王 劍孫永東周興瑋劉 雷童興科陳 龍何 嫻*

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院，耳鼻咽喉頭頸外科，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川 瀘州 646000）

喉癌起源于喉黏液上皮組織的惡性腫瘤，多為鱗狀細(xì)胞癌。 發(fā)病率占全身性癌癥的1.5%［1］。 盡管對(duì)早期喉部鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行手術(shù)干預(yù)有很好的治療效果，但對(duì)晚期和轉(zhuǎn)移性腫瘤患者來說臨床治療效果較差，放療和化療是晚期病例的主要治療方法，但有許多患者對(duì)放療敏感或耐藥［2］，導(dǎo)致晚期喉癌5 年生存率僅有51%左右［3］。 喉癌具有易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害著人類的生命健康，因此確定喉癌的進(jìn)展和分子調(diào)控機(jī)制，尋找新型治療藥物，并為喉癌患者制定新的治療策略迫在眉睫。

自噬是一種溶酶體降解的途徑，可以阻礙早期癌癥的發(fā)生，又可以促進(jìn)晚期腫瘤的發(fā)展［4］。 當(dāng)細(xì)胞自噬發(fā)生異常的時(shí)候，會(huì)打破平衡導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，將自噬抑制劑與已建立的癌癥治療相結(jié)合可以提高癌癥細(xì)胞的耐受性，起到更好的治療作用［5］。microRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約為20 ～24 個(gè)核苷酸，通過與mRNA 互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)［3］。 由于miRNA 發(fā)揮著類似于癌基因或抑癌基因的作用，因此通過外源補(bǔ)充miRNA 或miRNA 抑制物可以調(diào)控mRNA 及其蛋白的表達(dá)，從而控制腫瘤惡性增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡［6］。 其中miR-499 被檢測(cè)出有多重靶標(biāo)，可以通過調(diào)控基因表達(dá)對(duì)多種惡性腫瘤發(fā)揮抑癌作用［7］。 根據(jù)生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，HDAC1 與miR-449a 有靶向結(jié)合位點(diǎn)。最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-449a 能夠通過靶向抑制HDAC1的表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［8］。 多項(xiàng)研究表明，HDAC 可以調(diào)節(jié)各種癌癥的晚期惡性腫瘤和化療耐藥性，其在喉癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)［9］。

黃芩素是我國(guó)傳統(tǒng)中藥黃芩的主要有效成分。黃芩素對(duì)多種惡性腫瘤有抑制作用，包括肝癌、結(jié)腸癌等［10－12］。 同時(shí)，近年來的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素對(duì)喉癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲也具有明顯的抑制作用，且可以誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡和自噬［13－15］。 基于上述研究背景，本實(shí)驗(yàn)將miR-449a 的表達(dá)情況與黃芩素抑制喉癌細(xì)胞的作用聯(lián)系起來，探究了miR-449a 的靶點(diǎn)，以此深入探究黃芩素的抑癌機(jī)制。 即探究黃芩素是否能通過介導(dǎo)自噬經(jīng)由miR-449a／HDAC1 軸抑制喉癌細(xì)胞增殖及遷移，為臨床喉癌治療提供充分實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人喉癌細(xì)胞（Hep-2）（貨號(hào)：HTX2247）購(gòu)于深圳豪地華拓生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

黃芩素（C12455217）、6－氨基－3 甲基嘌呤（C12621613）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基（G4510）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；胰酶（＋EDTA）（SH30042.01）購(gòu)自美國(guó)HyClone；胰酶（－EDTA）（0420A21）、RNA TRIzol Reagent（BM1144）購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；胎牛血清（P20522）購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司；MTT（1334GR001）購(gòu)自德國(guó)BioFRoxx；二甲基亞砜（DMSO，A610163） 購(gòu)自美國(guó)Sigma；AnnexinVAPC／PE 凋亡試劑盒（KGF003－20 T）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；micrON hsa-miR-125b-5p mimic（miR10000423－1－5）、micrOFF hsa-miR-125b-5p inhibitor （miR20000423 － 1 － 5）、 Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer（R10031.7）、Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit（R11067.2）購(gòu)買于中國(guó)銳博生物；Beclin-1 抗體（A7353）、HDAC1 抗體（A19571）、 LC3B 抗 體（ A19665）、 P62 抗 體（A11250）、β-actin 抗體（AC026）及生物素化山羊抗兔IgG（ab6721）均購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR）儀（PIKORed 96，美國(guó)ThermoFisher 儀器有限公司）；電泳儀（JY200C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；倒置生物顯微鏡（DMI1，上海徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司）；臺(tái)式低速離心機(jī)（TDZ4-WS，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；流式分析儀（cytoflex，美國(guó)Beckman）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（5200，上海天能科技有限公司）；透射電子顯微鏡（JEM-1400FLASH，日本電子JEOL）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HEP-2 細(xì)胞接種于含有10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，放入37℃，含5% CO2的孵箱培養(yǎng)。 選取狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2 細(xì)胞進(jìn)行傳代，加入胰蛋白酶體積3 倍的新鮮培養(yǎng)基終止消化，消化后的細(xì)胞加入新鮮培養(yǎng)基，以1 ∶3 傳代培養(yǎng)。 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并按要求稀釋細(xì)胞懸液，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，吸取上清液后丟棄并加入1 mL凍存液（55% FBS＋40% FBS＋5% DMSO），混勻后轉(zhuǎn)移至凍存管中密封。

1.3.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2 細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×104／mL，每孔100 μL 接種于96孔板中，37℃、5% CO2條件下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。 待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置組別：正常組、黃芩素組（200 μmol／L）、黃芩素（200 μmol／L）＋3-MA（4 mmol／L）組、3-MA 組（4 mmol／L），加入相對(duì)應(yīng)濃度的藥物。 藥物作用24 h 后，吸棄上清，每孔加入200 μL 終濃度為0.5 mg／mL 的MTT 溶液，37℃、5%CO2恒溫繼續(xù)培養(yǎng)4 h。 使用酶標(biāo)儀在570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值。

1.3.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2 細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105／mL，每孔2 mL 接種于6 孔板中，37℃、5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)。 待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置組別同1.3，培養(yǎng)24 h。 待細(xì)胞長(zhǎng)滿至單層，吸除上清液，移液槍取200 μL 槍頭垂直于背后橫線劃痕。 PBS 輕輕洗滌2 次以去除劃下細(xì)胞，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 在0 h 及24 h 時(shí)間點(diǎn)分別取樣，50 倍鏡下在各水平直線標(biāo)記處跟蹤拍攝細(xì)胞劃痕狀態(tài)。 測(cè)量劃痕距離，計(jì)算0 h 和24 h內(nèi)遷移距離的平均值與標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2 細(xì)胞，每孔2 mL 接種于6 孔板中，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)。 待細(xì)胞貼壁后，按1.3 所述方法設(shè)置組別加入不同濃度藥物培養(yǎng)。根據(jù)閆婷婷［5］的試驗(yàn)方法處理細(xì)胞并獲得細(xì)胞沉淀。 用500 μL 的Binding Buffer 重懸細(xì)胞后，加入5 μL Annexin V APC 輕輕吹勻，再加入5 μL 的PE 混勻；室溫避光反應(yīng)15 min，上機(jī)檢測(cè)分析。

1.3.5 Western blot 實(shí)驗(yàn)

收集黃芩素或3-MA 處理過或經(jīng)miR-449a mimic 轉(zhuǎn)染的喉癌細(xì)胞Hep-2，加入預(yù)冷的RIPA 裂解緩沖液200 μL，碎冰上裂解10 min，收集裂解液，在4℃、12 000 r／min 下離心15 min。 取出上清液，用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。 樣品加載到10%聚丙烯酰胺進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上（PVDF 膜）。 將PVDF 膜放入用TBST Buffer 稀釋的5%脫脂奶粉并在室溫下?lián)u晃并孵化2 h，加入一抗（Beclin-1 1 ∶2000；HDAC1 1 ∶2000；LC3B 1 ∶2000；p62 1 ∶2000；β-actin 1 ∶100 000）。 在4℃下孵育過夜后，TBST 將膜洗滌3次，每次5 min。 然后加入相應(yīng)的二抗（1 ∶5000），在室溫下孵育2 ～3 h，TBST 膜洗3 次共30 min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)顯色。 用Image-J 圖像分析軟件分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，以同一泳道的目標(biāo)蛋白與β-actin 的灰度值比作為測(cè)量結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.3.6 RT-PCR 檢測(cè)

按照試劑盒的說明，分別用TRIzol 試劑提取轉(zhuǎn)染、黃芩素或3-MA 處理后的Hep-2 細(xì)胞的總RNA。取5 μg 的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。 純化的RNA 作為模板，使用試劑盒合成cDNA。 用cDNA、Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green?試劑盒和miR-449a 的基因特異引物進(jìn)行RT-qPCR。 所有引物都是由生工生物技術(shù)（上海）有限公司合成。miR-449a 的 引 物 序 列， 正 向： 5 ’-ACTTTTATTGGTCTCAAGTCAGTGTACAG-3’， 反 向由Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green?Kit 提供。 U6的引物序列由Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green?Kit 提供。 反應(yīng)結(jié)束后，計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析每個(gè)樣品的Ct 值，miR-449a 以U6 為內(nèi)參對(duì)照，通過2－△△Ct計(jì)算相對(duì)mRNA 表達(dá)量。

1.3.7 生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶試驗(yàn)

為了確定miR-449a 與HDAC1 之間的調(diào)節(jié)關(guān)系，本研究使用專門設(shè)計(jì)的熒光素酶載體進(jìn)行了熒光素酶試驗(yàn)。 含有miR-449a 結(jié)合位點(diǎn)的HDAC1 的完整3’UTR 序列被擴(kuò)增并亞克隆到pSI-Check2 載體中，生成HDAC1 的野生型載體（h-HDAC1-3UTRwt）。 設(shè)計(jì)不含有miR-449a 結(jié)合位點(diǎn)的HDAC1 的3’UTR 序列被擴(kuò)增并亞克隆到pSI-Check2 載體中，生成HDAC1 的突變型載體（h-HDAC1-3UTR-mut）。根據(jù)涂友慧［16］的試驗(yàn)方法，準(zhǔn)備好用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和目的質(zhì)粒h-HDAC1-3UTR，將細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分為四組：NC mimics＋h-HDAC1-3UTR-wt、hsa-miR-449a＋h-HDAC1-3UTR-wt、NC mimics ＋h-HDAC1-3-UTR-mu及hsa-miR-449a＋h-HDAC1-3UTR-mu。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。 轉(zhuǎn)染6 h 后換取新鮮培養(yǎng)基，48 h 后收集細(xì)胞，使用Promega Dual-Luciferase system 試劑盒檢測(cè)。

1.3.8 透射電子顯微鏡觀察自噬小體

Hep-2 人喉癌細(xì)胞共分為5 組，包括NC 組、黃芩素組、miR-449a mimic 組、黃芩素＋mimic NC 組及黃芩素＋miR-449a mimic 組。 樣品經(jīng)3%戊二醛預(yù)固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級(jí)脫水，Ep812 包埋，半薄切片用甲苯胺藍(lán)染色作光學(xué)定位，用鉆石刀作超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，切片使用JEM-1400FLASH 透射電鏡觀察，每張銅網(wǎng)先于6000倍下觀察，選擇要觀察的區(qū)域采集圖片，觀察具體病變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃芩素對(duì)喉癌細(xì)胞增殖、遷移的影響

MTT 實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)。 結(jié)果觀察到， 黃芩素組細(xì)胞增殖抑制率為（27.69 ±5.66）%，正常組增值抑制率為（0.00±0.00）%，黃芩素組對(duì)比正常組細(xì)胞增殖抑制率增加極為明顯（P＜0.001）。 僅加入3-MA 處理的細(xì)胞增殖抑制率為（－3.23±4.03）%，低于正常組，即抑制喉癌細(xì)胞自噬后會(huì)誘導(dǎo)增加細(xì)胞的增殖。 同時(shí)加入黃芩素后，黃芩素＋3-MA 組細(xì)胞增殖抑制率為（14.97±4.71）%，相較于3-MA 組細(xì)胞極顯著增加（P＜0.001）。 以上結(jié)果說明黃芩素可以抑制喉癌細(xì)胞增殖，且黃芩素聯(lián)合3-MA 處理喉癌細(xì)胞后可逆轉(zhuǎn)3-MA 抑制自噬引起的細(xì)胞增殖。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)可用來檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力變化。 實(shí)驗(yàn)分別觀察了細(xì)胞在0 h、24 h 的劃痕愈合情況，結(jié)果如圖1A，各組細(xì)胞0～24 h 平均遷移距離如圖1B，其中經(jīng)黃芩素處理后的細(xì)胞遷移距離為（168.91±9.78）μm，極顯著小于正常組遷移距離（284.26±9.66）μm（P＜0.001）。 3-MA 組細(xì)胞遷移距離較大為（279.32±19.390）μm，而黃芩素＋3-MA組細(xì)胞遷移距離顯著小于3-MA 組為（214.18±16.33）μm（P＜0.001）。 以上結(jié)果證明黃芩素可使喉癌細(xì)胞遷移能力減弱，加入細(xì)胞自噬抑制劑3-MA時(shí)同時(shí)加入黃芩素處理可以恢復(fù)細(xì)胞自噬能力，減弱遷移能力。

注：A：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞24 h 內(nèi)遷移情況；B：各組細(xì)胞平均遷移距離。 a：正常組；b：黃芩組；c：黃芩組＋3-MA 組；d：3-MA 組。 與正常組相比，***P＜0.001；與3-MA 組相比， ＃＃＃P＜0.001。圖1 黃芩素抑制喉癌細(xì)胞的遷移Note.A， Wound healing test to observe cell migration within 24h.B， Mean migration distance of cells in each group.a， Control group.b， Baicalein group.c， Baicalein＋3-MA group.d， 3-MA group.Compared with control group， ***P＜0.001.Compared with 3-MA group， ＃＃＃P＜0.001.Figure 1 Baicalein inhibits the migration of laryngeal cancer cells

2.2 黃芩素對(duì)喉癌細(xì)胞凋亡的影響

進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)3-MA 或黃芩素處理后Hep-2 細(xì)胞的凋亡率變化。 在圖2A 的流式細(xì)胞圖中，I 象限呈現(xiàn)晚期凋亡細(xì)胞，IV 象限呈現(xiàn)早期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率即第一象限和第四象限百分率的和。 細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果詳見圖2B。 結(jié)果顯示，與正常組相比，黃芩素處理后的喉癌細(xì)胞Hep-2 在I 和IV 象限出現(xiàn)了晚期凋亡和早期凋亡，凋亡率為（17.93±1.5）%，高于正常組細(xì)胞的凋亡率（3.71±0.36）%（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明黃芩素具有誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞Hep-2 凋亡的作用。 3-MA 組細(xì)胞凋亡率為（3.25±0.15）%，與之相比，黃芩素＋3-MA 組細(xì)胞在I 象限及IV 象限的凋亡率有顯著增加（P＜0.01），為（9.96±0.57）%。 說明加入黃芩素可以逆轉(zhuǎn)3-MA 對(duì)細(xì)胞自噬的抑制作用，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

注：A：細(xì)胞凋亡率（流式細(xì)胞術(shù)）；B：流式細(xì)胞圖。 a：正常組；b：黃芩組；c：黃芩組＋3-MA 組；d：3-MA 組。 與正常組相比， *P＜0.05；與3-MA組相比， ＃＃P＜0.01。圖2 黃芩素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Note.A， Apoptosis rate （flow cytometry）.B， Flow cytogram.a， Control group.b， Baicalein group.c， Baicalein＋3-MA group.d， 3-MA group.Compared with control group， *P＜0.05.Compared with 3-MA group， ＃＃P＜0.01.Figure 2 Baicalein induces apoptosis

2.3 黃芩素對(duì)喉癌細(xì)胞自噬流調(diào)控的影響

為探究黃芩素對(duì)喉癌細(xì)胞自噬的影響，檢測(cè)了各組喉癌細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。 其中，Beclin-1 蛋白是參與自噬的特異性基因之一，在自噬的溶酶體降解途徑中發(fā)揮抑制腫瘤的作用。 LC3是自噬體形成過程中的特異性標(biāo)記蛋白，包括LC3I及LC3II。 LC3II 與LC3I 的比值與自噬體形成的數(shù)量和自噬發(fā)生的程度成正比［17］。 另外，p62 會(huì)通過與LC3 的直接結(jié)合并選擇性地結(jié)合到自噬體中，最終在自噬溶酶體內(nèi)有效降解。 因此，LC3II 升高聯(lián)合p62 降低可以被認(rèn)為是自噬水平提高的指標(biāo)［18］。Western blot 結(jié)果如圖3 所示，黃芩素組細(xì)胞的Beclin-1 蛋白表達(dá)顯著高于正常組（P＜0.01），LC3II／LC3I 比值極顯著高于正常組（P＜0.001），而p62 蛋白表達(dá)水平則顯著低于正常組（P＜0.01）。結(jié)果表明，黃芩素可以調(diào)控喉癌細(xì)胞Hep-2 的自噬相關(guān)基因表達(dá)，誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞自噬。 經(jīng)自噬抑制劑3-MA 處理后的細(xì)胞，自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平變化顯著，但當(dāng)黃芩素與3-MA 聯(lián)合作用于Hep-2細(xì)胞后，其中Beclin-1 蛋白表達(dá)高于3-MA 組（P＜0.05）和正常組，LC3II／LC3I 比值極顯著高于3-MA組（P＜0.001）和正常組，而p62 表達(dá)水平顯著低于3-MA 組（P＜0.01）和正常組，說明黃芩素可以逆轉(zhuǎn)3-MA 的細(xì)胞自噬抑制作用并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

注：A：Hep-2 細(xì)胞中Beclin-1、LC3I、LC3II、p62 蛋白的表達(dá)水平；B：Beclin-1 蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)；C：p62 蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)；D：LC3II／LC3I 蛋白表達(dá)比值大??；a：正常組；b：黃芩組；c：黃芩組＋3-MA 組；d：3-MA 組。 與正常組相比，**P＜0.01， ***P＜0.001；與3-MA 組相比， ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0.001。圖3 黃芩素調(diào)控自噬相關(guān)基因表達(dá)Note.A， Expression levels of Beclin-1， LC3I， LC3II， and p62 proteins in Hep-2 cells.B， Statistical graph of Beclin-1 protein expression in Hep-2 cells.C， Statistical graph of p62 protein expression in Hep-2 cells.D， Size of LC3II／LC3I protein expression ratio in Hep-2 cells.a，Control group.b， Baicalein group.c， Baicalein ＋3-MA group.d， 3-MA group.Compared with control group， **P ＜0.01， ***P ＜0.001.Compared with 3-MA group， ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0.001.Figure 3 Baicalein regulates autophagy-related gene expression

2.4 黃芩素對(duì)喉癌miR-449a／HDAC1 軸的影響

miR-449a 被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制作用［8］，但在喉癌細(xì)胞中的作用尚不清楚。 PCR 結(jié)果如圖4A 所示，黃芩素作用下喉癌細(xì)胞Hep-2 的miR-449a 表達(dá)相比正常組細(xì)胞有一定增加（P＜0.05），自噬抑制劑3-MA 作用下喉癌細(xì)胞Hep-2 的miR-449amRNA 表達(dá)減少，但3-MA 與黃芩素聯(lián)合處理后，miR-449a mRNA 表達(dá)對(duì)比正常組細(xì)胞和3-MA 組細(xì)胞均顯著增加（P＜0.01），說明黃芩素可以上調(diào)miR-449a 表達(dá)，并且可以逆轉(zhuǎn)3-MA 抑制細(xì)胞自噬后引起的miR-449a 表達(dá)下調(diào)。

注：A：miR-449a 表達(dá)水平；B：HDAC1 蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)；C：HDAC1 蛋白表達(dá)結(jié)果。 a：正常組；b：黃芩組；c：黃芩組＋3-MA 組；d：3-MA 組。 與正常組相比， *P＜0.05；與3-MA 組相比， ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。圖4 黃芩素上調(diào)miR-449a 表達(dá)水平和下調(diào)HDACI 蛋白表達(dá)Note.A， miR-449a expression level.B， Statistical plot of HDAC1 protein expression.C， HDAC1 protein expression results.a， Control group.b，Baicalein group.c， Baicalein＋3-MA group.d， 3-MA group.Compared with control group， *P ＜0.05.Compared with 3-MA group， ＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01.Figure 4 Baicalein up-regulates miR-449a expression level and down-regulates HDACI protein expression

HDAC1 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在喉癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)［19］，而Western blot 結(jié)果顯示（圖4B、4C），黃芩素組HDAC1 蛋白表達(dá)量低于正常組（P＜0.05），黃芩素聯(lián)合3-MA 組低于3-MA 組（P＜0.05）。 這說明黃芩素可以下調(diào)喉癌細(xì)胞中HDAC1 表達(dá)。

2.5 miR-449a 與HDAC1 的靶向關(guān)系驗(yàn)證

經(jīng)生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)HDAC1 與miR-449a 的靶位點(diǎn)結(jié)合示意圖如圖5A。 雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果如圖5B，與NC 組相比，hsa-miR-449a 能夠顯著下調(diào)h-HDAC1-3UTR-WT 的熒光素酶的表達(dá)（P＜0.001），說明本實(shí)驗(yàn)中兩者間存在結(jié)合作用。

注：A：生物信息學(xué)分析hsa-miR-449a 與h-HDAC1-3UTR 靶位點(diǎn)結(jié)合示意圖；B：雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)hsa-miR-449a 與h-HDAC1-3UTR相互作用。 與NC minics＋h-HDAC1-3UTR-wt 組相比， ***P＜0.001。圖5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)熒光素酶活性Note.A， Schematic diagram of bioinformatics analysis of hsa-miR-449a binding to h-HDAC1－3UTR target site.B， Results of dual luciferase reporter gene assay for hsa-miR-449a interaction with h-HDAC1-3UTR.Compared with NC minics＋h-HDAC1-3UTR-wt group， ***P＜0.001.Figure 5 Luciferase activity was detected by Dual-luciferase reporter gene assay

2.6 黃芩素抑制喉癌細(xì)胞增殖及遷移的機(jī)制研究

MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力，結(jié)果如圖6A所示，黃芩素組細(xì)胞增殖抑制率相比NC 組顯著增加（P＜0.01），Hep-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-449a mimic 后，細(xì)胞的增殖抑制率極顯著增加（P＜0.001），說明細(xì)胞可以通過黃芩素處理或miR-449a 上調(diào)抑制喉癌細(xì)胞的增殖；黃芩素組與黃芩素＋mimic 組結(jié)果相近，說明mimic NC 對(duì)黃芩素的抑制作用沒有影響；若黃芩素聯(lián)合miR-449a mimic 轉(zhuǎn)染，其增殖抑制率不僅比黃芩素＋mimic NC 組細(xì)胞顯著增加（P＜0.01），同時(shí)比僅轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞極顯著增高（P＜0.001），說明黃芩素聯(lián)合miR-449a mimic 處理細(xì)胞可以更顯著地抑制喉癌細(xì)胞的增殖。

注：A：MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率；B：HDAC1 蛋白表達(dá)情況；C：HDAC1 蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；D：miR-449a 表達(dá)水平；E：透射電鏡（JEM-1400FLASH）觀察細(xì)胞自噬小體。 a： NC 組；b： 黃芩素組c： miR-449a mimic 組；d： 黃芩素＋mimic NC 組；e： 黃芩素＋miR-449a mimic 組。 與NC 組相比， *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001；與miR-449a mimic 組相比，＃＃＃P＜0.001。圖6 黃芩素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，經(jīng)由miR-449a／HDAC1 軸作用喉癌細(xì)胞Note.A， Results of cell proliferation inhibition rate by MTT assay.B， HDAC1 protein expression.C， HDAC1 protein expression statistics.D， miR-449a expression level.E， Results of cellular autophagy vesicles observed by transmission electron microscopy （JEM-1400FLASH）.a， NC group.b，Baicalein group.c， miR-449a mimic group.d， Baicalein＋mimic NC group.e， Baicalein＋miR-449a mimic group.Compared with NC group， *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001.Compared with miR-449a mimic group， ＃＃＃P＜0.001.Figure 6 Baicalein induces autophagy and acts on laryngeal cancer cells via the miR-449a／HDAC1 axis

Western blot 結(jié)果如圖6B、6C，黃芩素聯(lián)合miR-449a mimic 轉(zhuǎn)染時(shí)，喉癌細(xì)胞HDAC1 表達(dá)水平最低，黃芩素組和miR-449a mimic 組均顯著低于NC組（P＜0.01）。 說明細(xì)胞通過黃芩素處理或上調(diào)miR-449a 表達(dá)均可以降低HDAC1 蛋白表達(dá)從而抑制喉癌細(xì)胞。 PCR 結(jié)果如圖6D，黃芩素組相比NC組，細(xì)胞miR-449a 表達(dá)水平有一定升高但不顯著，聯(lián)合miR-449a mimic 轉(zhuǎn)染后則有極顯著增加（P＜0.001）。

為了更直觀地證明黃芩素能夠誘導(dǎo)Hep-2 細(xì)胞的自噬，通過透射電子顯微鏡觀察自噬小體數(shù)量的變化，結(jié)果如圖6E，NC 組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)均勻，經(jīng)黃芩素處理后的Hep-2 細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)囊泡狀雙膜結(jié)構(gòu)，即自噬小體，當(dāng)自噬發(fā)展到后期則形成自噬溶酶體，當(dāng)黃芩素與miR-449a mimic 聯(lián)合作用于細(xì)胞，喉癌細(xì)胞中自噬溶酶體數(shù)量明顯增加，細(xì)胞核開始出現(xiàn)皺縮和裂解，細(xì)胞狀態(tài)變差，更進(jìn)一步證明了黃芩素可以誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞Hep-2 自噬。

3 討論

喉癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其病因主要有吸煙、慢性喉炎及空氣污染等，發(fā)病率極高且容易復(fù)發(fā)，這也是其預(yù)后效果較差的主要原因［20］。 最近幾年來，有關(guān)中藥抗喉癌的研究取得一定進(jìn)展。 郭俊宇等［21］研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B 能夠抑制喉癌細(xì)胞Hep-2 增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；周華群等［22］研究發(fā)現(xiàn)姜黃素與白藜蘆醇聯(lián)合處理會(huì)抑制Hep-2細(xì)胞集落的形成并促進(jìn)凋亡。 實(shí)驗(yàn)前期通過MTT實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，證明了黃芩素對(duì)Hep-2 細(xì)胞增殖及遷移的抑制作用。

細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡的一種表現(xiàn)形態(tài)，主要負(fù)責(zé)移除機(jī)體多余的以及受損的細(xì)胞［23］。 癌細(xì)胞的凋亡在癌癥的惡性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用［24］。 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可用于治療癌癥［25］，但由于凋亡的誘發(fā)和調(diào)節(jié)機(jī)制不同，各種腫瘤藥物誘發(fā)細(xì)胞凋亡的機(jī)制也不同。 有許多天然化合物被證明可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中被阻斷的細(xì)胞凋亡通路［26］，其中包括黃酮類化合物。 本研究通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，黃芩素可以誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞Hep-2 的凋亡。 并且，黃芩素與3-MA 共同作用于細(xì)胞時(shí)，可以逆轉(zhuǎn)由3-MA 抑制自噬引起的凋亡抑制作用。

細(xì)胞自噬是一種高度保守的自我降解過程，在細(xì)胞應(yīng)激中起關(guān)鍵作用，自噬可以調(diào)節(jié)腫瘤的形成、增殖、轉(zhuǎn)移及能量代謝等［27］。 凋亡與自噬之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激條件下，自噬被誘導(dǎo)發(fā)生，細(xì)胞凋亡被激活，兩者之間可以互相轉(zhuǎn)換［28］。 自噬和凋亡過程中涉及到的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白具有雙重調(diào)節(jié)作用。 例如，Beclin-1 作為自噬過程中的調(diào)節(jié)蛋白，同時(shí)可以調(diào)控凋亡過程。

Beclin-1 是III 類PI3K 復(fù)合物的亞基，其與自噬前體的結(jié)合啟動(dòng)自噬體的形成，該蛋白是自噬體形成所必需［29］。 LC3I 會(huì)在自噬形成時(shí)被酶解，使其與磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3II，因此檢測(cè)LC3II 與LC3I 的比值可用來評(píng)估自噬水平的高低［30］。 p62 是一種泛素結(jié)合蛋白，參與多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控及自噬調(diào)控，p62 表達(dá)水平高低與自噬負(fù)相關(guān)［31］。 為進(jìn)一步確定黃芩素對(duì)喉癌細(xì)胞自噬的影響，通過Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)以上四種自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)的水平。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩素在作用于Hep-2 細(xì)胞時(shí)，同樣可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬現(xiàn)象。 并且實(shí)驗(yàn)通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-449a 表達(dá)與黃芩素處理均可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬增加細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量。

大量實(shí)驗(yàn)證明，miRNA 可以通過多個(gè)相關(guān)基因調(diào)控喉癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移［32］，雖然黃芩素對(duì)喉癌細(xì)胞的作用研究較多，但黃芩素調(diào)控miRNAs 在喉癌中扮演何種的角色，這方面的研究仍然未見報(bào)道。miRNA 可以通過多種細(xì)胞調(diào)節(jié)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡［33］，其中miR-499a 是miR-499 家族中最常見的亞型，可以調(diào)節(jié)多種癌癥中的細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及細(xì)胞侵襲［34－35］。 miR-449a 下調(diào)會(huì)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲［36］，抑制NCCLC（非小細(xì)胞肺癌）細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［37］，且miR-449a 在喉癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)［38］。 本研究通過PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)確定，黃芩素可以上調(diào)喉癌細(xì)胞miR-449a的表達(dá)水平，從而達(dá)到抑制喉癌細(xì)胞增殖等作用。

miR-449 作用機(jī)制包括三種，最常見的途徑即通過下調(diào)組蛋白去乙?；福℉DAC1）和沉默調(diào)節(jié)蛋白1（SIRT1），誘導(dǎo)腫瘤蛋白p53 依賴性細(xì)胞凋亡。 有研究發(fā)現(xiàn)HDAC1 促進(jìn)了喉癌的形成和發(fā)展［39］，但HDAC1 在喉癌細(xì)胞增殖和遷移中的作用尚不明確。 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析推測(cè)miR-449a 與HDAC1 靶向結(jié)合參與了喉癌的發(fā)生發(fā)展，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)鑒定驗(yàn)證，hsa-miR-449a 能夠顯著下調(diào)h-HDAC1-3UTR-WT 的熒光素酶的表達(dá)，兩者間的確存在結(jié)合作用。 接著通過Western blot 和PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黃芩素處理或上調(diào)miR-449a 均可以下調(diào)HDAC1 在喉癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，說明黃芩素作用下過表達(dá)的miR-449a抑制了HDAC1 的表達(dá)，與軟件預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

綜上所述，黃芩素可以介導(dǎo)喉癌細(xì)胞Hep-2 自噬，通過上調(diào)miR-449a 表達(dá)達(dá)到下調(diào)HDAC1 表達(dá)的作用，進(jìn)而抑制喉癌細(xì)胞的增殖及遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 中藥單體可以通過調(diào)控多條信號(hào)通路來影響喉癌的發(fā)展，但對(duì)于這些通路如何相互影響的研究不多，本研究結(jié)果證明miR-449a 與HDAC1在喉癌細(xì)胞發(fā)展中的結(jié)合作用，可對(duì)黃芩素成為臨床潛在的新的化療藥物，從而輔助治療喉癌提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，黃芩素對(duì)于喉癌細(xì)胞的作用還需要更加深入研究分子機(jī)制，為后期臨床試驗(yàn)補(bǔ)充依據(jù)。