），表明在正常生理情況下，Krt17 基因敲除對正常的創(chuàng)面愈合產(chǎn)生一定的影響。 在糖尿病病理情況下，與同一品系的對照組小鼠創(chuàng)面愈合率相比，WT-T2DM 和Krt17－／－-T2DM 模型小鼠的創(chuàng)面愈合速率分別顯著減慢37.65%和49.83%（P＜0.01，P＜0.001），表明T2DM 存在創(chuàng)面愈合障礙；此外，與WT-T2DM 組小鼠相比，Krt17－／－-T2DM 組小鼠的創(chuàng)面愈合速率顯著減慢，表明Krt17 基因敲除加劇了T2DM 創(chuàng)面愈合障礙的表型（圖3）。

注：A：制造創(chuàng)面后的第0、2、4、6 和8 天的照片；B：運(yùn)用ImageJ 軟件定量分析創(chuàng)面愈合速率。 與WT 對照組和Krt17－／－對照組相比， **P＜0.01， ***P＜0.001；與WT 對照組和WT-T2DM 組相比， ＆P＜0.05， ＆＆P＜0.01， ＆＆＆P＜0.001。圖3 WT 和Krt17－／－小鼠在正常生理和糖尿病病理情況下的創(chuàng)面愈合速率Note.A， Photos taken on days 0， 2， 4， 6 and 8 after wound made.B， Wound healing rate quantified by ImageJ software.Compared with WT control group and Krt17－／－ control group， **P＜0.01， ***P＜0.001； Compared with WT control group and WT-T2DM group， ＆P＜0.05， ＆＆P＜0.01， ＆＆＆P＜0.001.Figure 3 Wound healing rate in WT and Krt17－／－ mice under normal physiology and diabetic pathology

2.4 Krt17 基因敲除小鼠創(chuàng)面病理組織學(xué)變化

于制造創(chuàng)面后第8 天，分別取4 組小鼠創(chuàng)面周圍2 mm 的皮膚組織，進(jìn)行病理組織學(xué)表型分析（圖4）。 結(jié)果顯示，對照組：WT 小鼠創(chuàng)面幾乎完全愈合，新生表皮較周圍組織無顯著差別；Krt17－／－組小鼠仍可見明顯的創(chuàng)面床，且創(chuàng)面新生表皮較周圍組織顯著增厚。 T2DM 組：與對照組小鼠相比，WTT2DM 組和Krt17－／－-T2DM 組小鼠創(chuàng)面愈合均顯著延遲，且Krt17－／－-T2DM 組小鼠創(chuàng)面近端有較多的炎性細(xì)胞浸潤，創(chuàng)面局部仍處于持續(xù)的炎癥狀態(tài)。

注：創(chuàng)面周圍2 mm 的皮膚HE 染色觀察。圖4 WT 和Krt17－／－小鼠在正常生理和糖尿病病理情況下的皮膚病理組織學(xué)表型分析Note.Magnification of HE-stain sections of skin tissue around wound 2 mm.Figure 4 Histopathological phenotyping analysis of WT and Krt17－／－ mice under normal physiology and diabetic pathology

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在T2DM 小鼠創(chuàng)面近端皮膚組織中，KRT17 的表達(dá)水平較WT 對照組小鼠顯著降低；Charles 等［14］利用互補(bǔ)的DNA 微陣列技術(shù)比較愈合的和未愈合的腿慢性傷口的差異表達(dá)基因時(shí)也發(fā)現(xiàn)，與正常皮膚創(chuàng)面愈合相比，在未愈合的慢性傷口中，Krt17 是前15 個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因之一；提示KRT17 表達(dá)水平的下調(diào)可能阻礙了T2DM 慢性傷口的創(chuàng)面愈合。 隨后，在對WT 和Krt17－／－小鼠進(jìn)行T2DM 創(chuàng)面造模后的觀察中發(fā)現(xiàn)，與WT 小鼠相比，Krt17－／－小鼠表現(xiàn)出明顯的創(chuàng)面愈合延遲和炎癥反應(yīng)持續(xù)的表型，說明Krt17 基因敲除加劇了T2DM小鼠的創(chuàng)面愈合障礙。

創(chuàng)面愈合由4 個(gè)高度整合和重疊的階段組成：止血、炎癥、增殖和組織重構(gòu)［15］，表皮層的角質(zhì)形成細(xì)胞、真皮層的成纖維細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞［16］以及各種炎癥免疫細(xì)胞共同參與一系列的細(xì)胞和分子創(chuàng)面愈合過程。 當(dāng)皮膚發(fā)生損傷時(shí)，角質(zhì)形成細(xì)胞能迅速被激活并產(chǎn)生各種重要的皮膚屏障損傷相關(guān)分子，吸引和／或激活免疫細(xì)胞對損傷信號(hào)提供及時(shí)和長期的保護(hù)。 同時(shí)，創(chuàng)面近端的角質(zhì)形成細(xì)胞也暫時(shí)中止末端分化，細(xì)胞大小形狀、細(xì)胞之間的聯(lián)系和細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附等方面的蛋白翻譯也發(fā)生巨大變化，為創(chuàng)面愈合的遷移和增殖做準(zhǔn)備［17］。

研究證實(shí)，KRT17 是關(guān)鍵的皮膚屏障損傷相關(guān)的重要分子之一［17］，皮膚損傷時(shí)，角質(zhì)形成細(xì)胞中的KRT17 迅速被激活，持續(xù)表達(dá)至創(chuàng)面愈合的重構(gòu)階段，直至皮膚屏障功能恢復(fù)。 激活的磷酸化的KRT17 與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，Mtor）通路的正調(diào)控因子14-3-3σ蛋白特異性相互作用［18］，通過激活Mtor—蛋白激酶B（protein kinases B，AKT）通路促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，促進(jìn)創(chuàng)面愈合［19］。 本研究中Krt17－／－-T2DM 小鼠表現(xiàn)出明顯的創(chuàng)面愈合延遲，可能與Krt17 基因缺失后，Mtor-AKT 信號(hào)下調(diào)有關(guān)；此外，Krt17－／－-T2DM 小鼠創(chuàng)面局部持續(xù)的炎癥狀態(tài)也是導(dǎo)致其創(chuàng)面愈合障礙的一個(gè)重要因素［20］。

如前所述，角蛋白是創(chuàng)面愈合過程中角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的第一波重要的皮膚屏障損傷相關(guān)的分子，為細(xì)胞提供錨定骨架、調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖／分化和炎癥反應(yīng)［21］，在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，角蛋白敷料可通過增強(qiáng)小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞的活化從而加速創(chuàng)面愈合和再上皮化［22－23］。 由此可見，角蛋白的補(bǔ)充在促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面有很大的前景。 本研究發(fā)現(xiàn)KRT17 在T2DM 小鼠創(chuàng)面中表達(dá)下調(diào)，且敲除Krt17 加劇了T2DM 小鼠的創(chuàng)面愈合，這一發(fā)現(xiàn)為角蛋白在臨床上治療T2DM 創(chuàng)面愈合障礙的應(yīng)用研發(fā)提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。